專利名稱：檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的特異性擴增引物及其檢測試劑盒和檢測方法
技術領域：
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本發明主要涉及動物生物技術領域中的綿羊分子標記輔助育種技術，具體涉及到藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的檢測。
背景技術：
-
綿羊腐蹄病是由節瘤擬桿菌引起高度接觸性傳染病，其特征是蹄局部組織發炎、壞死。綿羊患病后生長不良、掉膘、羊毛品質下降，病情嚴重且得不到及時治療時會引起羊只死亡。藏綿羊易患腐蹄病，于每年7-9月份的多雨季節爆發，如在甘肅和青海境內的藏綿羊發病率高達30%以上，死亡率最高可達10%，嚴重影響牧區養羊業發展。
動物主要組織相容性(基因)復合體(major histocompatibility complex ,MHC)與多種疾病有密切關系，是目前開展抗病育種的首選基因座或候選基因。綿羊主要組織相容性(基因)復合體也稱為OLA (ovine lymphocyte antigen) ， OLA II區與人的相似，區域內的￡ 2和Di 2個基因家族表現豐富的多態性，但綿羊的多態性更集中在DQ家族。OLA-DQ基因家族有2個DQA基因座位，即DQA1和DQA2基因，都具有多態性。
目前國內綿羊腐蹄病主要采用藥物防治措施，較難控制病情且有藥物殘留風險。在國外OLA-DQA2基因已經作為抗腐蹄病的遺傳標記加以應用，并且該檢測已商業化并用來開展抗病選育。藏綿羊腐蹄病抗性分子選種技術主要利用PCR-SSCP技術對待測綿羊的DQA2基因第2外顯子進行多態性分析，然后根據檢測結果確定攜帶不同等位基因的羊只對腐蹄病的抗性強弱，從而判斷是否可以留作種用。
發明內容
本發明的目的在于避免現有技術的不足之處而提供一種檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的特異性擴增弓l物及其引物的擴增條件。
本發明的另一 目的是提供一種檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測試劑盒。本發明的還有一個目的是提供一種檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測試劑盒的使用方法。
以解決快速、敏感性高、成本低用于藏綿羊腐蹄病抗性分子選種技術。本發明利用PCR-SSCP對表型正常和患腐蹄病藏綿羊OLA-DQA2基因第2外顯子進行遺傳多態性分析，并克隆、測序群體內變異產生的各等位基因序列，結合表型觀測資料，確定易感等位基因和抗性等位基因，并指導藏綿羊沒有感染時的抗病選育。
本發明涉及一種藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測方法及檢測試劑盒。通過PCR-SSCP對藏綿羊基因組DNA進行檢測，分析羊只是否攜帶腐蹄病抗性等位基因，從而判斷是否可以留作種用。
本發明的目的可以通過采用以下技術方案來實現 一種檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的特異性擴增引物，其主要特點是第一組引物上游長度為24bp的核苷酸，下游長度為22bp的核苷酸，第二組引物上游長度為23bp的核苷酸，下游長度為24bp的核苷酸，包括用于擴增OLA-DQA2基因第2外顯子的特異性引物，序列如下上游弓I物24bp: DQA2-up: CACATGTTACAGTGCAAAARCAGC;下游引物22bp: DQA2-dn: CCCTCYCACCAACGTTTCCCAG;上游弓I物23bp: DQA2s-up: ACTACCAATCTCATGGTCCCTCT;下游弓l物24bp: DQA2s-dn: GGAGTAGAATGGTG GACACTTACC;其中I^A或G， Y-C或T。
所述的檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的特異性擴增引物，是所述的PCR-SSCP擴增引物的擴增條件為
第一次第一組引物PCR反應條件預變性94t:2 min ，變性94。C30s ，退火64。C30s，延伸72。C50s，共32個循環，最后72。C延伸5 min;
第二次第二組引物PCR反應條件預變性94'C2 min ，變性94'C30s ，退火67'C30s，延伸72'C30s，共32個循環,最后72'C延伸5 min。
所述的檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測試劑盒，組成成分用量及濃度為四種引物各為0.5nL/10pmo1， dNTP為1.2nL/2.5mm， Taq DNA聚合酶為0.2pL/2.5U4iL，10xbuffer為2.0pL含Mg2+15nM，雙純水為14.6pL。
SSCP檢測試劑去離子水，10%過硫酸銨，變性緩沖液，TEMED(四甲基乙二胺)，聚丙烯酰胺(Acr: Bis = 39:1)， OLA-DQA2*L的DNA標準樣。
