水稻人工miRNA基因干涉載體快速構建方法

專利名稱：：水稻人工miRNA基因干涉載體快速構建方法
技術領域：
：本發明涉及水稻人工miRNA基因干涉載體快速構建方法，尤其涉及水稻快速沉默載體改造用DNA序列和該DNA序列的合成方法以及采用該DNA序列用于建立高效的水稻人工miRNA基因干涉載體。
背景技術：
：現有的方法構建水稻基因沉默載體以OverlappingPCR為核心，通過PCR替換水稻Os-amiR528的方法構建水稻基因沉默載體(Warthmannetal.,2008)。現有方法針對單個沉默載體構建需采用四條帶有沉默相關序列的PCR引物，和兩條公共弓I物配合，對pNW55載體進行擴增，對擴增獲得的3段DNA片段進行回收，再進行融合PCR，連入T載體，酶切后再連入轉化載體，最終獲得轉基因用的沉默載體。方法具體分為四個步驟第一步,通過針對每個不同的基因干涉設計合成4條長度為40bp的引物,合成兩條公共的引物組合，用于和基因特異引物組合擴增沉默相關的DM片段。第二步，通過4條基因特異的沉默引物和兩條公共引物祝賀，分別擴增獲得三段長度為256bp，259bp，87bp的DNA片段，通過電泳分離DNA片段，切割含目標大小DNA的凝膠,進行DNA片段回收。第三步，將回收得到的三段PCR產物混合,再用兩條公共進行融合PC:R，獲得長度為554bp的DNA片段，通過電泳分離DNA片段，切割含目標大小DNA的凝膠，進行DNA片段回收。第四步,將回收后的554bp片段連接到T載體或其他中間載體，通過連接、轉化獲得攜帶有相應載體的大腸桿菌菌落，擴增菌體后，抽取帶有沉默片段的中間載體，再采用限制性內切酶進行酶切，獲得有粘性末端的DNA片段，再和目標載體進行連接，通過連接、轉化獲得攜帶有轉化載體的大腸桿菌菌落，測序檢測正確后，用于農桿菌轉化。現有方法構建載體需要四個大的步驟,且每個步驟操作的內容又相當繁瑣，需要實驗人員具有一定的分子生物學操作基礎。本專利涉及的方法只需要兩個步驟,并且每個步驟操作也非常簡單，具有簡單分子生物學基礎的實驗人員也能快速,準確的完成載體構建任務。專利內容為了解決上述的存在的技術缺陷,本發明的第一個目的是提供水稻快速沉默載體改造用DNA序列及其合成方法，本發明的第二個目的是提供用于高效構建水稻基因沉默載體的載體及其制備方法，本發明的第三個目的是提供水稻基因沉默載體及其制備方法。本發明簡化了單個沉默載體構建的方法，加速了構建過程,提高了載體構建的效率。為了實現上述的第一個目的，本發明采用了以下的技術方案水稻快速沉默載體改造用DNA序列，該DNA序列包括如SEQIDNO:1所示的DNA序列，SEQIDNO:1所述如下CagC￡igC￡lgCCaC￡lgCa;:l￡iatttggtttggg￡lt￡lggtaggtgtt￡ltgtt￡lggtctggttttttggCtgt.agcagcagcgctgctaggctgttctgt.ggaagttt.gcagagtttatat.tatgggtt.taatcgtccatggcat.cagcatcagcagc;其中，agcgct部分為Afel酶切位點。作為優選，所述的水稻快速沉默載體改造用DM序列，該DM序列如SEQIDNO:2所示，SEQIDNO:2所述如下:tcGAGCTCcagcagcagccacagcaaaattt.ggttt.gggat.aggtaggtgt.tat.gttaggtctggttttt.tggct.gtagcagcagcgctgctaggctgt.tct.gtggaagt.ttgcagagtttat.att.atgggtttaatcgtccat.ggcatcagcatcagcagcGGTACCga;其中，tcGAGCTC和GGTACCga部分為克隆位點和保護堿基，agcgct部分為Afel酶切位點。上述的水稻快速沉默載體改造用DNA拼接方法合成，該方法采用水稻0s-amiR528DNA基因沉默序列作為基礎，序列如SEQIDNO:3所示，將水稻此序列分成首片段、尾片段和核心沉默片段(如圖2所示)，通過PCR擴增并融合首片段和尾片段,然后用于快速基因沉默載體改造。