一種新型rna環化表達載體的構建及其應用
【專利摘要】本發明提供了一種新型RNA環化表達載體的構建及其應用。具體地，本發明的用于構建RNA環化分子的核酸構建物具有式I所示的從5’至3’的結構。式I中，A1和A2共同構成一報告基因；B1為第一5’剪接位點序列；C1為第一環化配對序列；D1為嘧啶富含區；E1為第一3’剪接位點序列；F為外源的RNA環化分子的線性序列；B2為第二5’剪接位點序列；C2為第二環化配對序列；D2為嘧啶富含區；和E2為第二3’剪接位點序列；其中，第一環化配對序列C1和第二環化配對序列C2為互補序列。基于本發明構建物的方法，具有操作簡單、表達效率高、對目標表達序列要求低，適用范圍廣、可在體內表達等優點。A1―B1―C1―D1―E1―F―B2―C2―D2―E2―A2 (I)。
【專利說明】
一種新型RNA環化表達載體的構建及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及生物領域，具體涉及一種外顯子來源的環形RNA分子高效表達載體的 構建及其應用。
【背景技術】
[0002] 環形RNA最早在上世紀70年代被人們發現，隨著相關技術的發展，人們對這一類 分子的研究逐步深入。
[0003] 從物種上，不論在病毒、酵母還是古細菌中，不論在人、靈長類動物還是小鼠中，都 發現了環形RNA的存在。
[0004] 從數量上，早期環形RNA只是被零星地發現，由于新一代高通量測序技術以及分 子生物學技術的進步，目前根據生物信息學的計算分析結果預測，環形RNA的數量相當于 mRNA的1%左右，甚至更多，它們在不同的細胞系中被發現，而且存在種屬特異性和組織特 異性（Salzman, et al.，2012)。
[0005] 從類型上，目前發現的環形RNA可以分為三類：一是由外顯子通過反向剪接 (back - splicing)形成的外顯子來源的環形RNA，exonic circRNAs;二是由來源于內含 子區域通過抑制脫分支過程形成的內含子來源的環形RNA，ciRNAs (circular intronic RNAs) (Zhang Y，et al.，2012);三是由外顯子和內含子共同組成的環形RNA分子。
[0006] 從功能上，早期人們認為環形RNA是基因轉錄過程中剪接產生的副產物，并不發 揮生物學功能，而2013年《自然》雜志發表的一系列文章表明，環形RNA可以充當miRNA分 子海綿，調控基因轉錄，并與RNA結合蛋白相互作用（Hansen TB，et al.，2013)。而環形RNA 是否具有更多的功能，還有待進一步的探索。
[0007] 為了更好地研究環形RNA的功能，人們一直在尋找一種體外或體內合成環形RNA 的方法，以期通過分子生物學的手段和方法，研究環形RNA在生物體內所發揮的功能和作 用，目前已知的方法和策略主要包括兩種：
[0008] 一種是由T4RNA連接酶或T4DNA連接酶誘導的環化（T4RNA or T4DNA ligase - induced circularization) (Beaudry D, et al.，1995)。先是通過 PCR 的方法將 T7 體外轉 錄酶啟動子序列和（或）需要的核酸內切酶位點構入擬環化的片段模板，然后通過體外轉 錄的方式得到需要的片段，再通過去磷酸化以及磷酸化，或者酶切連接的方法構建出需要 的環形RNA分子，最后通過PAGE純化切膠回收。這種方法只能用于體外構建，雖然可以獲 得足夠的環形RNA分子，但后續的應用受到很大的限制。
[0009] 另一種策略是利用自剪接誘導環化（self-splicing-induced circularization) (Umekage S, et al·，2009)。I型內含子的剪接機制目前研究得較為清 楚，它具有保守的序列和結構，能夠通過兩步轉醋反應完成剪接。而其中5'端和3'端剪接 位點的具體序列，以及能被識別、結合、活化的結構特征，比剪接位點的相對位置更加重要。 所以，人們人工合成了 PIE (permuted intron - exon)序列，并通過構建入合適的質粒，使其 能夠發生自剪接作用，從而產生環形RNA分子。該方法可以在體內產生環形RNA分子，但是 其構建的一些環形RNA分子種類有限，且構建過程比較繁瑣。
[0010] 綜上所述，本領域迫切需要開發新的高效地在體內產生環形RNA分子的方法。
【發明內容】