所述的檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測方法，是藏綿羊易感等位基因和抗性較強等位基因的確定步驟為
(1)收集表型正常和患腐蹄病藏綿羊基因組DNA;(2) 用上述特異性引物DQA2-up和DQA2-dn擴增步驟(1 )中的DNA特異性片 段；
(3) 用上述特異性引物DQA2s-up和DQA2s-dn擴增步驟(2)中的的PCR產物；
(4) 用步驟(3)中的的PCR產物進行SSCP檢測；
(5) 克隆、測序步驟(4)中產生的各等位基因序列；
(6) 根據(4)的基因型判別結果，結合表型觀測資料，確定藏綿羊腐蹄病易感等 位基因和抗性等位基因；
(7)確定藏綿羊腐蹄病易感等位基因為OLA-DQA2*H，抗性等位基因為
OLA-DQA2*L。
所述的檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測方法，具體的檢測步驟如下
(1 )樣品采集采集表型正常和患腐啼病的藏綿羊，頸靜脈采血10ml， ACD抗凝-20
'C凍存；
(2) 基因組DNA的提取用常規的酚-氯仿抽提法從凍存血樣中提取基因組DNA;
(3) 聚合酶鏈式反應
20pL的反應體系，其成分用量及濃度為四種引物各為0.5pL/10pmol， dNTP為 1.2nL/2.5腿，TaqDNA聚合酶為0.2nL/2.5U/pL， 10xbuffer為2.0^iL含Mg2+15pM，模 板DNA為ljiL/50ng，雙純水為14.6pL;
第一次第一組引物PCR反應條件預變性94。C2min ，變性94。C30s ，退火64。C30s， 延伸72'C50s，共32個循環，最后72'C延伸5 min;
第二次第二組引物PCR反應條件預變性94。C2min ，變性94。C30s ，退火67。C30s， 延伸72'C30s，共32個循環，最后72'C延伸5min;
DQA2-up和DQA2也的擴增產物大小為828bp， DQA2s-up和DQA2s-dn以DQA2-up 和DQA2-dn的擴增產物為模板的擴增產物大小為242bp。
(4) PCR產物的SSCP檢測
取2^d的PCR產物加入^l的上樣變性緩沖液,包括98。/。去離子甲酰胺、0.025%溴酚藍、 0.025%二甲苯青、10mmol/LEDTApH8.0 ， 98 。C變性10min ，立即冰浴10min; 12% 的非變性聚丙烯酰胺凝膠，140V電壓條件下，4'C電泳19h ，銀染法顯色后拍照；
(5) 結果判斷
在藏綿羊DQA2基因第2外顯子上共發現16個(OLA-DQA2*A-OLA-DQA2*P) 等位基因，藏綿羊腐蹄病易感等位基因為OLA-DQA2*H，抗性等位基因為 OLA-DQA2*L。所述的檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測試劑盒的使用方法，具體的步驟為
(1) 試劑盒中各組分與待檢測基因組DNAlnL/50ng混合，進行PCR擴增； 所述的PCR-SSCP擴增引物的擴增條件為
第一次第一組引物PCR反應條件預變性94'C2 min ，變性94'C30s ，退火 64'C30s，延伸72'C50s，共32個循環，最后72'C延伸5 min;
第二次第二組引物PCR反應條件預變性94'C2 min ，變性94'C30s ，退火 67。C30s，延伸72'C30s，共32個循環,最后72。C延伸5 min。
(2) 用步驟(1)中擴增的PCR產物和OLA-DQA2化標準樣與試劑盒中SCCP檢 測試劑各組分混合進行SSCP檢測；
(3) 步驟(2)中檢測到的帶型與試劑盒中OLA-DQA2*L的DNA標準樣帶型一致 的樣品為攜帶腐蹄病抗性等位基因的個體。
本發明的有益效果本發明利用PCR-SSCP對表型正常和患腐蹄病藏綿羊的 OLA-DQA2基因第2外顯子進行遺傳多態性分析，并克隆、測序群體內變異產生的各等 位基因序列，結合表型觀測資料，確定易感等位基因和抗性較強的等位基因，為藏綿羊 沒有感染時的抗病選育進行指導。本發明通過對試驗羊只OLA-DQA2基因第2外顯子的 SSCP檢測，發現了16個等位基因，其中14個等位基因(OLA-DQA2*A、 OLA-DQA2*B、 OLA-DQA2*C、 OLA-DQA2*D 、 OLA-DQA2*E 、 OLA-DQA2*F 、 OLA-DQA2*G 、 OLA-DQA2*I、 OLA-DQA2*J、 OLA-DQA2*K 、 OLA-DQA2*M 、 OLA-DQA2*N 、 OLA-DQA2*0、 OLA-DQA2*P )在正常和患病群體中都存在，l個等位基因 (OLA-DQA2*L)只在正常群體中存在，另有l個等位基因(OLA-DQA2*H)只在患病 群體中存在。將等位基因OLA-DQA2+L作為藏綿羊腐蹄病抗病相關MHC基因標記，建立 了抗病相關基因標記輔助選種技術。本發明對藏綿羊抗腐蹄病的分子標記選種具有快速、 敏感性高、成本低等特點。
圖i是藏綿羊OLA-DQA2基因第2外顯子PCR-SSCP檢測凝膠圖。
具體實施例方式
以下對所示之最佳實施例作進一步詳述
下面以藏綿羊腐蹄病抗性分子選種技術的建立為例，對本發明的內容進行詳細的說明。
實施例h 試驗材料
