專利名稱：普魯蘭糖無色素生產方法
技術領域：
本發明 涉及微生物發酵生產普魯蘭糖的方法。
背景技術：
普魯蘭糖(Pullulan)由出芽短梗霉分泌的一種易溶于水的微生物多糖，1939年 R-Baner首先在出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)的發酵液中發現一種黏性物 質，即普魯蘭糖。1959年Bender等首先表征了出芽短梗霉發酵產生的普魯蘭糖是由中性 葡萄糖組成，它是葡萄糖按α-1，4-糖苷鍵結合成麥芽三糖，兩端再以α-1，6_糖苷鍵反復 連接而成高分子多糖，是一種易溶于水、安全無毒害、可食用、低熱值的天然多糖，因其可塑 性、成膜性好、簿膜隔氣性佳，故常用其作為保色、保香、保鮮、抗氧化等的包裝材料。普魯蘭 糖可以廣泛的用做涂料或包裝材料；作為淀粉的替代者，它可以用作制作低熱量及保健食 品；同時可以廣泛用于化妝品行業；在醫藥行業，它可以作為黏合劑，增稠劑及膠囊囊材； 也可以作為生物絮凝劑用于污水處理；此外，普魯蘭糖在石油化工、農業、造紙等方面也有 較廣應用。普魯蘭糖的生產及應用已經有30多年的研究歷史，日本林原公司在70年代進 行中試規模工業化生產，至今一直壟斷國際市場。國內經過20年研究也有較大進展，但仍 存在較多問題，其中出芽短梗霉發酵過程中產生黑色素及底物糖的轉化率問題為制約工業 化生產的關鍵問題，而且發酵目前發酵生產普魯蘭糖的時間一般為120h左右，導致發酵效 率下降，目前國內外很多科研機構很難同時解決以上幾個問題，因此使得工業化過程相當 緩慢。本發明使用微波誘變法得到高產低色素突變菌株，利用該菌株生產普魯蘭糖，同 時在發酵過程中按發酵時間對攪拌速度及通氣量進行調控，增加普魯蘭糖的產量，減少色 素分泌，大大縮短了發酵時間，提高了普魯蘭糖的生產效率。
發明內容
微波誘變操作步驟a.菌懸液的制備將培養24h的出芽短梗霉用無菌生理鹽 水稀釋至IO6個/mL，b.吸取制得的菌懸液，注入底部平整的平皿中，每個平皿的懸液量為 10mL，調微波爐功率為700W，脈沖頻率為2450MHz，按不同的處理時間(一般小于Imin)，對 孢子懸液進行輻照處理，然后分別從每個平皿中取出0. ImL的菌懸液，進行適當稀釋，得到 不同稀釋度的菌懸液，c.吸取上述稀釋后的菌懸液0.3mL，涂布分離培養基平板，然后置于 30°C恒溫箱培養3d，活菌計數，計算致死率。以分離平板上菌落直徑的比值及菌落顏色作為 初篩標志，挑取比值大且顏色白的菌落在斜面上傳代3次，然后進行搖瓶發酵復篩。種子培養基及種子液制備a.種子培養基組成為蔗糖5% ；酵母膏0. 2% ；NaCl 0. 1% ；MgSO4 · 7Η20 0. 02% ；K2HPO4 · 3Η20 0. 63% ； (MM)2SO4O. 06%，初始 pH 6. 5。115°C滅 菌20min ；b.種子液制備將步驟(1)中所得出芽短梗霉突變菌株接種到裝有1/5種子培 養基的500mL三角瓶中，培養溫度28 士 1°C，搖床轉速250r/min，培養24 36h，種子濃度 0. 8 2. 5 X IO8個/mL，作為一級種子，將一級種子按2 % 10 %接入種子培養基，逐級擴大至適合相應接種量，作為發酵種子液。發酵培養基制備及發酵控制發酵生產所用培養基為蔗糖10% ；酵母膏0. 2% ； NaClO. 1% ；MgSO4 · 7H20 0. 02% ；K2HPO4 · 3H20 0. 63% ； (MM)2SO4O. 06%，初始 pH 6. 5。按 2% 10%接種量將種子液接入發酵培養基，培養溫度28士 1°C，罐壓0. 01 0. 05Mpa。發 酵前24h，攪拌速度150 240r/min，通氣量1 2L/min。24h以后菌體濃度達到1. 5
