一株地芽孢桿菌及其應用的制作方法

本發明涉及微生物技術領域，特別是一種地芽孢桿菌(Geobacillus sp.)JAAS-YTC01及其在降解羽毛中的應用。

背景技術：

角蛋白來源于外胚層細胞，是一類不溶于水、稀酸或稀堿溶液、機械強度很高、化學性質穩定旳硬質蛋白，廣泛存在于發、毛、鱗、羽、甲、蹄、角、爪、喙、絲及其他表皮結構中。我國每年的羽毛總量超過100萬噸，而且隨著集約化養殖的快速發展，產量逐年增加。羽毛中高達90％的成分是角蛋白。羽毛營養成分分析表明，氨基酸含量在70％以上，是潛在的優良蛋白質資源。但是角蛋白結構中的二硫鍵使其具有抗降解性，不為多數蛋白酶如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶等降解。另一方面每年世界范圍內幾百萬噸的廢棄羽毛可導致環境污染的危害，蛋白質資源也存在浪費問題，特別是我國蛋白資源不足，對其加工利用更有實際意義。

由于角蛋白多肽鏈間二硫鍵，鹽鍵，氫鍵的廣泛存在，使角蛋白的結構非常穩定，不溶于水，常用的蛋白酶，如胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，胃蛋白酶，都很難降解角蛋白。傳統的降解方法為高壓蒸汽和酸堿蒸煮法，高壓處理對角蛋白的降解程度有限，還會破壞一些具有營養價值的氨基酸，如賴氨酸，蛋氨酸和色氨酸，并產生一些動物不需要的氨基酸，如硫化雙丙氨酸；酸堿蒸煮法同樣會破壞掉一些具有營養價的氨基酸，并且水解過程中產生的廢水還會對環境造成污染。利用角蛋白酶降解羽毛角蛋白能有效解決上述問題，然而目前市面上還沒有大量商業角蛋白酶出售。

目前已分離到能降解角蛋白的微生物有30余種，分別屬于細菌、放線菌和真菌屬。但已知的產角蛋白酶的微生物大多屬于常溫菌，酶反應溫度一般在40-60℃之間，產生的角蛋白酶存在熱穩定性差等缺點，且大多數微生物不能夠直接利用未經處理的羽毛。如何周鳳(“高效羽毛降解菌株的鑒定及發酵條件的優化”，何周鳳等，基因組學與應用生物學，2015年)等對產角蛋白酶的枯草芽孢桿菌產酶條件優化之后，酶活力為23.6U/ml,最適酶反應的溫度為37℃；地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis BBE11-1)(“地衣芽胞桿菌來源角蛋白酶N端對活力及其熱穩定性的影響”，劉伯宏等，微生物學通報，2014)的蛋白酶改造前60℃半衰期為9min，劉伯宏等人通過角蛋白酶N端前5個氨基酸進行分段缺失，并通過序列比對將N端的前5個氨基酸替換為來源于Thermoactinomyces vulgaris的嗜熱蛋白酶的N端，將野生型和突變體角蛋白酶基因在枯草芽孢桿菌WB600中進行表達，60℃半衰期提高到20min,但是酶活降低了70％。嗜熱細菌在高溫條件下表現出獨特的生存適應能力和特殊的代謝產物，其產生的酶在高溫條件下具有很高的活性和熱穩定性，且不易污染，同時熱穩定性較好的酶可以在相對較高的溫度下進行反應，有利于提高酶的反應速率、減少其他微生物的污染以及促進酶分子充分滲透到底物中進行反應。

技術實現要素：

針對上述問題，本發明由高溫菌出發，篩選到一株能產高溫角蛋白酶的地芽孢桿菌，能夠在60℃下48小時候完全降解羽毛，該菌產生的角蛋白酶同時具有良好的熱穩定性，本發明是這樣實現的：

一株地芽孢桿菌(Geobacillus sp)JAAS-YTC01，其保藏編號為CGMCCNO.12740，保藏日期為2016年7月6日；該地芽孢桿菌菌體呈桿狀，長2-3μm，革蘭氏染色呈陽性，菌落大小中等，表面濕潤，邊緣整齊；該菌16S rRNA如SEQ ID NO.1所示。