藏綿羊選自甘肅省甘南藏族自治州大水種畜場104只，甘南州碌曲縣牧民羊群羊791 只(患腐蹄病223只)，青海省海晏縣哈里鄉哈里村牧民羊群72只(患腐蹄病22只)，頸 靜脈采血10ml， ACD抗凝,-20 。C凍存。用酚-氯仿抽提法從凍存血樣中提取基因組DNA， 溶于TE， 4'C保存。 試驗方法
l.引物設計和PCR擴增
采用巢式PCR進行基因擴增。DQA2-up和DQA2-dn的擴增產物大小為828bp ， DQA2s-up和DQA2s-dn以DQA2-up和DQA2-dn的擴增產物為模板的擴增產物大小為 242bp，引物序列為
上游弓I物24bp: DQA2-up. CACATGTTACAGTGCAAAARCAGC;
下游引物22bp: DQA2-dn: CCCTCYCACCAACGTTTCCCAG;
上游引物23bp: DQA2s-up: ACTACCAATCTCATGGTCCCTCT;
下游弓I物24bp: DQA2s-dn: GGAGTAGAATGGTGGACACTTACC;
其中R=A,Y=C。
PCR反應體系2(HiL的反應體系，其成分用量及濃度為四種引物各為0.5pL/10pmd， dNTP為1.2)^L/2.5mm， TaqDNA聚合酶為0.2^iL/2.5U/pL， 10xbuffer為2.0ijL含Mg2+15pM， 模板DNA為lpL/50ng，雙純水為14.6pL。
PCR反應條件第一次第一組引物PCR反應條件預變性94'C2 min ，變性94'C 30s ，退火64。C30s，延伸72。C50s，共32個循環,最后72'C延伸5 min。
第二次第二組引物PCR反應條件預變性94'C2 min ，變性94'C30s ，退火67'C 30s，延伸72。C30s，共32個循環,最后72。C延伸5min。
DQA2-up和DQA2-dn的擴增產物大小為828bp， DQA2s-up和DQA2s-dn以DQA2-up 和DQA2-dn的擴增產物為模板的擴增產物大小為242bp。
得到242bp的特異性擴增產物，可直接進行SSCP檢測。
2.SSCP檢測
取步驟l中2nl的PCR產物加入8til的變性上樣緩沖液[包括98。/。去離子甲酰胺、0. 025% 溴酚藍、0. 025%二甲苯青、10mmol/LEDTA (pH 8. 0) ]， 98 。C變性10min ,立即冰浴10min。 12 。/。的非變性聚丙烯酰胺凝膠(Arc: Bis = 39:1)140V電壓條件下,4 。C電泳19h ，銀染法顯色后拍照。
其中，對PCR擴增產物進行SSCP分析，在所檢測的967只藏綿羊中共發現16個等位 基因，分別指定為01^-0(5^*八、*B、 ......*0和叩。各等位基因的電泳條帶從1條到4
條不等，結果見圖l。
3. 不同等位基因的克隆測序
經SSCP分析后,利用瓊脂糖凝膠純化試劑盒回收不同等位基因的PCR產物。回收后 的片段用載體連接，構建重組質粒,并轉化大腸桿菌DH5a菌株，菌落PCR鑒定后送上海 桑尼生物工程有限公司進行測序。
4. 藏綿羊DQA2基因第2外顯子等位基因頻率
表1藏綿羊DQA2基因第2外顯子的等位基因頻率
￥^""" 觀察值 等位基因頻率 一
基因 ~~~患病羊 健康羊 患病羊 健康羊
合計 245 722
5.結果分析
禾,PCR-SSCP方法檢測了967只表型正常和患病藏綿羊OLA-DQA2基因第2外顯子 的多態性后，發現了16個等位基因，其中14個等位基因(OLA-DQA2*A、 OLA-DQA2*B、 OLA-DQA2*C、 OLA-DQA2*D 、 OLA-DQA2*E 、 OLA-DQA2*F 、 OLA-DQA2*G、 OLA-DQA2*I、 OLA-DQA2*J、 OLA-DQA2*K 、 OLA-DQA2*M 、 OLA-DQA2*N 、 OLA-DQA2*0、 OLA-DQA2*P )在正常和患病群體中都存在，l個等位基因 (OLA-DQA2*L)只在正常群體中存在，另有l個等位基因(OLA-DQA2*H)只在患病 群體中存在。
94 0.1673 0.1302
79 0.0653 O.麵
23 0.0245 0.0319
26 0.0204 0.0360
27 0.0245 0,0374 87 0.1469 0.1205 56 0.0857 0.0776 0 0.0204 0.0000 58 0.0898 0.0803 48 0.0653 0.0665 54 0.0857 0.0748 7 O遍O 0.0097 56 0.0571 0,0776 18 0.0490 0.0249 36 0.0163 0.0499 53 0.0816 0.0734
6 1 2 6 1: >
3 2 5 2 1 2 o
o
2
ABCDEFGHIJKLMN9T實施例2:所述的檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測方法，是藏綿羊易感等位基 因和抗性較強等位基因的確定步驟為
(1) 收集表型正常和患腐蹄病藏綿羊基因組DNA;
(2) 用上述特異性引物DQA2-up和DQA2-dn擴增步驟(1)中的DNA特異性片 段；
(3) 用上述特異性引物DQA2s-up和DQA2s-dn擴增步驟(2)中的的PCR產物；