SEQIDNO:3所述如下C￡lgC￡lgC￡lgCC￡lCagCa￡iaatt.tggtttggg￡lt￡lggt￡lggtgtt￡ltgt.taggtct.ggt.tttt.tggCtgtElgCElgC&lgC&lgtggaaggggCa/tgCElgElgg&lgC&lggagElttCElgtttgElElgCtggElCttcacttttgCCtctctctCctgtgcttgcctcttccattcctgctgctaggctgttctgtggaagtttgcagagtttatattatgggtttaatcgtccatggcat.cagcatcagcagc首片段如SEQIDNO:5，SEQIDNO:5所述如卜':CagCagC￡lgCCaC￡lgC￡l￡l￡:l￡ltttggtttgggat￡lggt￡lggtgttatgtt￡lggtctggttttttggCtgtagcagcagc:尾片段，SEQIDNO:6，SEQIDNO:6所述如下gctgctaggctgttctgtggaagtt.tgcagagttt.atattat.gggttt.aatcgtccat.ggcatcagcatC￡lgC￡lgCs通過序列分析和設計，使得其中首片段由AGC位點結尾，而干涉尾片段由GCT位起始。這樣首片段、尾片段拼接獲正好獲得得-個包含Afel酶切位點的沉默載體改造用DNA序列，同時首片段的前端和尾片段的尾端包含了酶切位點及相應的保護堿基，用以酶切并連接改造的目標載體(如圖3a所示)。作為優選，上述的水稻快速沉默載體改造用I)NA序列的合成方法，包括以下的步驟①引物合成合成7條引物，序列如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>前片段:②采用分歩分段合成改造片段采用分步合成的方法合成此片段，amiR-Fl、amiR-Afel、amiR-Rl和amiR-R2合成amiR-F4、amiR-Afel:、amiR-R2和araiR-R4-G-:R-Kpn]:合成尾片段；作為再優選，合成前段和后段PCR體系濃度和反應條件為<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>③改造片段的拼接分別稀釋100倍，再采用G-F-Sacl和amiR-R4-G-R-Kpnl引物用融合兩段PCR物，合成帶有完整改造片段的DNA鏈；作為再優選，相應PCR體系濃度和反應條件為<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>完成后，用于改造水稻快速基因沉默片段序列如SEQIDNO:1所示。為了實現上述的第二個目的，本發明采用了以下的技術方案用于高效構建水稻基因沉默載體的載體，該載體含有如SEQIDNO:1或如SEQIDNO:2所示I)NA序列的基因片段。上述的用于高效構建水稻基因沉默載體的載體的制備方法,該方法包括以下的步驟①載體改造片段與目標載體的連接采用SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示DNA序列的基因片段，再采用Sac]:和Kpnl內切酶酶切，如果目標載體的采用其他的多克隆位點，則應在引物設計時，修改酶切位點，并在此處用相應的內切酶進行酶切，然后連入未修改的目標載體；優選的連接體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>混合好后的連接體系在16t;水浴過夜；②改造完成的目標載體轉化大腸桿菌取連接產物5ul,加入lOOu1的CaCl2處理的DII5a熱擊感受態，42°C熱擊處理90秒，加入8()0ul的LB無抗培養基，在37。C用25()rpm復蘇1小時；在無菌條件下，取l(X)ul涂布在含有50ug/ml卡那霉素的LB培養平板上，37。C培養培養16小時，挑選轉化子，接入LB重新培養后送測序確認；測序正確的菌采用25%甘油凍存，以備長期使用。為了實現上述的第三個目的，本發明采用了以下的技術方案水稻沉默載體，該載體含有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示DNA序列的基因片段。上述的水稻沉默載體的快速構建方法，該方法包括以下的步驟①質粒準備及線性化將上述獲得的用于高效構建水稻基因沉默載體的載體搖菌擴增,采用質粒抽提試劑盒進行質粒DNA抽提，然后用Afel酶切質粒；酶切體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>在37。