一種檢測人β-珠蛋白基因突變的方法

專利名稱：一種檢測人β-珠蛋白基因突變的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測人β-珠蛋白基因突變的方法，尤其涉及一種改良分子信標 熔解曲線檢測β-珠蛋白基因突變的方法。
背景技術：
β-地中海貧血(β-thalassemia)是人類中最常見的單基因隱性遺傳病之一，其 病因是β-珠蛋白基因突變導致β-珠蛋白肽鏈合成減少(β+)或完全缺失(β°)，因而過 剩的α-珠蛋白肽鏈與紅細胞膜結合最終引起溶血性貧血。該病在世界范圍內均有報道， 在熱帶和亞熱帶的一些國家和地區廣泛流行，而我國長江以南大部分省區(包括臺灣、香 港和澳門)均為該病的高發區。患β -地中海貧血的兒童通常在出生時是健康的，但在6個月至2歲期間逐漸發 病，如不予以診斷和治療，大多數在生命的最初幾年內死于貧血或者感染。由于目前尚缺乏 有效根治β-地中海貧血的方法，重型β-地中海貧血患者必須不斷依靠輸血維持生命，但 由于多年多次輸血，各種器官的鐵蓄積過多，為了避免在青春期死亡，必須定期皮下輸注除 鐵劑。昂貴的治療費用不僅給家庭帶來巨大的精神和經濟負擔，也給社會帶來沉重壓力和 負擔。因此，對雙親進行攜帶者篩查，對高危胎兒進行產前基因診斷，防止重型地中海 貧血患兒出生，是降低β-地中海貧血發生率的主要手段。β-珠蛋白基因迄今已發現200多種突變可以導致β-地中海貧血，除了少數 為缺失型和插入突變，大多數為點突變。研究資料表明，導致中國人地中海貧血發生 的突變已發現有 30 多種，其中突變 CDs41/42(-TCTT)、IVS_2_654(C > Τ)、CD17(A > Τ)、 ⑶71/72 (+Α)和-28(A>G)占中國人β -珠蛋白基因突變總數的90%以上。目前報道的檢測β -珠蛋白基因突變的方法可以概括為兩種，即固相檢測方法和 均相檢測方法。固相檢測方法多是在對基因進行擴增后，通過對產物進行分離分析來實現， 比如通過探針雜交方法、多種電泳分析方法、變性高效液相色譜法、限制酶切片段分析法， 以及液態芯片技術、基因芯片等，但是固相檢測方法都需要基因擴增后處理步驟，操作繁 瑣，檢測時間長，臨床應用上受到很大限制。均相檢測方法則是在基因擴增后不需要分離而直接分析的方法，比如實時聚合酶 鏈式反應(Real-time PCR，簡稱實時PCR)就是擴增與檢測同步進行，通過檢測擴增循環中 熒光信號的變化以指示擴增過程。均相檢測方法具有快速、簡便、重現性好、無需PCR后處 理等突出優點，目前已經廣泛用于定性和定量分析，包括病原微生物或病毒的檢測、基因表 達分析、轉基因動植物轉基因拷貝數的檢測和基因分型研究。目前，均相檢測珠蛋白基因突變的方法已有報道，但由于珠蛋白基因基 因突變類型多，分布廣，因此現有的方法多數只檢測少數幾個常見突變，而且多采用數個 反應管，檢測通量低。比如，目前的實時PCR用于β-珠蛋白基因突變檢測主要是通過設 計基因型特異的引物或探針(Chiu Rff et al, Lancet, 2002, 360 998-1000 ；Cheng J, et al，Nucleic Acids Res，2004，32 :e61)或通過熒光能量共振轉移探針(FRET探針，又稱LightCycler 探針、相鄰探針)的熔解曲線分析(Herrmann MG, et al, Clin Chem, 2000, 46 425-428 ；Moreno I,et al,Br J Haematol,2002,119 554-557 ；Vrettou C，et al，Clin Chem，2003，49 :769-776 ;Naja RP, et al, Am J Hematol, 2004, 75 220~224 ；Vrettou C, et al, Hum Mutat, 2004, 23 513-521)來實現。通過基因型特異的引物或探針的方式檢測 β-珠蛋白基因突變，由于受技術本身的限制，單管中只能實現一種或兩種突變的檢測，對 一些常見突變的檢測往往需要分成多個管才能完成，這使得檢測體系變的比較復雜，通量 較小，限制了其在臨床上的應用。FRET探針由兩條與模板互補、且相鄰的特異探針組成，其 中的一條為錨定探針，另一條為檢測探針，兩條探針用不同的熒光成分標記。利用FRET探 針的熔解曲線分析進行珠蛋白基因突變檢測，根據探針熔點的變化情況，可以實現對 檢測探針覆蓋區域的不同突變的檢測。但由于FRET探針采用的是熒光能量共轉移的方式， 需要合適的波長組合的熒光供體和受體才能進行熒光能量共轉移，而目前能進行有效熒光 能量共轉移的熒光供體和受體組合較有限，并需要專用的的儀器才能檢測，這給單管進行 多通道熒光的檢測帶來了困難，單管能夠同時檢測的突變數量較為有限，限制其臨床應用。^ ψ ff f示(molecy Lar beacon) ^ 1996 $ Tyagi 等(Tyagi S, et al, Nat Biotechnol，1996，14(3) 303-308 ；美國專利，US 5，925，517)提出來的一種具有頸環結構 的熒光探針。改良分子信標是在分子信標的基礎上提出來的，其特點是分子信標與靶序列 互補的部分延伸到分子信標的臂，而傳統的分子信標的臂是無關添加序列。與傳統的分子 信標相比，改良分子信標具有雜交效率較高、特異性較低等特點。目前分子信標用于基因分 型或突變檢測是通過分別設計針對野生型和突變型的探針，利用探針良好的特異性進行基 因型的判斷，這種一對一的檢測模式，由于受到儀器通道的限制，使得分子信標單管能夠檢 測的突變的數量有限。