(4) 用步驟(3)中的的PCR產物進行SSCP檢測；
(5) 克隆、測序步驟(4)中產生的各等位基因序列；
(6) 根據(4)的基因型判別結果，結合表型觀測資料，確定藏綿羊腐蹄病易感等 位基因和抗性等位基因；
(7)確定藏綿羊腐蹄病易感等位基因為OLA-DQA2*H，抗性等位基因為
OLA-DQA2*L。
實施例3:所述的檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測方法，具體的檢測步驟如下
(1) 樣品采集:采集表型正常和患腐啼病的藏綿羊，頸靜脈采血10ml， ACD抗凝,-20
'C凍存；
(2) 基因組DNA的提取用常規的酚-氯仿抽提法從凍存血樣中提取基因組DNA;
(3) 聚合酶鏈式反應
20pL的反應體系，其成分用量及濃度為四種引物各為0.5pL/10pmol， dNTP為 1.2pL/2.5mm， Taq DNA聚合酶為0.2mL/2.5U/mL， 10xbuffer為2.0pL含Mg2+15jiM，模 板DNA為lnL/50ng，雙純水為14.6pL;
第一次第一組引物PCR反應條件預變性94。C2min ，變性94。C30s ，退火64。C30s， 延伸72。C50s，共32個循環,最后72。C延伸5 min;
第二次第二組引物PCR反應條件預變性94'C2min ，變性94'C30s ，退火67'C30s， 延伸72。C30s，共32個循環，最后72'C延伸5 min;
DQA2-up和DQA2-dn的擴增產物大小為828bp， DQA2s-up和DQA2s-dn以DQA2-up 和DQA2-dn的擴增產物為模板的擴增產物大小為242bp。
(4) PCR產物的SSCP檢測
取2pl的PCR產物加入^l的上樣變性緩沖液,包括98。/。去離子甲酰胺、0. 025%溴酚藍、 0.025。/。二甲苯青、10醒ol/LEDTApH8.0 ， 98 。C變性10min ，立即冰浴10min; 12% 的非變性聚丙烯酰胺凝膠，140V電壓條件下，4'C電泳19h ，銀染法顯色后拍照；
(5) 結果判斷在藏綿羊DQA2基因第2外顯子上共發現16個(OLA-DQA2*A-OLA-DQA2*P) 等位基因，藏綿羊腐蹄病易感等位基因為OLA-DQA2*H，抗性等位基因為 OLA-DQA2*L。
實施例4:試劑準備
(1) 基因組DNA提取所必需的試劑蛋白酶K(20mg/ml)， PBS (8gNaCl、 0.2gKCl、 1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4用HCl調節pH值至7.4，加水定容至1L)，苯酚，氯仿，異 戊醇，DNA提取液(10mMTris.Cl(pH 8.0)， 0.1 MEDTA(pH=8.0)， 0.5%SDS，調節pH二8.0， 定容到100ml)，無水乙醇，TE (lOmMTris'Cl (pH8.0)， lmMEDTA (pH8.0))。
(2) 進行PCR擴增所必須的試劑20pL的反應體系，其成分用量及濃度為四種引 物各為0.5pL/10pmo1， dNTP為1.2^L/2.5腿，Taq DNA聚合酶為0.2nL/2.5U/pL， 10xbuffer 為2.(^L含Mg2+15pM,模板DNA為lnL/50ng，雙純水為14.6pL。。
(3) SSCP檢測所必須的試齊U:上樣變性緩沖液[包括98%去離子甲酰胺、0. 025% 溴酚藍、0.025%二甲苯青、10mmol/LEDTA(pH8.0)]， 10%過硫酸銨，TEMED (四甲 基乙二胺)，12。/。的非變性聚丙烯酰胺凝膠(Arc:Bis-39:l)， OLA-DQA2^的DNA標準 樣、去離子水。
實施例5:所述的檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測方法，所述的待檢物DNA的 提取有如下步驟
(1) 冷凍血液在室溫融化以后，取500^1移至1.5ml離心管中，加入等體積PBS緩 沖液，混合，充分搖動，12000rpm離心10min，棄上清液。
(2) 再取500^il血液移至離心管中，加入等體積PBS緩沖液，混合，充分搖動， 12000rpm離心10min，棄上清液。
(3) 加入500(^1 DNA抽提緩沖液，重懸沉淀物。
(4) 加入蛋白酶K至終濃度為100pg/ml，混勻，用封口膜封住，55'C水浴過夜。
(5) 將溶液冷卻至室溫，加入等體積苯酚，緩慢的顛倒離心管10分鐘，直至兩相 混合形成乳濁液，12000rpm離心10min。
(6) 取上清，再加入等體積苯酚氯仿異戊醇(25: 24: 1)，緩慢的顛倒離心管 10min， 12000rpm離心10min。
(7) 取上清，加入等體積氯仿異戊醇(24: 1)，緩慢的顛倒離心管10min， 12000rpm 離心10min。
(8) 取上清，加入2倍體積的無水冰乙醇沉淀DNA，緩慢的轉動離心管，可見白色DNA沉淀。
(9) 12000rpm離心10min;棄上清，然后加4'C預冷的70%乙醇洗兩次，12000rpm 離心10min，棄上清。
(10) 將DNA干燥(室溫放置2h)。
(11) 加5(^LTE溶解，-20°。冷凍保存備用。