一種保藏編號為CGMCCNO.12740的地芽孢桿菌在制備角蛋白酶液中的應用，具體步驟如下：將所述地芽孢桿菌按質量體積比2％接種于發酵培養基中，于60℃，180rpm攪拌培養24-72h后，過濾或離心，所得濾液或上清液即為角蛋白酶液；

所述發酵培養基配方為：每1000mL發酵培養基中，含蔗糖10g、硫酸銨4g、羽毛10g、NaCl0.5g、K₂HPO₄ 0.4g、KH₂PO₄ 0.3g、MgCl₂·6H₂O 0.1g、pH7.2-7.4。

一種保藏編號為CGMCCNO.12740的地芽孢桿菌產角蛋白酶在降解角蛋白中的應用，具體方法如下：

將所述地芽孢桿菌按質量體積比2％(W/V，g/l)接種于發酵培養基中，調整pH＝8.5,于70℃培養24-72h，即可降解角蛋白；

所述發酵培養基配方為：每1000mL發酵培養基中，含蔗糖10g、硫酸銨4g、羽毛10g、NaCl0.5g、K₂HPO4 0.4g、KH₂PO₄ 0.3g、MgCl₂·6H₂O 0.1g、pH7.2-7.4。

優選的，所述保藏編號為CGMCCNO.12740的地芽孢桿菌在降解角蛋白中的應用，所述角蛋白是指雞的羽毛，所述發酵培養基中的羽毛為雞的羽毛。

本發明中，將以角蛋白為底物，每1min催化分解角蛋白生成1μg酪氨酸所需要的酶量定義為一個酶活單位。

酶活檢測方法為取稀釋5-10倍的粗酶液1ml，加入1ml 1％的角蛋白，在60℃下進行酶反應15min后加入2ml 0.4M的TCA終止酶活，4000rpm離心10min。以先加入2ml 0.4M TCA再加入1％底物作為空白對照。取1ml上清液，加入5ml 0.4M的Na₂CO₃溶液，再加入1ml福林酚試劑，40℃，保溫20min，測定660nm的吸光度。

本發明中，將保藏編號為CGMCCNO.12740的地芽孢桿菌JAAS-YTC01接種于發酵培養基中，接種量2％，(W/V，g/l)，60℃，150-200rpm攪拌培養48小時后，發酵瓶中整根羽毛被降解，終止發酵，過濾離心，得到角蛋白酶液，測的角蛋白最高酶活為10.4U/ml。

本發明所提供的保藏號為CGMCCNO.12740的地芽孢桿菌JAAS-YTC01，該菌產生的角蛋白酶最適酶反應溫度為70℃，最適pH為8.5，酶液在60℃中保溫1h，酶活仍能達到初始酶活的86.7％，與現有菌種相比，具有較高的熱穩定性；該菌株可直接降解未經任何處理的羽毛廢棄物，降解速度快，所產生的角蛋白酶具有耐高溫和熱穩定性好的特點，適于大規模推廣應用。

附圖說明

圖1為地芽孢桿菌JAAs-YTC01菌落形態示意圖。

圖2為地芽孢桿菌JAAs-YTC01革蘭氏染色結果示意圖。

圖3為地芽孢桿菌JAAs-YTC01菌體電鏡圖。

圖4為地芽孢桿菌JAAs-YTC01角蛋白酶最適反應溫度柱形示意圖。

圖5為地芽孢桿菌JAAs-YTC01熱穩定性曲線圖。

圖6為地芽孢桿菌JAAs-YTC01角蛋白酶最適反應pH曲線圖。

圖7為地芽孢桿菌JAAs-YTC01發酵培養48h對羽毛的降解效果示意圖。

具體實施方式

以下通過具體實施例對本發明的技術方案進一步進行說明。

實施例中所涉及的培養基：

富集培養基(1000ml)即牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g，加水定容至1000mL,pH自然；

分離培養基(1000ml)：將4g干酪素溶解于20mL 0.1mol/L NaOH溶液中，再加入20g瓊脂，再加水定容至1000mL；

篩選培養基(1000ml)：羽毛10g、NaCl 0.5g、K₂HPO₄ 0.4g、KH₂PO₄ 0.3g、MgCl₂·6H₂O 0.1g、酵母粉0.1g，加入定容至1000mL，pH7.2-7.4；