C下酶切過夜,酶切后的DNA采用1%瓊脂糖凝膠電泳，用溴乙錠染色后在紫外燈下切膠，采用凝膠回收試劑盒回收酶切產物；線性化后的載體為通用載體片段，可用于所有快速沉默載體的構建，可在_20^下長時間保存備用。②橋接片段的合成合成橋接片段的引物兩條，序列如下歹/激咨癡'引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>將引物稀釋到100uM,分別取5ul，95。C處理5分鐘，自然冷卻退火到室溫狀態；稀釋l()()倍備用；本橋接片段為通用片段,可用于所有快速沉默載體的構建，可在-20"C下長時間保存備用。③核心沉默片段的擴增為每個基因分別合成基因沉默相關片段引物兩條首先，在http:〃wmd2.weigelworld.org/設計人工miRNA序歹lj(Warthraannetal.，2008)。將設計獲得的人工miRNA片段，在兩頭增加AG和CAGGAGATTCAGTTTG形成基因wi-Primerl;人工miRNA片段將12位禾口16位進行G_C，A_T顛換，再在兩頭增加AGGAA和AGAGAGGCAAAAGTG,形成wi-Primer2。如下表，黑色表示人工miRNA片段，灰色部分表示添加的序列，下劃線表示需進行顛換的位點。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>取lu:[橋接片段，采用基因特異引物進行PC:R擴增，優選的擴增條件如下<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>④核心沉默片段與載體的連接無需進行回收，直接將擴增獲得的片段PCR產物直接和已經線性化的載體相連接，優選的連接體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>混合好后的連接體系在16°C水浴過夜。⑤轉化大腸桿菌菌株⑥基因沉默載體的檢測由于采用了平末端連接，必須挑選方向正確的連接轉化子，為提高測序命中效率，同時排除載體自連的情況。轉化子進行測序前,首先需進行菌液PCR。為此,需合成兩條檢測用引物<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>將連接后的平板，挑選克隆搖菌，過夜培養后，取lul進行菌液PCR檢測。液PCR檢測體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>PCR確認的陽性克隆即可初步判斷為轉化克隆，為確認這一結果，送2個陽性克隆進行測序。按本專利方法操作，陽性克隆測序后正確率在85%以上。本專利對水稻轉基因的目標載體進行了改造,極大的簡化了實驗流程,只需進行一次常規PCR反應,一個連接就能完成基因沉默載體的構建，將載體構建的時間從9天縮短到了4天，且由于實驗操作非常簡單，可以同時開展多個基因的干涉載體構建工作。本專利方法針對單個特定基因的沉默載體構建，僅需要設計合成兩條沉默相關引物；并且只采用常規的PCR方法，極大的減小了因OverlappingPCR導致DM擴增出錯的概率；在PCR完成后，由于沒有質粒背景的干擾，無需進行電泳回收I)NA片段，減少了電泳及回收操作過程中試劑的消耗,進一步節省了實驗成本和實驗時間。另外本專利方法的重要特點是，采用本方法構建的沉默載體和采用現有方法構建的沉默載體完全一致，下游轉基因研究完全不受此方法改進的影響。下面通過與現有方法比較，說明本發明的有益效果現有方法和本專利方法流程比較表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>從....匕述的表格可以看出，本專利所述方法，不僅能夠有效的縮短水稻基因沉默載體構建的時間，還能大量的節省相關試劑耗材。和現有方法相比，本專利構建單個沉默載體的方法，不但需要的試劑耗材種類少，所消耗的試劑量也大為減少。除表1所列外，現有方法中針對每個沉默載體構建需要合成4條引物，采用本專利方法，每個沉默載體構建僅需要兩條引物，從而也減少了因引物合成的錯誤導致載體構建失敗的概率。從表1中我們還能看出，使用本專利能大大縮短載體構建時間，現有方法約需要9天才能完成載體構建，本專利方法只需要4天就能完成。