實施例6:所述的檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測試劑盒，包括
組成成分用量及濃度為四種引物各為0.5^171 Opmol， dNTP為1.2nL/2.5mm， Taq DNA聚合酶為0.2pL/2.5U/nL， 10xbuffer為2,0pL含Mg2+15nM，雙純水為14.6^L。
SSCP檢測試劑去離子水，10%過硫酸銨，變性緩沖液，TEMED(四甲基乙二胺)， 聚丙烯酰胺(Acr: Bis = 39:1) ， 0LA-DQA2*L的DNA標準樣。
實施例7:所述的檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測試劑盒的使用方法，其步驟
為
(1)試劑盒中各組分與待檢測基因組DNAlnL/50ng混合，進行PCR擴增； 所述的PCR-SSCP擴增引物的擴增條件為
第一次第一組引物PCR反應條件預變性94。C2 min ，變性94'C30s ，退火 64。C30s，延伸72。C50s，共32個循環，最后72。C延伸5 min;
第二次第二組引物PCR反應條件預變性94。C2 min ,變性94。C30s ，退火 67。C30s，延伸72。C30s，共32個循環,最后72。C延伸5 min。
(2) 用步驟(1)中擴增的PCR產物和OLA-DQA2化標準樣與試劑盒中SCCP檢 測試劑各組分混合進行SSCP檢測；
(3) 步驟(2)中檢測到的帶型與試劑盒中OLA-DQA2化的DNA標準樣帶型一致
的樣品為攜帶腐蹄病抗性等位基因的個體。 實施例8:
一種檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的擴增引物，第一組引物上游長度為24bp的 核苷酸，下游長度為22bp的核苷酸，第二組引物上游長度為23bp的核苷酸，下游長度 為24bp的核苷酸，包括用于擴增OLA-DQA2基因第2外顯子的特異性引物，序列如下: 上游引物24bp: DQA2-up: CACATGTTACAGTGCAAAARCAGC 下游引物22bp: DQA2-dn CCCTCYCACCAACGTTTCCCAG 上游引物23bp: DQA2s陽up: ACTACCAATCTCATGGTCCCTCT 下游引物24bp: DQA2s-dn: GGAGTAGAATGGTG GACACTTACC 其中R=G，Y=T。其余步驟與實施例l相同。
序 歹U 表 SEQUENCE LISTING
<110>甘肅農業大學
<120>檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的特異性擴增引物及其檢測試劑盒和檢測方法
<130>
<160> 16
< 170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*A
<400> 1
actaccaatc tcatggtccc tctagcgagt acacccagga atttgacgaa gacgagctgc 60
tttatgtgga cctggagaag aaagagactg tctggcggct gcctatgttt ggccagtttg 120
caggttttca cattcaagtt gcactgagta acatagctac agagaaacac aacttggatg 180
tcatgactaa atggtacaac tttaccccag ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact 240
cc 242
<210> 2
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*B
<400> 2
actaccaatc tcatggtccc tctggccagt tcacccagga atttgacgga gatgagctgt 60
tttatgtgga cctggaaaag aaagagactg tctggcggct gcctatgttt agccagtttg 120
caggttttga ccctcaaggt gcactgagta acatagctgc agcgaaacac aacttggata 180
tcctgactaa acgctccaac tctaccccag ttatcaacgg taagtgtcca ccattctact 240
cc 242<210> 3
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*C
<400> 3
actaccaatc tcatggtccc tetggccagt acacccacga atttgatggg gacgagctgt tttatgtgga cctggggaag aaggagactg tctggcggct gcctatgttt ggtgaattca caagttttga cccgcaaggt gcactgagtg aaatagctaa agcaaaacaa accttggata tcatgattaa acgttccaac tttacccctg ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact cc