[0011] 本發明的目的在于提供一種高效的分子生物學工具，其能夠在真核細胞中高效表 達外顯子來源的環形RNA，為研究環形RNA分子的功能和作用提供工具支持。
[0012] 本發明的第一方面提供一種用于構建RNA環化分子的核酸構建物，所述的構建物 具有式I所示的從5'至3'的結構：
[0013] A1-B1-C1-D1-E1-F-B2-C2-D2-E2-A2 (I)
[0014] 式中，
[0015] A1和A2共同構成一報告基因；
[0016] B1為第一 5'剪接位點序列；
[0017] C1為第一環化配對序列；
[0018] D1為嘧啶富含區；
[0019] E1為第一 3'剪接位點序列；
[0020] F為外源的RNA環化分子的線性序列；
[0021] B2為第二5'剪接位點序列；
[0022] C2為第二環化配對序列；
[0023] D2為嘧啶富含區；和
[0024] E2為第二3'剪接位點序列；
[0025] 其中，第一環化配對序列C1和第二環化配對序列C2為互補序列，且長度100 - 500bp〇
[0026] 此外，"一 "表示各元件（即各序列）之間連接鍵或連接關系（通常為直接相連）。
[0027] 在另一優選例中，第一環化配對序列C1和第二環化配對序列C2為非重復序列。
[0028] 在另一優選例中，所述的第一環化配對序列含有序列如SEQ ID N0. :2所示的核心 互補區。
[0029] 在另一優選例中，所述的第一環化配對序列的長度為200 - 2000bp，較佳地為 300 - 1500bp，更佳地為 500 - lOOObp。
[0030] 在另一優選例中，所述的D1和D2的長度各自獨立為20 - 100bp。
[0031] 在另一優選例中，所述的D1的序列如SEQ ID Ν0· :3。
[0032] 在另一優選例中，所述的D2的序列如SEQ ID Ν0· :7。
[0033] 在另一優選例中，所述的第一環化配對序列Cl和第二環化配對序列C2為完全互 補或部分互補的。
[0034] 在另一優選例中，第一環化配對序列C1長度L1和第二環化配對序列C2的長度L2 之比為1 :8至8 :1，較佳地為1 :4至4 :1 ;更佳地為1 :2至2 :1(如約1:1)。
[0035] 在另一優選例中，所述的F含有miRNA的海綿序列。
[0036] 在另一優選例中，所述的F的長度為100 - 500bp。
[0037] 在另一優選例中，所述的F不含有5'剪接位點序列和3'剪接位點序列。
[0038] 在另一優選例中，所述的第一 5'剪接位點序列和第二5'剪接位點序列為相同或 不同類別的5'剪接位點序列。
[0039] 在另一優選例中，所述的第一 5'剪接位點序列和第二5'剪接位點序列為相同類 別的5'剪接位點序列。
[0040] 在另一優選例中，所述的第一 5'剪接位點序列和第二5'剪接位點序列具有相同 序列。
[0041] 在另一優選例中，所述的第一 3'剪接位點序列和第二3'剪接位點序列為相同或 不同類別的3'剪接位點序列。
[0042] 在另一優選例中，所述的第一 3'剪接位點序列和第二3'剪接位點序列為相同類 別的3'剪接位點序列。
[0043] 在另一優選例中，所述的第一 3'剪接位點序列和第二3'剪接位點序列具有相同 序列。
[0044] 在另一優選例中，在A1與F之間序列總長度TL1以及F與A2之間序列總長度TL2 各自獨立地為300 - 3000bp，較佳地所述的500 - 2000bp，更佳地為800 - 1200bp。
[0045] 在另一優選例中，所述的總長度TL1和總長度TL2之比為5 :1至1:5 ;較佳地為2 : 1 至 1:2〇
[0046] 在另一優選例中，所述的報告基因包括抗性基因和熒光蛋白基因。
[0047] 在另一優選例中，A1占完整報告基因序列的約1/20至19/20 ;而A2占完整報告基 因序列的約19/20至1/20 ;且A1+A2構成完整報告基因。
[0048] 在另一優選例中，所述的報告基因是增強綠色熒光蛋白（EGFP)基因。
[0049] 在另一優選例中，B1、C1、D1、E1、F、B2、C2、D2、E2的具體序列如表A中所示。
[0050] 在本發明的第二方面，提供了一種在體外（或體內）非治療性（或治療性）地產 生環形RNA的方法，包括步驟：將本發明第一方面中任一所述的用于構建RNA環化分子的核 酸構建物導入真核細胞，從而在所述真核細胞中產生來源于所述構建物的環形RNA。