而且在操作過程中，現有方法需要消耗實驗人員大量的精力，整體過程中，大約需要占用20多個小時實驗時間，而本方法僅占用9小時實驗時間，且其中主要為PCR和連接時間，實驗員完全可以同時開展其他工作。綜上所述,本專利方法具效益高，能夠極大縮短實驗時間，降低單個沉默載體的改造成本。同時，由于本方法簡便易行，操作方便，使得單個實驗員能同時開展多個沉默載體改造。圖1為目標載體改造及核心沉默載體片段示意圖。圖2為載體改造片段的合成模式圖。圖3為水稻基因沉默載體快速構建方法示意圖。具體實施例方式實施例1改造pCAMBIA1300載體用于快速沉默載體構建[翻]1、代改造轉化載體的準備為提高本專利適用性,特別強調一起說明目標載體改造的方法，以提供給本發明的使用者參考，在需要時可用于改造其它目標載體。為了將首尾批段放入載體中，且能夠進行酶切線性化，我們首先采用改造過的pCAMB]:A13()0載體為初始載體，該中連有Ubiqitin啟動子和rbcs終止子，可作為啟動和終止水稻沉默片段的元件，該載體簡稱為1300UR載體。首先，采用Sacl和Kpnl內切酶對其進行酶切，在37tr下'酶切過夜，酶切后的DNA采用1%瓊脂糖凝膠電泳,用溴乙錠染色后在紫外燈下切膠，采用凝膠回收試劑盒回收酶切產物。產物儲存在-2()'C備用。2、改造片段相關引物的合成按本專利方法改造轉化載體，我們合成7條引物，用于改造1300UR載體，引物序列如下<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>3、采用分步分段法合成含有Afel酶切位點的改造片段按專利的說明，分步合成的方法合成此片段，amiR-Fl、amiR-Afel、amiR-Rl和amiR-R2合成首片段，amiR-F4、amiR-Afel、amiR-R2和amiR-R4-G-R-Kpnl合為尾片段，如圖2所示。合成前段和后段PCR體系濃度和反應條件為<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>4、融合兩段PCR產物獲得完整改造片段將獲得的兩段PCR產物分別稀釋100倍，再采用G-F-Sacl和amiR-R4-G-R-Kpnl引物用融合兩段產物，合成帶有酶切位點的完整改造片段。PCR體系濃度和反應條件為<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>5、造片段與1300UR載體的連接采用凝膠回收試劑盒回收DNA片段，在采用Sacl和Kpnl內切酶酶切，連的目標載體。連接體系如下未修改<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>混合好后的連接體系在16°C水浴過夜。6、轉化大腸桿菌取連接產物5ul，加入100ul的CaCl2處理的DH5a熱擊感受態，42。C熱擊處理90秒，加入800ul的LB無抗培養基，在37t:用250rpm復蘇1小時。在無菌條件下，取100ul涂布在含有50ug/ml卡那霉素的LB培養平板上，37。C培養16小時，挑選轉化子，接入LB重新培養后送測序確認。測序正確的菌采用25%甘油凍存，以備長期使用。改造后載體序列見SEQIDNO:4。實施例2用本專利方法快速構建5個水稻基因沉默載體1、沉默載體的快速構建的準備工作(1)質粒準備及線性化按照實施例1得到的載體搖菌擴增，采用質粒抽提試劑盒進行1300URA質粒DNA抽提，用Afel酶切，酶切體系如F<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>在37。C下酶切過夜,酶切后的DNA采用1%瓊脂糖凝膠電泳，用溴乙錠染色后在紫外燈下切膠，采用凝膠回收試劑盒回收酶切產物。線性化后的載體為通用載體片段，可用于所有快速沉默載體的構建，可在_20^下長時間保存備用。(2)橋接片段的合成按本專利方法合成橋接片段的引物兩條,序列如下<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>將引物稀釋到100uM，分別取5ul，95。C處理5分鐘，自然冷卻退火到室溫狀態。稀釋100倍備用。本橋接片段為通用片段，可用于所有快速沉默載體的構建，可在-2()。C下長時間保存備用。