<210> 4
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*D
<400> 4
actaccaatc tcatggtccc tetggccagt acacccagga atttgatgga gacgagctgt tttatgtgga cctggggaag aaggagactg tctggaggct gcctatgttt agccagtttg caggttttga tccacagggt gcactgagtg aaatagctac agcaaaacaa aacttggata tcctgactaa acgctccaac tttacccctg ctatcaatgg taagtgtcca ccattctact cc
<210> 5
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*E
<400> 5
actaccaatc tcatggtccc tctagcgagt acacccagga atttgacgaa gaegagctge tttatgtgga cctggagaag aaagagactg tctggcggct gcctatgttt ggccagtttg caggttttca cattcaagtt gcactgagta acatagctac agcgaaacac aacttggatg tcatgactaa atggtacaac tttaccccag ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact<210> 6
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*F
<400> 6
actaccaatc tcatggtccc tctggccagt tcacccatga atttgatgga gacgagttgc tttatgtgga ccttgagaag aaggagactg tctggcggct gcctattttt ggtgaattaa caagttttga cccgcaaggt gcactgagta acatagctac agcgaaacac aacttggata tcctgactaa atgctccaat tgtaccccag ttatcaacgg taagtgtcca ccattctact cc
<210> 7
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*G
<400> 7
actaccaatc tcatggtccc tctagccagt acacccagga atttgatgga gacgaactgt tttatgtgga cctggagaag aaggagaccg tctggcggct gcctatgttt agccagtttg caggttttaa cattcaagat gcactgaata acatacctgc agcgaaacac aacttgggta tcctgactaa acgctccaac tttaccccag ttatcaacgg taagtgtcca ccattctact cc
<210> 8
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*H
<400> 8
actaccaatc tcatggtccc tctggccagt acacccacga atttgatggg gacgagctgt tttatgtgga cctggggaag aaggagactg tctggcggct gcctatgttt ggtgaattcacaagttttga cccgcaaggt gcactgagtg aaatagctac agcgaaacaa aacttggata 180
tcatgattaa acgttccaac tttacccctg ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact 240 cc 242
<210> 9 <211> 242 <212〉 DNA <213> OLA-DQA2*I <400> 9
actaccaatc tcatggtccc tctagcgagt acacccagga atttgacgaa gacgagctgc 60 tttatgtgga cctggagaag aaagagactg tctggcggct gcctatgttt ggccagtttg 120
caggttttca catccaagtt gcactgagta acatagctac agcgaaacac aacttggatg 180
tcaagactaa atggtacaac tttaccccag ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact 240 cc 242
<210> 10
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*J
<400> 10