發明內容
本發明的目的是為了克服現有技術操作繁瑣、耗時長、通量低，以及難以同時檢測 多個珠蛋白基因突變等缺點，提供一種檢測人珠蛋白基因突變的方法。本發明包括以下步驟1)在β-珠蛋白基因需要檢測突變的區域設計并制備相應的改良分子信標；2)在設計好的改良分子信標的外圍設計一條上游引物和下游引物，用該上游引物 和下游引物對PCR擴增含有待檢測區域的片段；3)PCR擴增結束后進行熔解曲線分析，根據改良分子信標的熔點的變化來判斷待 檢測核酸序列是否具有基因突變以及可能的突變類型。在步驟2)中，所述PCR擴增的單重單色反應體系為
IX PCR緩沖液；
MgCl21 IOmM ；
dNTP 各0. 05 1. 5mM ；
上游引物0. 05 2μΜ ；
下游引物0. 05 2μΜ ；
探針0. 05 0. 5 μ M ；
Taq酶0. 1 - 5U ；
模板1 20 μ L ；總體積10 100 μ L。在步驟2)中，所述PCR擴增的多重多色反應體系為IX PCR 緩沖液；MgCl21 IOmM ；dNTP 各0. 05 1. 5mM
各上游引物0. 05 2μΜ ；
各下游引物0. 05 2μΜ ；
各探針0. 05~ 0. 5 μ M
Taq酶0. 1 - 5U ；
模板1 20 μ L ；
總體積10 100 μ L0在步驟2)中，所述PCR擴增的PCR反應條件是90 100°C預變性3 10min，40 60個循環中90 95°C變性10 60s，45 60°C退火10 60s，70 78°C延伸15 120s。在步驟3)中，所述PCR擴增結束后進行熔解曲線分析的條件為90 95°C變性1 10min，4 40°C低溫保溫1 20min，隨后按0. 3 1°C /step的升溫速率從20 40°C遞 增至80 90°C進行熔解曲線分析，并在熒光PCR儀上采集與探針顏色標記相應通道的熒光 數據。所述β-珠蛋白基因突變指β-珠蛋白基因序列的改變，可以是單個堿基的改變， 也可以是兩個或兩個以上的堿基的改變，包括堿基的轉換、顛換、插入和缺失。所述β-珠蛋白基因突變可以集中在單個探針可以覆蓋的區域，也可以是距離比 較遠的區域。所述改良分子信標是一種具有頸環結構的熒光探針，長度一般為15 40個堿基， 除環上的序列與靶互補外，臂上也有部分堿基與靶互補。所述改良分子信標一般由普通堿基組成，但是其中也可以包含特殊修飾的堿基。 這些特殊修飾的堿基可以幫助調節探針的結合能力，增加熔解曲線分析的靈活性。例如使 用能夠增強探針結合能力的特殊修飾堿基如鎖定核酸(LNA)，或使用能夠削弱結合能力的 通用堿基I等。所述改良分子信標可以通過熔點的變化來區分野生型的靶序列和突變型的靶序 列，探針可以設計成與野生型靶序列完全互補，也可以設計成變異靶序列完全互補。同時為 達到上述目的，在探針序列中也可以引入個別錯配堿基。 所述改良分子信標的熔點指改良分子信標與靶雜交形成的雙鏈結構的熔點。所述改良分子信標在5'末端標記熒光基團(或淬滅基團)，3'末端標記淬滅基 團(或熒光基團)。在沒有與靶序列雜交時，改良分子信標自身形成頸環結構，使得熒光基 團和淬滅基團互相靠近，熒光基團發出的熒光被淬滅基團吸收，因而探針本身的熒光很弱； 與靶序列雜交時，改良分子信標與靶形成雙鏈結構，使熒光基團和淬滅基團被分離，熒光基 團發出的熒光不能被淬滅基團吸收，因而雜交后探針發出很強的熒光。所述熒光基團包括目前各種常用的熒光標記物，但不限于這些熒光標記物，如 ALEX-350, FAM, VIC, ΤΕΤ, CAL Fluor Gold 540，JOE, HEX, CAL Fluor Orange 560，TAMRA,CAL Fluor Red 590，ROX, CAL Fluor Red 610，TEXAS RED, CAL Fluor Red 635，Quasar 670，CY3, CY5, CY5. 5，Quasar 705 等。所述淬滅基團包括目前各種常用的各種淬滅劑，但不限于這些淬滅劑，如DABCYL、 BHQ-U BHQ-2, ECLIPE 等。所述改良分子信標在一個檢測體系中的數目可以是單個也可以多個。在使用多個 改良分子信標時，可以使用不同的熒光標記基團實現彼此區分，也可以使用相同的熒光標 記基團，利用其與靶序列雜交后的熔點差異實現彼此區分。本發明的基本原理如下改良分子信標是在分子信標的基礎上提出來的，其特點是分子信標與靶序列互補 的部分延伸到分子信標的臂，因此改良分子信標更容易與靶序列雜交，并且對靶的特異性 要求降低，即使靶序列有部分與探針不是互補，探針也能夠雜交。