2.5 X IO8個/mL，調攪拌速度到400 650r/min，通氣量3 5L/min。48h以后， 攪拌速度 調為200 300r/min，通氣量5 8L/min，直至發酵結束。發酵液下游處理工藝(1)發酵液脫色發酵液加入0. 1 0. 8%活性炭，調pH至
3.0 4. 0，加熱至65 85°C，攪拌15 30min ；攪拌結束后靜置10 20min ； (2)過濾除 菌使用150 500目的過濾板進行過濾，其中加入的助濾劑可以為珍珠巖、硅藻土或活性 漂土等；(3)超濾濃縮使用管式、螺旋卷式、中空纖維式等類型的超濾設備進行超濾濃縮， 得到濃縮后糖液；(4)噴霧干燥使用旋轉式、壓力式、氣流式等噴霧干燥設備對濃縮后糖 液進行噴霧干燥，得到粉末狀普魯蘭多糖產品。具體實施方法實施例一 30L發酵罐發酵及下游處理種子培養基蔗糖5%;酵母膏 0. 2% ；NaCl 0. 1 % ；MgSO4 · 7H20 0. 02 % ； K2HPO4 · 3Η200· 63% ； (MM)2SO4O. 06%，初始 ρΗ 6. 5。115°C滅菌 20min。發酵生產所用培養基為蔗糖10% ；酵母膏0.2% ;NaCl 0. 1 % ；MgSO4 · 7H20 0. 02% ；K2HPO4 · 3H20 0. 63% ； (MM)2SO4O. 06%，初始 pH 6. 5。種子液培養將中所得出芽短梗霉突變菌株接種到裝有1/5種子培養基的500mL 三角瓶中，培養溫度28士 1°C，搖床轉速250r/min，培養24h，種子濃度2. OX IO8個/mL，作 為一級種子，將一級種子按2%接種量將菌種接入裝有1/5種子培養基的500mL三角瓶中， 培養溫度28士 1°C，搖床轉速250r/min，培養24h作為二級種子液。30L發酵罐發酵按2%接種量將種子液接入含有20L發酵培養基的30L發酵罐 中，培養溫度28 士 1°C，罐壓0.03Mpa。發酵前24h，攪拌速度180r/min，通氣量lL/min。24h 以后菌體濃度達到1. 8X IO8個/mL，調攪拌速度到500r/min，通氣量4L/min。48h以后，攪 拌速度調為230r/min，通氣量6. 5L/min，繼續發酵12h，發酵結束，糖轉化率為68%。發酵液下游處理a.若發酵液顏色較深則進行發酵液脫色發酵液加入0. 2%活 性炭，調pH至3. 5，加熱至70°C，攪拌20分鐘；攪拌結束后靜置20min ；b.過濾除菌使用 200目的過濾板進行過濾，其中加入質量分數為3%的珍珠巖作為助濾劑進行過濾除菌； c.超濾濃縮使用陶瓷膜超濾系統進行超濾濃縮，得到濃縮后糖液；d.噴霧干燥離心噴 霧干燥設備對濃縮后糖液進行噴霧干燥，得到粉末狀普魯蘭多糖產品。普魯蘭多糖得率為 89%。實施例二 Im3發酵罐發酵及下游處理種子培養基蔗糖5%;酵母膏 0. 2% ；NaCl 0. 1 % ；MgSO4 · 7H20 0. 02 % ； K2HPO4 · 3Η200· 63% ； (MM)2SO4O. 06%，初始 ρΗ 6. 5。115°C滅菌 20min。發酵生產所用培養基為葡萄糖10% ；酵母膏0.2% ;NaCl 0. 1 % ；MgSO4 · 7H20 0. 02% ；K2HPO4 · 3H20 0. 63% ； (MM)2SO4O. 06%，初始 pH 6. 5。種子液培養將中所得出芽短梗霉突變菌株接種到裝有1/5種子培養基的500mL三角瓶中，培養溫度28 士 1 °C，搖床轉速250r/min，培養24min，種子濃度2. O X IO8個/mL，作 為一級種子，將一級種子按2%接種量將菌種接入裝有1/5種子培養基的500mL三角瓶中， 培養溫度28士 1°C，搖床轉速250r/min，培養24h作為二級種子液。