actaccaatc tcatggtccc tctagcgagt acacccagga atttgacgaa gacgagctgc 60 tttatgtgga cctggagaag aaagaggctg tctggcggct gcctatgttt ggccagtttg 120
caggttttca cattcaagtt gcactgagta acatagctac agcgaaacac aacttggatg 180
tcatgactaa atggtacaac tttaccccag ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact 240 cc 242
<210〉 11
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*K
<400> 11<image>image see original document page 18</image><212〉 DNA
<213〉 OLA-DQA2*N
<400〉 14
actaccaatc tcatggtccc tctggccagt atatccactt atttgatgga gacgagcggt 60 tttatgtgga cctggagaag aaggagactg tctggcggct gcccatgtct ggtgaattaa 120
taagttttga cccacaaggt gcactgagta acgtagctgc atcgaaacac aacttggata 180
tcctgactaa acgctccaac tctaccccag ttatcaacgg taagtgtcca ccattctact 240 cc 242
<210> 15
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2+0
<400> 15
actaccaatc tcatggtccc tctggccagt acacccacga atttgatggg gacgagctgt 60 tttatgtgga cctggggaag aaggggactg tctggcggct gccaatgtct ggtgaattca120 caagttttga cccgcaaggt gcactgagtg aaatagctac agcgaaacaa aacttggata180 tcatgattaa acgttccaac tttacccctg ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact 240 cc 242
<210> 16
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*P
<400> 16
actaccaatc tcatggtccc tctggccagt tcacccagga atttgacgga gatgagctgt 60 tttatgtgga cctggaaaag aaagagactg tctgtcggct gcctatgttt agccagtttg 120
caggttttga ccctcaaggt gcactgagta acatagctgc agcgaaacac aacttggata 180
tcctgactaa acgctccaac tctaccccag ttaccaacgg taagtgtcca ccattctact 240 cc 24權利要求
1. 一種檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的特異性擴增引物，其特征是第一組引物上游長度為24bp的核苷酸，下游長度為22bp的核苷酸，第二組引物上游長度為23bp的核苷酸，下游長度為24bp的核苷酸，包括用于擴增OLA-DQA2基因第2外顯子的特異性引物，序列如下上游引物24bpDQA2-upCACATGTTACAGTGCAAAARCAGC；下游引物22bpDQA2-dnCCCTCYCACCAACGTTTCCCAG；上游引物23bpDQA2s-upACTACCAATCTCATGGTCCCTCT；下游引物24bpDQA2s-dnGGAGTAGAATGGTGGACACTTACC；其中R＝A或G，Y＝C或T。
2. 如權利要求1所述的檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的特異性擴增引物，其特征是 所述的PCR-SSCP擴增引物的擴增條件為第一次第一組引物PCR反應條件預變性94"C2 min ，變性94'C30s ，退火 64°C30s，延伸72。C50s,共32個循環，最后72'C延伸5 min;第二次第二組引物PCR反應條件預變性94'C2 min ，變性94'C30s ，退火 67°C30s，延伸72。C30s，共32個循環，最后72。C延伸5 min。
3. 如權利要求1所述的檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測試劑盒，其特征是組成成分用量及濃度為四種引物各為0.5tiL/10pmo1， dNTP為1.2pL/2.5mm， T叫 DNA聚合酶為0.2nL/2.5U^iL， 10xbuffer為2.0^L含Mg2+15pM，雙純水為14.6pL。SSCP檢測試劑去離子水，10%過硫酸銨，變性緩沖液，TEMED，聚丙烯酰胺， OLA-DQA2*L的DNA標準樣。