當沒有靶序列存在時，在整個熔解曲線過程中，低溫時改良分子信標自身形成頸 環結構，使得熒光基團和淬滅基團互相靠近，熒光基團發出的熒光被淬滅基團吸收，此時只 能檢測到微弱的熒光信號；隨著溫度的升高，改良分子信標的頸環結構逐漸打開，熒光基團 和淬滅基團距離變大，熒光逐漸增強；高溫時改良分子信標改良分子信標的頸環結構完全 打開，探針此時處于自由卷曲狀態。因此，沒有靶序列存在時，在低溫到高溫的熔解曲線過 程中，改良分子信標自身的頸環結構逐漸打開，檢測到的熒光也逐漸增強，如圖1的曲線7 所示。當有互補的靶序列存在時，在整個熔解曲線過程中，低溫時改良分子信標與靶序 列雜交，形成剛性而穩定的雙鏈結構，熒光基團和淬滅基團的距離很遠，熒光基團發出的熒 光不會被淬滅基團吸收，因而可以檢測到很強的熒光信號；隨著溫度的升高，雙鏈雜交體逐 漸解鏈，達到熔點時，熒光迅速下降，熒光變化最強的點對應的溫度即時探針與靶序列形成 的雙鏈結構的熔點(Tm)。改良分子信標與不同的靶序列雜交形成的雙鏈結構穩定性不同， 因而具有不同的熔點，從熔點的差異就可以判斷靶序列的差異。如圖1所示，當加入具有不 同突變的靶序列時，改良分子信標具有不同的熔點。因此，用改良分子信標熔解曲線可以用于基因突變的檢測，當檢測未知基因型的 標本時，若探針熔點與檢測野生型標本時探針的熔點一致，則可以判斷標本時野生型的，若 熔點有變化，則判斷未知標本可能有突變。改良分子信標可以用于探針覆蓋區域的不同的 突變的檢測。本發明通過PCR擴增之后的熔解曲線分析來實現，熔解曲線分析及其技術方案是 通過在待檢測突變的區域設計并制備相應的改良分子信標，通過擴增反應完成后的改良分 子信標熔解曲線分析，根據改良分子信標熔點的變化情況，判斷探針覆蓋區域珠蛋白 基因是否具有突變。本發明僅使用一條熒光探針就能夠同時檢測珠蛋白基因相鄰區域的多個突 變的方法，本發明能夠同時檢測多個不同區域的珠蛋白基因突變方法，其技術方案一 是針對每個區域分別設計并制備相應的改良分子信標，并對每條改良分子信標標記不同的 熒光基團，通過擴增反應完成后的改良分子信標熔解曲線分析，根據各個改良分子信標熔 點的變化情況，判斷對應的區域是否基因突變；二是針對每個區域分別設計并制備相應的 改良分子信標，并對每條改良分子信標標記相同的熒光基團，但使不同的改良分子信標之
7間熔點差異較大，通過擴增反應完成后的改良分子信標熔解曲線分析，根據改良分子信標 熔點的變化情況，判斷對應的區域是否基因突變。與現有β-珠蛋白基因突變檢測技術相比，本發明具有以下特點1)本發明屬于均相檢測系統，由于PCR擴增完成后只需要進行簡單的熔解曲線分 析就可以完成檢測，整個過程無需開蓋，PCR擴增和之后的熔解曲線分析在同一管中完成， 所使用的探針是改良分子信標，該探針的特點是探針與靶序列結合后熒光增加，也就是說 該探針單獨存在時熒光相對較弱，但是與靶序列雜交后熒光增加。因此操作簡便快速、不易 造成PCR產物污染，而且成本低。2)本方法突破了傳統分子信標檢測基因突變的模式，僅用一條改良分子信標就可 以同時對其所覆蓋區域多種突變的檢測，而用多條改良分子信標則可以實現對多個不同區 域基因突變的檢測，大大提高了單管中可以檢測的基因突變的數目，從而節省了試劑和成 本。


圖1為不同互補的靶序列存在下的改良分子信標的熔解曲線。圖1表明改良分子 信標隨著溫度變化對應的熒光變化情況；在圖1中，橫坐標為溫度Temperature (°C )，縱坐 標為熒光強度Fluoresecence ；曲線1加入的為靶targetl，曲線2加入的為靶target2，曲 線3加入的為靶target3，曲線4加入的為靶target4，曲線5加入的為靶target5，曲線6 加入的為靶target6，曲線7沒有加入任何靶。圖2為經過儀器分析處理后的改良分子信標的熔解曲線圖。圖2是通過將圖1的 溫度與熒光強度的變化求導并取其負導數(-dF/dT)而得到，直接反應了在不同靶序列存 在情況下，改良分子信標的熔點；在圖2中，橫坐標為溫度Temperature (V )，縱坐標為溫度 與熒光強度的導數dF/dT ；曲線1加入的為靶targetl，曲線2加入的為靶target2，曲線3 加入的為靶target3，曲線4加入的為靶target4，曲線5加入的為靶target5，曲線6加入 的為靶target6，曲線7沒有加入任何靶。圖3為改良分子信標檢測人β -珠蛋白基因啟動區TATA框的點突變的實時PCR 結果圖。在圖3中，橫坐標為循環數Cycle number，縱坐標為熒光強度Fluorescence ;a為 野生型，b為-29 (A > G)純合突變型，c為-28 (A > G)純合突變型，d為陰性控制；所用的 模板為人工構建的質粒。圖4為改良分子信標檢測人β -珠蛋白基因啟動區TATA框的點突變的熔解曲線 分析圖。在圖4中，橫坐標為溫度Temperature (°C )，縱坐標為溫度與熒光強度的導數dF/ dT ；a為野生型，b為-29 (A > G)純合突變型，c為-28 (A > G)純合突變型，d為陰性控制； 所用的模板為人工構建的質粒。圖5為改良分子信標檢測人β -珠蛋白基因啟動區TATA框的點突變的實時PCR 結果圖。