[0051] 在另一優選例中，所述的環形RNA為表達外顯子來源的環形RNA。
[0052] 在另一優選例中，所述的真核細胞包括哺乳動物細胞（如酵母細胞、哺乳動物、人 細胞等）。
[0053] 應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0054] 圖1顯示了實施例1中用于構建RNA環化分子的核酸構建物pZWl - Circ 一 Vector 的序列結構。
[0055] 圖2顯示了核酸構建物pZWl - Circ-Vector的引物設計策略。
[0056] 圖3顯示了實施例2中更優的用于構建RNA環化分子的核酸構建物pZWl - Circ一 Vector - High的序列結構。
[0057] 圖4顯示了核酸構建物pZWl - Circ一 Vector - High的引物設計策略。
[0058] 圖5顯示了對比例1中互換核酸構建物pZWl - Circ一 Vector - High中C1和D1 位置的序列結構。
[0059] 圖6顯示了對比例2中互換核酸構建物pZWl - Circ一 Vector - High中C2和D2 位置的序列結構。
[0060] 圖1-6中，exon表示外顯子。此外，核酸構建物的各元件的代表性的序列如下表A 所示：
[0061] 表 A
【具體實施方式】
[0064] 本發明人通過廣泛而深入的研究，首次成功開發了一種在體內高效表達環形RNA 分子的載體。該載體經過優化設計，通過特定的提高環形RNA形成的結構元件（包括元件 A1、B1、C1、D1、E1、B2、C2、D2、E2、A2)并引入限制性酶切位點，可以方便地將擬研究的外顯 子序列連接到載體，可以更加高效地在體內針對所需的外源序列F表達形成環形RNA分子， 從而為環形RNA分子的研究提供更高效、更方便、更實用的分子生物學工具。在此基礎上完 成了本發明。
[0065] 本發明公開了一種在體內高效表達環形RNA分子的載體，并公開了一種將外顯子 序列構建成環形RNA的方法。
[0066] 在一個具體例中，是將選定的可產生環形RNA的外顯子及其兩側的內含子序列， 構建入常規的PZW1載體或類似載體中，原載體的剪接位點和多克隆酶切位點不予保留，利 用體內環形RNA的成環機制，形成外顯子來源的環形RNA分子。
[0067] 在一個具體實施例中，以P0LR2A基因的第9、第10個外顯子及其兩側內含子序列， 并將其構建入PZW1載體。
[0068] 本發明人首次意外地發現，具有式1所示的特定結構的構建物，可以非常高效地 形成外顯子來源的環形RNA分子。
[0069] 此外，在一優選例中，本發明人利用已經構建成功的質粒載體，并其兩側設置反向 互補的Alu序列，那么有助于在成環機制中起作用。如果將其兩側的Alu序列分別進行缺 失突變，結果顯示兩側至少保留一個反向互補的Alu序列，才能保證環形RNA的形成。更優 地，在此基礎上，對該載體進行優化，將兩側Alu序列用一對完全反向互補序列（非重復序 列）分別替代，進一步證明元件C1和C2的存在是必要的。更重要的是，采用兩側完全反向 互補序列（非重復序列）替代原有的Alu序列后，能更加高效地表達外顯子來源的環形RNA 分子。
[0070] 在一特別優選例中，通過在此高效表達載體上引入了限制性核酸內酶位點Bglll、 Notl等，可將類似的外顯子來源的環形RNA簡單、快速地構建到在該載體中，并進行高效的 表達，為進一步研究外顯子來源的環形RNA在真核生物體內的作用提供了更優的分子生物 學工具。
[0071] 在一個具體實施中，本發明方法包括步驟：
[0072] 1.設計帶酶切位點引物（上游引物帶Bglll酶切位點，下游引物帶Notl酶切位 點），將需要表達的外顯子序列通PCR的方法進行體外擴增。
[0073] 2.(可選步驟）可將PCR產物連接入TA克隆載體，然后進行鑒定。對陽性克隆的 可行目的質粒擴增備用。
[0074] 3.將PCR產物或步驟2中擴增的質粒進行雙酶切，獲得目的片段。然后用T4DNA 連接酶連接。
[0075] 4.選擇合適的感受態細胞，將連接產物進行轉化，然后進行單克隆鑒定，對陽性克 隆進行擴增純化出質粒，即可供下游細胞轉染等實驗應用。