4. 如權利要求1所述的檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測方法，其特征是藏綿羊易感等位基因和抗性較強等位基因的確定步驟為(1) 收集表型正常和患腐蹄病藏綿羊基因組DNA;(2) 用上述特異性引物DQA2-up和DQA2-dn擴增步驟(1)中的DNA特異性片 段；(3) 用上述特異性引物DQA2s-up和DQA2s-dn擴增步驟(2)中的的PCR產物；(4) 用步驟(3)中的的PCR產物進行SSCP檢測；(5) 克隆、測序步驟(4)中產生的各等位基因序列；(6) 根據(4)的基因型判別結果，結合表型觀測資料，確定藏綿羊腐蹄病易感等位基因和抗性等位基因； (7)確定藏綿羊腐蹄病易感等位基因為OLA-DQA2*H，抗性等位基因為OLA-DQA2*L。
5. 如權利要求1所述的檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測方法，其特征在于，具體的 檢測步驟如下.-(1) 樣品采集采集表型正常和患腐啼病的藏綿羊，頸靜脈采血10ml， ACD抗凝，-20 'C凍存；(2) 基因組DNA的提取用常規的酚-氯仿抽提法從凍存血樣中提取基因組DNA;(3) 聚合酶鏈式反應20^L的反應體系，其成分用量及濃度為四種引物各為0.5^171 Opmol， dNTP為 1.2pL/2.5mm， TaqDNA聚合酶為0.2pL/2.5U4iL， 10xbuffer為2.0pL含Mg2+15nM，模 板DNA為lpL/50ng，雙純水為14.6pL;第一次第一組引物PCR反應條件預變性94。C2min ，變性94。C30s ，退火64。C30s， 延伸72。C50s，共32個循環,最后72'C延伸5 min;第二次第二組引物PCR反應條件預變性94'C2min ，變性94。C30s ，退火67。C30s， 延伸72'C30s，共32個循環，最后72。C延伸5min;DQA2-up和DQA2-dn的擴增產物大小為828bp， DQA2s-up和DQA2s-dn以DQA2-up 和DQA2-dn的擴增產物為模板的擴增產物大小為242bp。(4) PCR產物的SSCP檢測 取2^il的PCR產物加入8nI的上樣變性緩沖液，包括98。/。去離子甲酰胺、0.025%溴酚藍、0.025%二甲苯青、10mmol/LEDTApH8.0 ， 98 。C變性10min ，立即冰浴10min; 12% 的非變性聚丙烯酰胺凝膠，140V電壓條件下，4'C電泳19h ，銀染法顯色后拍照；(5) 結果判斷在藏綿羊DQA2基因第2外顯子上共發現16個(OLA-DQA2*A-OLA-DQA2*P) 等位基因，藏綿羊腐蹄病易感等位基因為0LA-DQA2*H，抗性等位基因為 0LA-DQA2*L。
6. 如權利要求1所述的檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測試劑盒的使用方法，其特征是具體的步驟為(1)試劑盒中各組分與待檢測基因組DNAl^L/50ng混合，進行PCR擴增； 所述的PCR-SSCP擴增引物的擴增條件為.-第一次第一組引物PCR反應條件預變性94'C2 min ，變性94'C30s ，退火64'C30s，延伸72'C50s，共32個循環，最后72。C延伸5 min;第二次第二組引物PCR反應條件預變性94。C2 min ，變性94i:30s ，退火67。C30s，延伸72。C30s，共32個循環,最后72'C延伸5 min。(2) 用步驟(1)中擴增的PCR產物和OLA-DQA2*L標準樣與試劑盒中SCCP檢測試劑各組分混合進行SSCP檢測；(3) 步驟(2)中檢測到的帶型與試劑盒中OLA-DQA2*L的DNA標準樣帶型一致的樣品為攜帶腐蹄病抗性等位基因的個體。
全文摘要
本發明主要涉及動物生物技術領域中的綿羊分子標記輔助育種技術，具體涉及到藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的檢測。一種用于檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的特異性擴增引物，其特征是第一組引物上游長度為24bp的核苷酸，下游長度為22bp的核苷酸，第二組引物上游長度為23bp的核苷酸，下游長度為24bp的核苷酸，上游引物24bpDQA2-upCACATGTTACAGTGCAAAARCAGC；下游引物22bpDQA2-dnCCCTCYCACCAACGTTTCCCAG；上游引物23bpDQA2s-upACTACCAATCTCATGGTCCCTCT；下游引物24bpDQA2s-dnGGAGTAGAATGGTGGACACTTACC。本發明對藏綿羊腐蹄病的分子標記選種具有快速、敏感性高、成本低等特點。
文檔編號C12N15/11GK101532061SQ20091013486
公開日2009年9月16日 申請日期2009年4月10日 優先權日2009年4月10日
發明者秀 劉, 王繼卿, 羅玉柱, 江 胡, 馬小軍 申請人:甘肅農業大學