在圖5中，橫坐標為循環數Cycle number，縱坐標為熒光強度Fluorescence ;a為 野生型，b為-29 (A > G)純合突變型，c為-28 (A > G)純合突變型，d為陰性控制；所用的 模板為不同基因型的人類基因組DNA。圖6為改良分子信標檢測人β-珠蛋白基因啟動區TATA框的點突變的熔解曲線 分析圖。在圖5中，橫坐標為溫度Temperature (°C )，縱坐標為溫度與熒光強度的導數dF/dT ；a為野生型，b為-29 (A > G)純合突變型，c為-28 (A > G)純合突變型，d為陰性控制； 所用的模板為不同基因型的人類基因組DNA。圖7為改良分子信標熔點曲線法檢測人β _珠蛋白基因插入突變結果。在圖7中， 橫坐標為溫度Temperature (V )，縱坐標為溫度與熒光強度的導數dF/dT ；a為野生型，b為 ⑶sl4/15(+G)純合突變型，c為⑶sl7純合突變型，d為陰性控制。圖8為改良分子信標熔點曲線法檢測人β _珠蛋白基因缺失突變結果。在圖8中， 橫坐標為溫度Temperature (V )，縱坐標為溫度與熒光強度的導數dF/dT ；a為野生型，b為 CDs43(G > Τ)純合突變型，c為CDs41/42(-TCTT)純合突變型，d為陰性控制。圖9為多色標記改良分子信標單管多重PCR檢測多個不同區域的β-珠蛋白 基因突變的FAM通道檢測結果。在圖9中，橫坐標為溫度Temperaturerc )，縱坐標為 溫度與熒光強度的導數dF/dT;a為野生型，b為IVS-2-654(C —Τ)雜合突變型，c為 IVS-2-654(C — Τ)純合突變型，ο為陰性控制。圖10為多色標記改良分子信標單管多重PCR檢測多個不同區域的β-珠蛋白基 因突變的HEX通道檢測結果。在圖10中，橫坐標為溫度Temperature (°C )，縱坐標為溫度 與熒光強度的導數dF/dT ；a為野生型，d為-29 (A > G)雜合突變型，e為-29 (A > G)純合 突變型，f為-28 (A > G)純合突變型，g為-28 (A > G)雜合突變型，ο為陰性控制。圖11為多色標記改良分子信標單管多重PCR檢測多個不同區域的β-珠蛋白基 因突變的ROX通道檢測結果。在圖11中，橫坐標為溫度Temperature (°C )，縱坐標為溫度 與熒光強度的導數dF/dT ；a為野生型，h為⑶sl4/15(+G)雜合突變型，i為⑶sl4/15(+G) 純合突變型，j為⑶s 17雜合突變型，k為⑶s 17純合突變型，ο為陰性控制。圖12為多色標記改良分子信標單管多重PCR檢測多個不同區域的β-珠蛋白基 因突變的CAL Fluor Red 635通道檢測結果。在圖12中，橫坐標為溫度Temperature (°C )， 縱坐標為溫度與熒光強度的導數dF/dT ；a為野生型，1為IVS-I-I (G > T)雜合突變型，m為 ⑶s26(G > Α)雜合突變型，η為IVS_I_5(G > C)純合突變型，ο為陰性控制。
具體實施例方式以下實施例結合附圖對本發明作進一步的說明，所給出的是本發明的一些具體 實施例，這些實施例只是說明而不表示本發明所有的可能性，本發明并不局限于這些實施 例中提到的材料、反應條件或參數，任何在相關領域具備經驗的人，都可以按照本發明的原 理，利用其它類似材料或反應條件實現本發明所描述的對突變進行檢測。這些并不脫離本 發明描述的基本概念。實施例1人工合成不同的互補靶序列考察改良分子信標熔解曲線法檢測β _珠蛋 白基因突變的能力本實施例設計了針對β-珠蛋白基因啟動區TATA框的改良分子信標，人工合成野 生型和帶有不同點突變的靶序列，考察改良分子信標熔解曲線法檢測珠蛋白基因突變 的能力。所用的改良分子信標和靶的序列為Probe 1:5' -FAM-CGGC TGGGCATAAA AGTCAGGGCCG-BHQ-3‘Target 1 5' -GCTGCCCTGACTTTTATGCCCAGCCCTG-3‘Target 2:5' -GCTGCCCTGACTTCTATGCCCAGCCCTG-3‘
Target 3:5' -GCTGCCCTGACTTTCATGCCCAGCCCTG-3‘Target 4:5' -GCTGCCCTGACTTTTAGGCCCAGCCCTG-3‘Target 5:5' -GCTGCCCTGACTTTTATTCCCAGCCCTG-3‘Target 6:5' -GCTGCCCTGAGTTTTATGCCCAGCCCTG-3‘其中，Probe 1加下滑線的序列與靶序列互補，Target 2、Target 3、Target 4、 Target 5、Target6加粗的堿基為突變的堿基。所用的靶序列和探針都在上海生工生物工 程有限公司合成。25 μ L 反應液中含 IOX PCR buffer 2. 5 μ L (無 Mg2+)，2. OmM MgCl2, IOpmol probe 1，不加靶序列或者加入IOpmol上述靶序列中的一種，每個反應體系重復3次。對上述混 合液進行熔解曲線分析，反應條件為95°C變性lmin，4(TC保溫2min，隨后按1 °C /step 的升溫速率從40°C遞增至80°C進行熔解曲線分析，并且采集FAM熒光信號。