[0076] 本發明的有益效果為：首次成功構建并公開了在真核細胞生物體內高效表達外顯 子來源環形RNA分子的思路和方法，利用該改進的載體，可以簡單、快速地進行構建，并能 高效表達外顯子來源的環形RNA分子，從而為在真核生物體內研究環形RNA分子的作用和 功能，提供了新的途徑和方法。本發明為深入研究外顯子來源的環形RNA分子的功能和應 用提供了有力的工具支持。
[0077] 本發明的主要優點在于：
[0078] (1)操作簡單，表達效率高。
[0079] (2)對目標表達序列要求低，適用范圍廣。
[0080] (3)體內表達，可以更加真實反映體內作用情況。
[0081] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如 Sambrook 等人，分子克隆：實驗室手冊（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數按重量計算。
[0082] 實施例lpZWl - Circ一 Vector環形RNA分子表達載體的構建及檢測
[0083] 根據目前關于外顯子來源的環形RNA分子的分子結構和產生機制，本發明構建了 環形RNA分子表達載體，命名為pZWl - Circ一 Vector，并采用Northern Blot等實驗方法 驗證環形RNA分子的表達。此例中，以P0LR2A基因的第9、第10外顯子為例，描述其構建的 方法和驗證實施過程。
[0084] 1.實驗材料
[0085] 1. 1實驗試劑
[0086] 限制性核酸內切酶Nhel和Mlul購自美國NEB公司；T4DNA連接酶，PrimeSTAR 高保真PCR體系購自日本Takara公司；TRIzol·? Reagent購自美國Invitrogen公司； AmpliScribe? T7 Transcription Kits 購自美國 Epicentre 公司，LiCl 和瓊脂糖購自美 國 Sigma 公司；X-tremeGENE 9DNA Transfection Reagent,DIG Northern Starter Kit, RNA Molecular Weight Marker III，Anti-digoxigenin-AP, Fab fragments VXjk. CDP - Star, ready to use試劑購自瑞士 Roche公司；質粒抽提試劑盒購自德國QIAGEN公司；X光 片，顯影液和定影液購自美國Kodak公司。
[0087] 1. 2細胞株和載體
[0088] 實驗中所采用的細胞培養方法均按照美國模式培養物集存庫（American type culture collection，ATCC)提供的條件培養。人源胚胎干細胞系H9培養在Martigel包 被的培養皿上，米用CM (fibroblast - conditioned medium)培養基進行培養，該CM培養基 為補加了 4ng/mL的成纖維細胞生長因子（bFGF，Life Technologies)的小鼠 MEF細胞培養 基上清。
[0089] 人源宮頸癌細胞系HeLa由其他實驗室提供，HeLa細胞系的培養基為90%的DMEM， 10% FBS，加上1%。的氨芐青霉素和鏈霉素；培養條件為37°C，5% C02。構建目的質粒所采 用的載體為pZWl載體（Wang et al.，2004)。
[0090] 2.實驗方法
[0091] 2. lpZWl - Circ一 Vector環形RNA分子表達載體的構建
[0092] 采用的方法主要為分子生物學中Overlap PCR等方法。在pZWl載體中的MCS區 域（即兩個半個EGFP外顯子中間的內含子區域）的Nhel和Mlul之間插入含有P0LR2A基 因的第9、第10外顯子及其兩側內含子片段，并且去除了原載體中的剪接位點，利用插入片 段的剪接序列及真核細胞本身的剪接機制產生環形RNA分子。質粒構建示意圖參見圖1。 具體構建過程如下：
[0093] 2. 1. lOverlap PCR該方法的基本原理是利用兩個或多個PCR產物片段，利用其彼 此設計的一定長度的重疊區域，通過兩輪PCR的方法將片段連接。具體的，第一輪PCR，一 般采用5個循環，不加入引物，只加入等摩爾數的目的PCR片段，片段間有重疊區域，利用它 們可以互為模板和引物進行擴增；第二輪PCR，通常不超過30個循環，與第一輪PCR不同的 是，需要加入所需長片段最外側兩端的引物，進一步擴大所需片段的產量。