按2%接種量將二級種 子液接入含有20L種子培養基的30L發酵罐中，培養溫度28 士 1 °C，罐壓0. 03Mpa,攪拌速度 180r/min,通氣量lL/min，培養24h，作為三級種子。Im3發酵罐發酵按2%接種量將種子液接入含有700L發酵培養基的Im3發酵罐 中，培養溫度28士 1°C，罐壓0.03Mpa。發酵前24h，攪拌速度180r/min，通氣量lL/min。24h 以后菌體濃度達到1. 8X IO8個/mL，調攪拌速度到450r/min，通氣量4L/min。48h以后，攪 拌速度調為250r/min，通氣量6. OL/min,繼續發酵12h，發酵結束，糖轉化率為67 %。
發酵液下游處理a.若發酵液顏色較深則進行發酵液脫色發酵液加入0. 2%活 性炭，調pH至3. 5，加熱至70°C，攪拌20min ；攪拌結束后靜置20分鐘；b.過濾除菌使用 200目的過濾板進行過濾，其中加入質量分數為3%的珍珠巖作為助濾劑進行過濾除菌； c.超濾濃縮使用陶瓷膜超濾系統進行超濾濃縮，得到濃縮后糖液；d.噴霧干燥離心噴 霧干燥設備對濃縮后糖液進行噴霧干燥，得到粉末狀普魯蘭多糖產品。普魯蘭多糖得率為 88%。 實施例三IOm3發酵罐發酵及下游處理種子培養基蔗糖5%;酵母膏 0. 2% ；NaCl 0. 1 % ；MgSO4 · 7Η20 0. 02 % ； K2HPO4 · 3Η200· 63% ； (MM)2SO4O. 06%，初始 ρΗ 6. 5。115°C滅菌 20min。發酵生產所用培養基為蔗糖10% ；酵母膏0.2% ;NaCl 0. 1 % ；MgSO4 · 7H20 0. 02% ；K2HPO4 · 3Η20 0. 63% ； (MM)2SO4O. 06%，初始 pH 6. 5。種子液培養將中所得出芽短梗霉突變菌株接種到裝有1/5種子培養基的500mL 三角瓶中，培養溫度28士 1°C，搖床轉速250r/min，培養24h，種子濃度2. OX IO8個/mL，作 為一級種子，將一級種子按2%接種量將菌種接入裝有5L種子培養基的8L發酵罐中，培 養溫度28 士 1°C，罐壓0. 03Mpa,攪拌速度180r/min，通氣量lL/min，培養24h作為二級種 子液。按2%接種量將二級種子液接入含有200L種子培養基的300L發酵罐中，培養溫度 28 士 1°C，罐壓0. 03Mpa，攪拌速度180r/min，通氣量lL/min，培養24h，作為三級種子。IOm3發酵罐發酵按2%接種量將種子液接入含有7000L發酵培養基的IOm3發酵 罐中，培養溫度28士 1°C，罐壓0.03Mpa。發酵前24h，攪拌速度150r/min，通氣量lL/min。 24h以后菌體濃度達到2. OX IO8個/mL，調攪拌速度到380r/min，通氣量4L/min。48h以后， 攪拌速度調為200r/min，通氣量6. OL/min,繼續發酵12h，發酵結束，糖轉化率為69 %。發酵液下游處理a.若發酵液顏色較深則進行發酵液脫色發酵液加入0. 2%活 性炭，調PH至3.5，加熱至701，攪拌201^11 ；攪拌結束后靜置20min ；b.過濾除菌使用200 目的過濾板進行過濾，其中加入質量分數為3%的珍珠巖作為助濾劑進行過濾除菌；c.超 濾濃縮使用陶瓷膜超濾系統進行超濾濃縮，得到濃縮后糖液；d.噴霧干燥離心噴霧干燥 設備對濃縮后糖液進行噴霧干燥，得到粉末狀普魯蘭糖產品。普魯蘭糖得率為90%。
權利要求