該實驗在 Rotor-gene6000實時PCR儀上進行。結果見圖1和2，可以觀察到，在沒有靶序列存在時，改良分子信標低溫時，自身 閉合，熒光基團和淬滅基團相互靠近而不發出熒光，隨著溫度的升高，改良分子信標的莖環 結構逐漸解鏈而使熒光基團和淬滅基團分離而發出熒光。在有靶序列存在的情況下，改良 分子信標低溫時與互補的靶序列形成剛性且穩定的雙鏈雜交體，使熒光基團和淬滅基團分 離，發出熒光，隨著溫度的升高，雙鏈雜交體逐漸解鏈，達到熔點時，熒光迅速下降。對不同 的靶序列，形成穩定性不同的雙鏈雜合體，具有各自不同的熔點。其中改良分子信標與完全 互補的野生型靶序列(Target 1)形成的雙鏈雜合體最穩定，熔點最高，與具有不同突變的 靶序列形成的雜合體的熔點與突變的類型和突變的位置有關，形成各種獨特的熔點。當加 人白勺革巴為 Target UTarget 2>Target 3>Target 4>Target 5>Target 6 時，改良分子/[言標 的熔點分別為 68. 91°C、61· 43°C >62. 63°C >65. 52°C >59. 38°C >64. 37°C，根據熔點的不同就 很容易判斷到底是加入的是哪種靶。因此，改良分子信標熔解曲線法可以用于珠蛋白 基因突變的檢測。實施例2改良分子信標熔點曲線法檢測人β -珠蛋白基因啟動區TATA框的點突變。β -珠蛋白基因啟動區TATA框的堿基發生點突變，會造成β -珠蛋白肽鏈合成減 少，從而導致β -地中海貧血，如_28由A到G的突變會導致β +地中海貧血，-29由A到 G的突變同樣會導致β +地中海貧血。本實施例設計了 β _珠蛋白基因啟動區TATA框的改良分子信標Probe 1 (同實施 例1)，使用人工構建質粒模板或人類基因組模板，實時PCR擴增后，對Probe 1進行熔解曲 線分析，來說明本發明可以用于單個堿基突變的檢測。所用的引物為Primer 1:5' -CCAATCTACTCCCAGGAGCA-3‘Primer 2:5' -ACCTTGATACCAACCTGCC-3‘由上海生工生物工程有限公司合成。PCR 反應體系為25 μ L 反應液中含 IOX PCR buffer 2. 5 μ L(無 Mg2+)，3. OmM MgCl2,0. 2mM dNTP，IU 熱啟動 Taq DNA 聚合酶，0. 2 μ M 上游引物 Primer 1，0. 8μΜ下游引 物Primer2，0. 2 μ M Probe 1，5 μ L的質粒模板或者人類基因組模板或者5 μ L的水(陰性控制)。反應條件為95°C 5min預變性，循環周期為95°C 15s, 56°C 20s, 72°C 20s，共50個 循環，在每個循環退火階段采集FAM通道熒光數據。PCR反應完成后，進行熔解曲線分析，反 應條件為95°C變性lmin，40°C保溫2min，隨后按1°C /step的升溫速率從40°C遞增至80°C 進行熔解曲線分析，并且采集FAM熒光信號。該實驗在Rotor-gene 6000實時PCR儀上進 行。結果見圖3 6。圖3和4所用的模板包括野生型質粒模板，-28 (A > G)純合突 變型質粒模板，"29 (A > G)純合突變型質粒模板，陰性質控為不加入模板；圖5和6所用的 模板包括野生型人類基因組DNA模板，-28 (A > G)雜合突變型人類基因組DNA模板，-29 (A > G)雜合突變型人類基因組DNA模板。圖3的實時PCR擴增曲線表明，不論是野生型還是純合突變型質粒模板，改良分子 信標探針都能給出較好的信號，雖然突變型模板的終點熒光信號略低，但是僅從該圖是無 法判斷模板的類型的，而圖4的熔解曲線分析則可以從改良分子信標熔點的不同判斷出模 板的類型，不同突變的質粒模板，具有各自不同的熔點。當模板為-28突變質粒時，改良分 子信標熔點為58. 3°C，模板為-29突變質粒時，改良分子信標熔點為59. 3°C，模板為野生型 質粒時，改良分子信標熔點為65. 8°C。突變型和野生型之間熔點差異極大，而不同突變間， 即使是相鄰堿基同種類型的突變，熔點也達到1°C的差異，可以得到較好的區分。同樣地，圖5的實時PCR曲線也表明，通過實時PCR曲線圖是無法判斷基因組模板 的類型。圖6的熔解曲線分析結果則表明，當模板為野生型基因組時，改良分子信標只有 一個野生型的熔點峰，當模板為雜合型基因組時，改良分子信標有一個野生型的熔點峰和 一個突變型的熔點峰，因此，通過熔點值的大小和峰的個數，很容易對模板的基因型作出判 斷。本實施例說明，改良分子信標熔解曲線法可以用于單個堿基突變的檢測，根據熔 解曲線峰的個數以及熔點值的大小，可以判斷出不同模板的基因型。實施例3改良分子信標熔點曲線法檢測人β-珠蛋白基因⑶sl4/15(+G)插入突變。β -珠蛋白基因⑶S14/15 (+G)插入突變造成編碼區閱讀框架的移位，使β -珠蛋 白肽鏈合成過早的終止，從而導致β °地中海貧血。本實施例設計的改良分子信標Probe 2 覆蓋了 β _珠蛋白基因⑶S14/15區，同時也覆蓋了⑶sl7區，其中常見的⑶sl7(A — T)突 變同樣會導致β 0地中海貧血。