種子培養基(1000ml)：NaCl 5g、牛肉膏5g、蛋白胨10g、酵母粉2g,余量為水，pH7.2-7.4；斜面培養基(1000ml)：NaCl 5g、牛肉膏5g、蛋白胨10g、酵母粉2g，余量為水，pH7.2-7.4；發酵基礎培養基(1000ml)：羽毛10g、NaCl 0.5g、K₂HPO₄ 0.4g、KH₂PO₄ 0.3g、MgCl₂·6H₂O 0.1g、pH7.2-7.4；裝液量50ml/250ml，60℃，180rpm搖瓶發酵48h；

發酵培養基(1000ml)：蔗糖10g、(NH₄)₂SO₄ 4g、羽毛10g，MgCl₂·6H₂O 0.1g，NaCl 0.5g,K₂HPO₄，0.3g KH₂PO₄ 0.4g,pH7.2-7.4，裝液量50ml/250ml。

上述培養基中羽毛為雞毛(南京雞屠宰市場收集)。

實施例中所涉及的核苷酸序列：

SEQ ID NO.1：

SEQ ID NO.2(27F)：agagtttgat cctggctcag；

SEQ ID NO.3(492R)：ggttaccttg ttacgactt；

實施例1菌株選育

1、篩選菌種

從畜禽糞便的高溫堆肥(南京寧糧有機肥廠)取樣，首先從每份樣品中取一定樣品，用無菌生理鹽水將樣品打散；梯度稀釋后，接種到富集培養基中60-80℃富集繼代培養2-3天；平板劃線分離，獲取高溫菌，將高溫菌點種到分離培養基平板上，篩選有透明水解圈的菌株，進而將這些菌株接種到篩選培養基中，觀察羽毛降解情況，最后篩選出一株有降解羽毛能力的菌株，將該菌株接種到斜面固體培養基中待用。

2、菌種鑒定

A)將步驟1篩選到的菌株在牛肉膏蛋白胨培養基上劃線，60℃培養24h，獲得單菌落(如圖1所示)，菌落大小中等，表面濕潤，邊緣整齊；

對該菌進行革蘭氏染色，發現呈陽性(如圖2所示)；液體培養后收集菌體，戊二醛法固定后，電鏡觀察菌體形態，并拍攝照片如圖3所示，觀測該菌體呈桿狀，菌體長度為2-3μm，；利用細菌基因組DNA試劑盒(Omega公司)提取該菌株基因組DNA作為模板，以27F和1492R分別作為上下游引物，進行16S rRNA基因擴增：

PCR反應體系：Premix Taq(Takara)25μl，模板0.1-2μg，上游引物10-100pmol，下游引物10-100pmol，雙蒸水補足至50μl；

PCR反應程序：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共30個循環；72℃延伸5min。

16S rRNA擴增產物交由上海生工生物工程有限公司測序，測序結果如SEQ ID NO.1所示，將測序結果在NCBI數據庫進行比對，并對其進行分子進化系統發育樹分析，鑒定其為地芽孢桿菌屬(Geobacillus sp)，申請人將其自命名為JAAS-YTC01,于2016年7月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所；郵編100101，保藏編號為：CGMCC NO.12740。

實施例2菌株JAAS-YTC01發酵產酶條件優化

采用單因素試驗考察添加不同的碳源(1％)(W/V，g/l)和不同氮源以及不同濃度羽毛的添加量對實施例1獲得的菌株JAAS-YTC01角蛋白酶產量影響。

a最適碳源的篩選

在發酵基礎培養基中，分別加入1％(W/V，g/l)的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、麩皮、玉米粉，于60℃，180rpm搖瓶發酵48h后測定酶活。結果表明加入蔗糖能夠增加角蛋白酶產量。

b最適氮源的篩選

在發酵基礎培養基中，分別加入1％(W/V)的酵母粉、豆粕，0.4％(W/V)的脲素、硫酸銨，于60℃，180rpm搖瓶發酵48h后測定酶活。結果表明加入硫酸銨能夠增加角蛋白酶產量。

c最適羽毛濃度的確定

在發酵基礎培養基中，加入以上篩選出的碳源和氮源，設定羽毛的濃度1％(W/V)、2.5％、5％、10％、20％。、60℃，180rpm搖瓶發酵48h后測定酶活。結果表明最適合的羽毛濃度為10％。

最終確定優化后的發酵培養基為：蔗糖10g、硫酸銨4g、羽毛10g、NaCl 0.5g、K₂HPO4 0.4g、KH₂PO₄ 0.3g、MgCl 6H₂O 0.1g、pH7.2-7.4；裝液量50ml/250ml，此條件下產生的角蛋白酶活為12.3U/ml。