普魯蘭糖無色素生產方法，其特征在于由以下步驟組成(1)按2％～10％接種量將活化后菌種接到種子培養基中培養，得到種子液體；(2)按2％～10％接種量將種子液接到發酵培養基，在發酵的不同階段調節攪拌速度及通氣量，發酵60～72h，得到發酵液；(3)發酵液經過下游處理工藝得到普魯蘭糖。
2.權利要求1所述的方法，其中，步驟(1)中的活化后菌種為出芽短梗霉經過微波誘變 所得。
3.權利要求1所述的方法，其中，步驟(2)中發酵培養基的組成為碳源10%、酵母膏 0. 2%,NaCl 0. l%,MgS04 '7H20 0. 02%、K2HP04 3H20 0. 63%、(NH4)2S040 . 06%，其余為水， 初始pH 6.5。
4.權利要求1所述的方法，其中，步驟(1)的培養溫度為28士1°C，培養時間為24 36h，種子濃度0.8 2. 5X108個/mL;步驟(2)的培養溫度為28士 1°C，罐壓0.01 0.05Mpa。
5.權利要求1所述的方法，其中，步驟(2)中的攪拌速度及通氣量為發酵前24h，攪拌 速度150 240r/min，通氣量1 2L/min ；24h以后菌體濃度達到1. 5 2. 5X108^/mL, 調攪拌速度到400 650r/min，通氣量3 5L/min ；48h以后，攪拌速度調為200 300r/ min，通氣量5 8L/min，直至發酵結束。
6.權利要求1所述的方法，其中，步驟(3)中下游處理工藝包括發酵液脫色、過濾除菌、 超濾濃縮和噴霧干燥。
7.權利要求6所述的方法，其中，發酵液脫色方法為發酵液加入0.1 0.8%活性炭， 調pH至3. 0 4. 0，加熱至65 85°C，攪拌15 30min ；攪拌結束后靜置10 20min ；過 濾除菌的方法為使用150 500目的過濾板進行過濾，其中加入助濾劑珍珠巖、硅藻土和 /或活性漂土 0 適量；超濾濃縮的方法為使用管式、螺旋卷式、中空纖維式等類型的超濾 設備進行超濾濃縮；噴霧干燥的方法為使用旋轉式、壓力式或氣流式等噴霧干燥設備進 行噴霧干燥。
8.權利要求2所述的方法，其中，微波誘變的方法為(1)菌懸液的制備將培養24h的出芽短梗霉用無菌生理鹽水稀釋至106個/mL；(2)吸取制得的菌懸液，注入底部平整的平皿中，每個平皿的懸液量為10mL，調微波爐 功率為700W，脈沖頻率為2450MHz，按不同的處理時間(一般小于lmin)對孢子懸液進行輻 照處理，然后分別從每個平皿中取出0. lmL的菌懸液，進行適當稀釋，得到不同稀釋度的菌 懸液；(3)吸取上述稀釋后的菌懸液0.3mL，涂布分離培養基平板，然后置于30°C恒溫箱培養 3d，以分離平板上菌落直徑的比值及菌落顏色作為初篩標志，挑取比值大且顏色白的菌落 在斜面上傳代3次，然后進行搖瓶發酵復篩。
全文摘要
本發明涉及到普魯蘭糖無色素發酵生產方法，本發明以出芽短梗霉為出發菌株，經微波誘變，得到高產普魯蘭糖且色素分泌少的突變菌株；普魯蘭糖的發酵生產包括以下幾個步驟(1)種子及發酵培養基的制備；(2)將活化后菌種按2％～10％接種量將菌種接到種子培養基，28±1℃培養24～36h，種子濃度0.8～2.5×108個/mL；(3)按2％～10％接種量將種子液接到發酵培養基，罐壓0.01～0.05Mpa，溫度28±1℃，在發酵的不同階段調節攪拌速度及通氣量，發酵60～72h；(4)發酵液后處理工藝發酵液脫色、板框過濾、糖液用陶瓷膜超濾等方法進行超濾濃縮，噴霧干燥，最后得到普魯蘭糖產品。
文檔編號C12P19/10GK101942493SQ20091014876
公開日2011年1月12日 申請日期2009年7月3日 優先權日2009年7月3日
發明者候重文, 凌沛學, 劉飛, 張曉元, 朱希強, 李海軍, 李霞, 相茂功, 蘇移山, 郭學平, 陳勉, 顏震 申請人:山東省生物藥物研究院