2、核心沉默片段的擴增如下(1)核心沉默片段的擴增針對每個基因合成基因沉默相關片段引物兩條，5個基因的擴增片段分別為分激，agTTAAGAGTAAGACGCTCGCGTcaggagattcagtttg鄉aaTTAAGAGTAAGTCGCACGCGTagagaggcaaaagtgagTAAA丌CGATAG丌CCCGCGTcaggagattcagtttgaggaaTAAATTCGATACTTCGCGCGTagagaggcaaaagtgagTTAACAGAAAGGTTGAACCTCcaggagattcagtttgaggaaTTAACAGAAAGCTTGTACCTCagagaggcaaaagtgagTCAACTTAATACTAAAGCCTGcaggagattcagtttgaggaaTCAACTTAATAGTAATGCCTGagagaggcaaaagtg謹7-06gf柳0-fagTAATTATCGTACGTTTTGCTAcaggagattcagtttgaggaaTAATTATCGTAGGTTATGCTAagagaggcaaaagtg針對每個基因，分別取lul橋接片段，采用基因特異引物進行PCR擴增，擴增條件"，J7入:'3濃度35.5ul5.0ult/W7"P5.0ul2.5mMeach0.5ul橋麥力'皮2.0ul50uMPr/mef1.0ul10mMPf/mer21.0ullOmM凝度蘇95'C2min/95°C30"5S'C30"34cycles72°C40'，72。C7min/16°Cforevsr/(2)核心沉默片段與載體的連接無需進行回收，直接將擴增獲得的片段PC:R產物直接和已經線性化的載體相連接，連接體系如下1300ura-Afel載體0.5ul(10ng)NEBLigationBuffterlulNEBT4DNALigaselul擴增獲得的DNA片段7.5ul16入培養基排除載引物混合好后的連接體系在16"C水浴過夜。(3)轉化大腸桿菌菌株本專利推薦使用常規的DII5a菌株進行連接片段的轉化工作。取連接產物5ul，加的CaCl2處理的:[)H:5a熱擊感受態菌，42。C熱擊處理90秒，加入80()ul的LB無抗，在37。C用250rpm復蘇1小時。在無菌條件下，取100ul涂布在含有50ug/ml卡那LB培養平板....匕37。C培養培養16小時，挑選轉化子，接入LB重新培養。3、基因沉默載體的檢測(1)檢測引物的合成由于采用了平末端連接，必須挑選方向正確的連接轉化子，為提高測序命中效率,體自連的情況。轉化子進行測序前，首先需進行菌液PCR。為此，需合成兩條檢測用<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>(2)菌液PCR檢測將連接后的平板，挑選克隆搖菌，過夜培養后，取lul進行菌液PCR檢;檢測體系如下菌液PCR<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>PCR確認的陽性克隆即可初步判斷為轉化克隆，為確認這-一結果,送2個陽性克隆(3)測序檢測五個含有LR:R結構域的基因，菌液PC:R檢測完成后，每個基因的沉默載體，分別送兩個PCR陽性克隆進行測序，經測序結果檢測顯示,5個載體均得到正確的克隆，其中4個載體送測的兩個克隆正確，另外一個載體送測的載體有一個克隆存在點突變。故構建此5個基因沉默載體最終測序陽性率為90%。序列表〈110〉浙江省農業科學院〈120〉水稻人工miRNA基因干涉載體快速構建方法〈160>20〈210>1〈211〉154<212〉[)NA〈213〉人工合成〈222〉(1)…(154)〈400〉11cagctigcagcca￡a_gctia_a_gitttggtttgggataggtaggtgttatgttfiggtctggttt61tttggctgtegcagcagcgctgctaggctgt.tctgtggaagttt.gcagagtttatattat121gggttt.aatcgtccatggcatcagcatcagcage〈210〉2〈211)170〈212>DNA〈213〉人工合成〈222〉(1)…(170)〈4()()〉21tcGAGCTCcagcagcagcca61tctggttttttggctgt.agc121tatattatgggttt組cgt<210>3〈211>245〈212〉DNA〈2丄3〉人工合成〈222>(1)"'(245)〈