所用的引物為Primer 1和Primer 2(同實施例2)，Probe 2 序列為5 ‘ -R0X-CACGTTCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTG-DABCYL-3 ‘，其中加下滑線序列與 β-珠蛋白基因互補。PCR 反應體系為25 μ L 反應液中含 IOX PCR buffer 2. 5 μ L (無 Mg2+)，3. OmM MgCl2,0. 2mM dNTP，IU 熱啟動 Taq DNA 聚合酶，0. 2 μ M 上游引物 Primer 1，0. 8μΜ下游引 物Primer2，0. 2 μ M Probe 2，5 μ L的質粒模板或5 μ L的水(陰性控制)。所用的模板為包 括野生型質粒模板；⑶sl7(A > Τ)純合突變型質粒模板；⑶sl4/15(+G)純合突變型質粒 模板。反應條件為95°C 5min預變性，循環周期為95°C 15s，56V 20s, 74V 20s，共50個 循環，在每個循環退火階段采集ROX熒光數據。PCR反應結束后，進行熔解曲線分析，反應條 件為95°C變性lmin，4(TC保溫2min，隨后按1°C /step的升溫速率從50°C遞增至80°C進行熔解曲線分析，并且采集ROX熒光信號。該實驗在Rotor-gene 6000實時PCR儀上進行。結果見圖7，可以觀察到，當模板為野生型、⑶sl7(A —G)突變或⑶sl4/15 (+G)插 入突變時，改良分子信標Probe 2都有自身獨特的熔點，分別是701、681、65.51，因此， 通過熔點值的大小我們就可以判斷模板的基因型。該實施例主要說明，改良分子信標熔解 曲線法可以用于檢測珠蛋白基因的插入突變。實施例4改良分子信標熔點曲線法檢測人β _珠蛋白基因⑶s41/42(_TCTT)缺失 突變。β -珠蛋白基因⑶41/42 (-TCTT)缺失突變造成編碼區閱讀框架的移位，使β -珠 蛋白肽鏈合成過早的終止，從而導致β °地中海貧血。本實施例設計的改良分子信標Probe 3覆蓋了 β-珠蛋白基因⑶S41/42區，同時也覆蓋了⑶s43區，⑶s43 (G — T)突變同樣會 導致β °地中海貧血。本實施例所用的引物和探針的序列為Primer 3:5' -CCTTAGGCTGCTGGTGGTCT-3‘Primer 4:5' -GTGCCCTTGAGGTTGTCCA-3‘Probe 3:5' -HEX-CGATCCAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCG-BHQ-3‘其中，Probe 3加下滑線的序列與靶序列互補。25 μ L 反應液中含 10X PCR buffer 2. 5 μ L (無 Mg2+)，3. OmM MgCl2,0. 2mM dNTP, IU熱啟動Taq DNA聚合酶，0. 2μ M上游引物Primer 3，0. 8 μ M下游引物Primer 4,0. 4μΜ Probe 3，5yL的質粒模板或5yL的水(陰性控制)。所用的模板為包括野生型質粒模 板；CDs41/42(-TCTT)純合突變型質粒模板；CDs43(G — Τ)純合突變型質粒模板。反應條件為95°C 5min預變性，循環周期為95°C 15s，56°C 20s, 72°C 20s，共50個 循環，在每個循環退火階段采集HEX熒光數據。PCR反應結束后，進行熔解曲線分析，反應條 件為95°C變性lmin，4(TC保溫2min，隨后按1°C /step的升溫速率從45°C遞增至80°C進 行熔解曲線分析，并且采集HEX熒光信號。該實驗在Rotor-gene 6000實時PCR儀上進行。結果見圖8，可以觀察到，當模板為野生型、⑶s41/42 (-TCTT)缺失突變或 ⑶s43(G —T)突變時，改良分子信標Probe 3都有自身獨特的熔點，分別是66. 37 °C、 58.68°C、60.92°C。該實施例說明，改良分子信標熔解曲線法可以用于檢測基因的缺失突 變。實施例5多色標記改良分子信標單管多重PCR檢測多個不同區域的β _珠蛋白基 因突變。前面的實施例表明，一個改良分子信標可以同時覆蓋鄰近的突變位點，進行多個 突變同時檢測。本實施例則用來說明即使不同區域的珠蛋白基因突變，通過使用不 同顏色標記的改良分子信標，亦可以實現單管對多個突變的檢測。本實施例分別設計了 β-珠蛋白基因啟動區TATA框、CDsl7區、CDs26區、IVS-2-654區的改良分子信標Probe 5,Probe 2,Probe 6,Probe 4，并且分別標記了不同的熒光基團，所用的引物和探針的序列 為Primer 5:5' -CAATCTACTCCCAGGAGCA-3 ‘Primer 6:5' -GCCCAGTTTCTATTGGTCTC-3‘Primer 7:5' -CATCATGCCTCTTTGCACCA-3‘