[0094] 進一步的，pZWl - Circ一 Vector包含三個片段，采用PrimeSTAR高保真PCR體系 進行目的擴增，具體的，即左側片段包含Nhel酶切位點并且和P0LR2A基因的第9、第10外 顯子及其兩側內含子序列上游有重疊區域的egfp左半邊；中間片段包含有P0LR2A基因的 第9、第10外顯子及其兩側內含子序列；以及右邊含有Mlul酶切位點并且和P0LR2A基因 的第9、第10外顯子及其兩側內含子序列下游有重疊區域的egfp右半邊。三個片段之間依 次包含相互重疊部分（如圖2中所示）。
[0095] 采用下面表1中的引物，限制性核酸內切酶Nhel和Mlul位點是在兩側的引物中 引入，以pZWl為模板，采用引物1、4擴增出左側片段，采用引物2、5擴增出右側片段；以H9 細胞基因組為模板，采用引物3、6擴增出中間片段。
[0096] 表1引物序列
[0097]
[0099] 其中，PrimeSTAR(Takara公司）的PCR反應體系為，如表2、表3 :
[0100] 表2PCR反應體系
[0102] 表3PCR反應條件
[0103]
[0104] 將所得的以上3個片段PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，PCR產物的大小與預計相 符，然后將相應條帶割膠回收，PCR產物回收后，加入等摩爾數的三個片段，前五個循環不加 引物，隨后加入P0LR2A-Con- 1 一 F (引物1)和P0LR2A-Con- 1 一 R (引物2)再擴增30 個循環后回收產物。
[0105] 2. 1. 2酶切將PCR產物經純化后的片段、pZWl載體分別用限制性內切酶Nhel和 Mlul進行酶切。酶切結束后，采用膠回試劑純化。反應體系如下，見表4:
[0106] 表4酶切反應體系
[0107]
[0108] 2. 1. 3連接用T4DNA連接酶（Takara)將含有黏性末端的PCR片段連到線性化的 pZWl載體中，連接反應體系如下，見表5 :
[0109] 表5連接反應體系
[0110]
[0111] 反應體系總體積l〇ul，依次加入各反應物質，混勻，置于16°C連接過夜。
[0112] 2. 1. 4轉化取5ul連接產物轉化感受態大腸桿菌，42°C熱激30s，立即放冰上2min， 加入無抗的液體LB培養基，37°C復蘇60min，6000rpm離心2min，吸去大部分上清，用剩余 殘液重懸菌沉淀，用涂布棒涂布在含卡那霉素（l〇〇mg/ml)的固體LB平板上，置于37°C培養 箱培養12 - 16小時，挑取單菌落并PCR鑒定陽性克隆，陽性克隆送測序公司進行測序，測序 結果與預期一致后擴大培養并抽提質粒，將其命名為PZW1 - Circ一 Vector。
[0113] 2. 2細胞轉染
[0114] 用pZWl空載體（陰性對照）、表達載體pZWl - Circ 一 Vector轉染HeLa細胞系，轉 染 24 小時后收取總 RNA。轉染試劑為X - tremeGENE 9DNA Transfection Reagent(Roche)。 具體的，
[0115] 2. 2. 1細胞準備提前一天鋪HeLa細胞，鋪盤密度為3xl05個/35mm dish，混勻，貝占 壁培養。24小時后細胞匯合度75 - 85%，然后進行轉染。
[0116] 2. 2. 2轉染前取100ul的Opti - MEM(Gibco)加入無菌的1. 5ml的EP管中，然后 加入lug相應質粒，混勻后再加入3ul轉染試劑，混勻后室溫靜置20分鐘。
[0117] 2. 2. 3轉染將質粒混合物逐滴加入細胞培養物中，輕輕混勻，然后放入37°C培養 箱中繼續培養。
[0118] 2. 2. 4轉染后培養24小時后，終止轉染，收取總RNA (具體步驟如2. 3)。
[0119] 2.3細胞總1?熟提取
[0120] 采用T.Klpol? Reagent試劑（Invitrogen)抽提細胞的總RNA，具體步驟如下：
[0121] 2. 3. 1漂洗，裂解首先用lx PBS洗35mm培養皿中的細胞兩次，然后加入 lml TRIzol·? Reagent試劑，反復吹打直至細胞全部裂解；
[0122] 2. 3. 2分離轉到1. 5ml的無 RNase的EP管中，并加入0. 2mL氯仿，劇烈振蕩30秒， 然后放入在4°C低溫離心機中，采用14000rpm/min，離心15分鐘；