400>31cagcagcagccacagcaaaa61t:ttggctgtagcagcagcag121ctggacttcacttttgcctc181gttct.gtggaagtttgcaga241gcagc〈2丄0〉4〈21〗〉11761〈212>DNA<213>人工合成〈222〉(l)",(11761)18ageagegctgcctitggcatctggttt.gggactaggctgttEigctitcagctitaggtaggtgct.gtgg朋gtgcGGTACCga.ttat.gttaggttgcagagtttttggttt.ggtgg朋ggggctctctcctgtgtttatattagateggteggEltgCflgtlgg8gcttgcctcttgggtttaattgttat.gttagC￡lgg￡lgatttccattcctgcgtccatggcggtctggtttca.gtttgaagctgetaggetat.cagcatca〈400>41aattgggctgcagtgcagcgtgacccggtcgtgcccctctcteg3gateatgagceittgc61atgtcteagttataaaaaattttttttgtcacacttgttt121ttatctatctttatacatatatttaaactttactctacgactategtect181acaataat.atcagtgttttagtteg'3catg241caattgagtettttgacaacaggactctecagttttatctttttegtgtgcatgtgttct301cctttttttttgca祉itegcttcacctetetccattttattegtecatcc361atttagggtttagggttaatggtttttetagactaatttttttagtacatctattttatt421ctat.tttagcctctaaattaaactctattttagttttttt481ttagatataaaatagaataaaacaaat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GAGAGGCAAAAGTG，形成wi-Primer2，取lul橋接片段，采用基因特異引物進行PCR擴增；④核心沉默片段與載體的連接無需進行回收，直接將擴增獲得的片段PCR產物直接和已經線性化的載體相連接，混合好后的連接體系在16t:水浴過夜；⑤轉化大腸桿菌菌株取連接產物5u:l,加入l()()ul的CaC:[2處理的D:H5a熱擊感受態菌，42。C熱擊處理9()秒，加入800ul的LB無抗培養基，在37"C用250rpm復蘇1小時；在無菌條件下，取100ul涂布在含有50ug/ml卡那霉素的LB培養平板....匕37"C培養培養16小時，挑選轉化子，接入LB重新培養；⑥基因沉默載體的檢測檢測引物的合成，需合成兩條檢測用引物微部'引物序列ATTTTTTTAGCCCTGCCTTCAGAGAGGCAAAAGTGAAGTCC菌液PCR檢測，將連接后的平板，挑選克隆搖菌，過夜培養后，取lul進行菌液PCR檢測。PC:R確認的陽性克隆即可初步判斷為轉化克隆。10.水稻快速基因沉默載體，其特征在于該載體由權利要求8或9所述的方法構建獲得。全文摘要本發明涉及水稻人工miRNA基因干涉載體快速構建方法，尤其涉及水稻快速沉默載體改造用DNA序列和該DNA序列的合成方法以及采用該DNA序列用于建立高效的水稻人工miRNA基因干涉載體。本發明將沉默相關片段兩端的不變區域事先放入轉基因目標載體，再將核心沉默片段(wi-site)連入改造后的載體，直接完成載體構建。在首、尾片段選擇時，分析了DNA序列，使得首尾片段相連后可獲得一個AfeI酶切位點，轉化大腸桿菌后，可大量制備該載體并用AfeI內切酶對其進行線性化，直接連接采用本發明方法合成的核心沉默片段，完成水稻沉默載體的構建。本發明擴展了目標載體上不變的DNA區間，從而簡化了單個沉默載體構建的方法，加速了構建過程，提高了載體構建的效率。文檔編號C12N15/82GK101709300SQ200910153288公開日2010年5月19日申請日期2009年10月30日優先權日2009年10月30日發明者嚴成其,余初浪,周潔,楊勇,王栩鳴,程曄,陳劍平申請人:浙江省農業科學院