實施例3菌株JAAS-YTC01角蛋白酶的最適反應溫度、最適pH及熱穩定性

將實施例1篩選到的菌株JAAS-YTC01以2％(W/V，g/l)的接種量接種到發酵培養基中，180rpm攪拌培養48h后，8000rpm離心10min，所得上清液即為角蛋白酶液。

取稀釋5-10倍的角蛋白酶液1ml，加入1ml 1％的角蛋白，在60℃下進行酶反應15min后加入2ml 0.4M的TCA終止酶活，4000rpm離心10min。以先加入2ml 0.4M TCA再加入1％底物作為空白對照。取1ml上清液，加入5ml 0.4M的Na₂CO₃溶液，再加入1ml福林酚試劑，40℃，保溫20min，測定660nm的吸光度。

以角蛋白為底物，每1min催化分解角蛋白生成1μg酪氨酸所需要的酶量定義為一個酶活單位。

1、最適酶反應溫度和熱穩定性

在相同p H值的條件下，測定50-80℃溫度范圍內的酶活，以酶活最高值為100％來計算相對酶活。檢測結果如圖4所示，最適酶反應溫度為70℃。

將酶液在不同溫度條件下保持20min、40min、60min、80min，測定殘留酶的活性，以最高酶活為100％來評價酶的熱穩定性。結果見圖5所示，最適酶反應溫度70℃，該酶50，60℃相對穩定，60℃下保持60min，酶活還能保留86.8％，說明該酶的熱穩定性好。

2、最適酶反應pH

在相同溫度的條件下，測定酶液在濃度為50mmol·l^-1的不同pH緩沖體系:磷酸緩沖液(pH7.0-7.5),Tris-Cl緩沖液(pH7.5-9.0)，甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH9.0-10.5)下的酶活，以酶活最高值為100％來計算相對活性，確定角蛋白酶的最適pH值。結果見圖6所示，最適酶反應pH為8.5，屬于堿性角蛋白酶。

實施例4羽毛降解實驗

本實施例中的羽毛為雞毛。

將實施例1獲得菌株JAAS-YTC01以2％的接種量接入發酵培養基中(裝液量50ml/250ml)，70℃，pH＝8.5的條件下培養24-72h，發酵觀察羽毛降解現象。

結果如圖7所示，發酵前如圖7A，發酵12h左右時，羽毛主梗上的細小毛絨脫落，培養基漸漸渾濁；發酵進行到40h時，培養基渾濁，不透光，羽毛大部分被降解，僅余部分主梗；48h后，培養基中羽毛主梗也被降解(圖7B)。

發酵48h后培養基過濾液中17種游離氨基酸和總氨基酸含量增加，具體結果見表1：

表1發酵前后培養基中游離氨基酸含量

本發明具體應用途徑很多，以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以作出若干改進，這些改進也應視為本發明的保護范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 江蘇省農業科學院

<120> 一株地芽孢桿菌及其應用

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1519

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60

ggactggatt ggagcttgct ctgattcggt cagcggcgga cgggtgagta acacgtgggc 120

aacctgcccg caagaccggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg ataacaccga 180

agaccgcatg gtctttggtt gaaaggcggc ctttggctgt cacttgcgga tgggcccgcg 240

gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg acgatgcgta gccggcctga 300

gagggtgacc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt 360

agggaatctt ccgcaatggg cgaaagcctg acggagcgac gccgcgtgag cgaagaaggc 420

cttcgggtcg taaagctctg ttgtgaggga cgaaggagcg ccgttcgaag agggcggcgc 480

ggtgacggta cctcacgagg aagccccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 540

tagggggcga gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggcg gttccttaag 600

tctgatgtga aagcccacgg ctcaaccgtg gagggtcatt ggaaactggg ggacttgagt 660

gcaggagagg agagcggaat tccacgtgta gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac 720

accagtggcg aaggcggctc tctggcctgc aactgacgct gaggcgcgaa agcgtgggga 780

gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttaga 840

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ttgggcgttc ccccttcggg gggacagggt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg 1080

tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgcctct agttgccagc 1140

attcggttgg gcactctaga gggactgccg gcgacaagtc ggaggaaggt ggggatgacg 1200

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

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