Primer 8:5' -GCAATATGAAACCTCTTACATCAG—3‘Probe 4:5' -FAM-CGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATTATCACG-BHQ-3‘Probe 5 5' -HEX-CGGC TGGGCATAAA AGTCAGGGCCG-BHQ-3‘Probe 6:5, -CAL Fluor Red 635-CGGTGAGGCCCTTGGCAGGTTGGTATCACCC-BHQ-3‘其中探針加下滑線的序列與靶序列互補。反應體系為25μ L 反應液中含 IOX PCR buffer 2. 5 μ L (無 Mg2+)，4. OmM MgCl2, 0. 2mMdNTP，IU 熱啟動 Taq DNA聚合酶，0. 15 μ M 的 Primer 5，1. 5 μ M 的 Primer 6,0. 075 μ M 的 Primer 3，0· 8 μ M 的 Primer 4,0. 2μΜ Probe 5,0. 3μΜ Probe 2,0. ΙμΜ Probe 6, and 0. 2 μ M Probe4, 5 μ L的質粒或基因組模板或5 μ L的水(陰性控制)。所用的模板為包括 野生型基因組DNA模板；-28 (A > G)純合突變型質粒模板；-28 (A > G)雜合突變型基因組 DNA模板；-29 (A > G)純合突變型質粒模板；-29 (A > G)雜合突變型基因組DNA模板；⑶s 17 (A > T)純合突變型質粒模板；⑶sl7(A > Τ)雜合突變型基因組DNA模板；⑶sl4/15(+G) 純合突變型質粒模板；⑶sl4/15(+G)雜合突變型基因組DNA模板；⑶s26(G > Α)雜合突變 型基因組DNA模板；IVS-I-5 (G > C)純合突變型質粒模板；IVS-I-I (G > T)雜合突變型基 因組DNA模板；IVS-2-654(C > Τ)純合突變型質粒模板；IVS_2_654(C > Τ)雜合突變型基 因組DNA模板。PCR 反應條件為 95°C 5min 預變性，循環周期為 95°C 15s，56°C 20s，74°C 20s，共 50 個循環，在每個循環退火階段同時采集FAM、HEX、ROX、CAL Fluor Red 635熒光數據。PCR 反應結束后，進行熔解曲線分析，反應條件為95°C變性lmin，4(TC保溫3min，隨后按1°C / step的升溫速率從40°C遞增至80°C進行熔解曲線分析，并且同時采集FAM、HEX、ROX、CAL Fluor Red 635熒光信號。該實驗在Rotor-gene 6000實時PCR儀上進行。結果見圖9 12，可以觀察到，每條探針都給出模板在該位點的正確的基因型。例 如當模板為野生型時，Probe 4、Probe 5、Probe 2、Probe 6都顯示該模板在自身探針覆 蓋的位置沒有突變；當模板為某種突變型時，覆蓋該突變區域的探針的熔點發生改變，從而 可以推測模板的突變類型。本實施例說明，改良分子信標熔解曲線法可以通過多重PCR和 多種顏色標記探針，從而實現單管對多個不同區域的突變的檢測。
0121]序列表0122]實施例10123]改良分子信標和靶的序列為0124]Probe 1 5'-FAM-CGGC TGGGCATAAA AGTCAGGGCCG-BHQ0125]Target 15'-GCTGCCCTGACTTTTATGCCCAGCCCTG--3'0126]Target 25'-GCTGCCCTGACTTCTATGCCCAGCCCTG--3'0127]Target 35'-GCTGCCCTGACTTTCATGCCCAGCCCTG--3'0128]Target 45'-GCTGCCCTGACTTTTAGGCCCAGCCCTG--3'0129]Target 55'-GCTGCCCTGACTTTTATTCCCAGCCCTG--3'0130]Target 65'-GCTGCCCTGAGTTTTATGCCCAGCCCTG--3'。0131]實施例20132]引物為0133]Primer 15'-CCAATCTACTCCCAGGAGCA-3'
13
Primer 2 5'-ACCTTGATACCAACCTGCC-3‘。
實施例3
Probe 2 序列為5' -R0X-CACGTTCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTG-DABCYL-3‘。
實施例4
引物和探針的序列為
Primer 3-CCTTAGGCTGCTGGTGGTCT-3‘
Primer 4:5'-GTGCCCTTGAGGTTGTCCA-3‘
Probe 3-HEX-CGATCCAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCG-BH0-3‘。
實施例5
引物和探針的序列為
Primer 5 5'-CAATCTACTCCCAGGAGCA-3‘
Primer 6 5'-GCCCAGTTTCTATTGGTCTC-3‘
Primer 7 5'-CATCATGCCTCTTTGCACCA-3‘
Primer 8 5'-GCAATATGAAACCTCTTACATCAG-3‘
Probe 4 5'-FAM-CGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATTATCACG-BH0-3'
Probe 5 5'-HEX-CGGC TGGGCATAAA AGTCAGGGCCG-BH0-3‘
Probe 6 5‘-CAL Fluor Red 635-CGGTGAGGCCCTTGGCAGGTTGGTATCACCC-Q-3'。
權利要求
一種檢測人β 珠蛋白基因突變的方法，其特征在于包括以下步驟1)在β 珠蛋白基因需要檢測突變的區域設計并制備相應的改良分子信標；2)在設計好的改良分子信標的外圍設計一條上游引物和下游引物，用該上游引物和下游引物對PCR擴增含有待檢測區域的片段；3)PCR擴增結束后進行熔解曲線分析，根據改良分子信標的熔點的變化來判斷待檢測核酸序列是否具有基因突變以及可能的突變類型。
2.如權利要求1所述的一種檢測人珠蛋白基因突變的方法，其特征在于所述 β-珠蛋白基因突變指β-珠蛋白基因序列的改變，β-珠蛋白基因序列的改變是指至少1 個堿基的改變，包括堿基的轉換、顛換、插入和缺失。
3.如權利要求1所述的一種檢測人珠蛋白基因突變的方法，其特征在于所述 β-珠蛋白基因突變集中在單個探針可以覆蓋的區域，或距離比較遠的區域。
4.如權利要求1所述的一種檢測人珠蛋白基因突變的方法，其特征在于所述改良 分子信標是一種具有頸環結構的熒光探針，長度為15 40個堿基，除環上的序列與靶互補 外，臂上也有部分堿基與靶互補。
5.如權利要求1所述的一種檢測人珠蛋白基因突變的方法，其特征在于所述改良 分子信標由普通堿基組成，所述普通堿基中可以包含特殊修飾的堿基。
6.如權利要求1所述的一種檢測人珠蛋白基因突變的方法，其特征在于所述改良 分子信標是通過熔點的變化來區分野生型的靶序列和突變型的靶序列，探針設計成與野生 型靶序列完全互補，或設計成變異靶序列完全互補。
7.如權利要求1所述的一種檢測人珠蛋白基因突變的方法，其特征在于所述改良 分子信標在5'末端標記熒光基團或淬滅基團，3'末端標記淬滅基團或熒光基團。
8.如權利要求7所述的一種檢測人珠蛋白基因突變的方法，其特征在于所述熒光 基團包括目前各種常用的熒光標記物，但不限于這些熒光標記物，如ALEX-350，FAM, VIC, TET，CAL Fluor Gold 540, JOE, HEX, CAL Fluor Orange 560，TAMRA，CAL Fluor Red 590， ROX, CAL Fluor Red 610，TEXAS RED, CAL Fluor Red 635，Quasar 670，CY3, CY5, CY5. 5， Quasar705 ；所述淬滅基團包括目前各種常用的各種淬滅劑，但不限于這些淬滅劑，如DABCYL、 BHQ-U BHQ-2, ECLIPE。
9.如權利要求1所述的一種檢測人珠蛋白基因突變的方法，其特征在于在步驟2) 中，所述PCR擴增的單重單色反應體系為IX PCR緩沖液；MgCl21 IOmM ；dNTP 各0. 05 1. 5mM上游引物0. 05 2μΜ ；下游引物0. 05 2μΜ ；探針0. 05~ 0. 5 μ MTaq酶0. 1 - 5U ；模板1 20 μ L ；總體積10 100μ L ；所述PCR擴增的多重多色反應體系為 IX PCR緩沖液；MgCl21 IOmM ；dNTP 各0. 05 1. 5mM各上游引物0. 05 2μΜ ；各下游引物0. 05 2μΜ ；各探針0. 05~ 0. 5 μ MTaq酶0. 1 - 5U ；模板1 20 μ L ；總體積10 100 μ L0
10.如權利要求1所述的一種檢測人β-珠蛋白基因突變的方法，其特征在于在步驟2)中，所述PCR擴增的PCR反應條件是90 100°C預變性3 lOmin，40 60個循環中 90 95°C變性 10 60s，45 60°C退火 10 60s，70 78°C延伸 15 120s。
11.如權利要求1所述的一種檢測人珠蛋白基因突變的方法，其特征在于在步驟3)中，所述PCR擴增結束后進行熔解曲線分析的條件為90 95°C變性1 lOmin，4 40°C 低溫保溫1 20min，隨后按0. 3 1°C /step的升溫速率從20 40°C遞增至80 90°C 進行熔解曲線分析，并在熒光PCR儀上采集與探針顏色標記相應通道的熒光數據。
全文摘要
一種檢測人β-珠蛋白基因突變的方法，涉及一種檢測人β-珠蛋白基因突變的方法，尤其涉及一種改良分子信標熔解曲線檢測β-珠蛋白基因突變的方法。提供一種檢測人β-珠蛋白基因突變的方法。在β-珠蛋白基因需要檢測突變的區域設計并制備相應的改良分子信標；在設計好的改良分子信標的外圍設計一條上游引物和下游引物，用該上游引物和下游引物對PCR擴增含有待檢測區域的片段；PCR擴增結束后進行熔解曲線分析，根據改良分子信標的熔點的變化來判斷待檢測核酸序列是否具有基因突變以及可能的突變類型。
文檔編號C12Q1/68GK101899499SQ200910111868
公開日2010年12月1日 申請日期2009年5月26日 優先權日2009年5月26日
發明者李慶閣, 黃秋英 申請人:廈門大學