[0123] 2. 3. 3沉淀取上層水相500ul，轉到新的無 RNase的1. 5ml EP管中，加入等體積預 冷的異丙醇混勻后室溫靜置10分鐘，然后4°C離心，14000rpm/min，離心10分鐘；
[0124] 2. 3. 4干燥離心結束后，RNA在管底形成沉淀，用一 20°C預冷的75%乙醇漂洗兩次 后，倒掉乙醇并短暫離心，去掉殘留乙醇，RNA沉淀室溫晾干至透明狀；
[0125] 2. 3. 5溶解向EP管中加入50ul DEPC處理的雙蒸水溶解，混勻；
[0126] 2. 3. 6保存用Nanodrop檢測RNA濃度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性； 然后取出適量RNA用于下游實驗，其余RNA分裝后放入超低溫冰箱保存。
[0127] 2. 4Northern Blot驗證環形RNA分子的表達
[0128] 通過Northern Blot手段檢測構建的pZWl - Circ一 Vector表達載體是否可以產 生所預期的外顯子來源的環形RNA。
[0129] 2. 4. 1制備Dig標記探針
[0130] 以H9細胞基因組為模板，采用表6所列引物，采用PCR技術擴增所需模板。
[0131] 表6制備探針所用到的引物
[0132]
[0133] 然后，將純化的PCR產物，采用體外轉錄試劑盒（Epicentre)制備所需探針，其中 采用Roche的DIG RNA Labeling Mix(10x)。體外轉錄制備探針的反應體系如表7所示：
[0134] 表7體外轉錄制備探針的反應體系
[0135]
[0136] 混勻后，37°C水浴3小時，采用4M LiCl沉淀回收，DEPC- H20溶解后分裝后，一 80 °C保存備用。
[0137] 2. 4. 2采用變性TBE - PAGE膠驗證環形RNA分子表達
[0138] 驗證實驗中用到的電泳緩沖液為lx TBE buffer (89mM Tris，89mM硼酸，2mM EDTA ρΗ8·0)，轉膜緩沖液為 lx transfer buffer(10mM Tris，5mM NaAc，lmM EDTA，pH7.8); Northern Blot 試劑 DIG Northern Starter Kit (Roche)。具體過程可參照 Roche 公司 DIG Northern Starter Kit說明書。Northern Blot驗證關鍵步驟如下：
[0139] 1)配制 5% 的 8M 尿素 TBE - PAGE 膠。
[0140] 2) 4ug total RNA上樣，上樣緩沖液為尿素飽和的4x DNA loading buffer。
[0141] 3)在120V的電壓條件下電泳約2個小時，電泳緩沖液為lx TBE buffer。
[0142] 4)用Bio - Rad轉膜裝置進行轉膜，100V電轉1. 5h，轉膜緩沖液為lx transfer buffer。
[0143] 5) RNA轉移到尼龍膜上后，在紫外交聯儀中交聯，將RNA固定在尼龍膜上，交聯條 件為 180mJ/cm2。
[0144] 6)加入3ml雜交緩沖液，68°C預雜交2個小時；更換3ml新的雜交緩沖液，并加入 相應的100°C變性5分鐘的探針，雜交過夜。
[0145] 7)雜交結束后，在室溫用2XSSC+0. 1% SDS條件洗滌兩次，每次5min，在68°C用 0. 2 X SSC+0. 1 % SDS條件洗滌兩次，每次30min ;
[0146] 8)用 lx Blocking buffer 室溫封閉 30min，然后按 1:10000 加入 Anti - Digoxigenin, Fab Fragment (Roche)，室溫孵育 30min〇
[0147] 9)用 lx Washing buffer 洗兩次，每次 20min〇
[0148] 10)用 lx Detection buffer 漂洗 5min 后，在膜上加入 0· 2ml - lml 反應底物 ⑶P - Star, ready to use，反應2- 3分鐘后，在暗室中壓X光片若干分鐘并顯影。
[0149] 2. 5實驗結果分析
[0150] pZWl - Circ一 Vector表達載體轉染HeLa細胞后經Northern Blot所形成的環形 RNA，在對照組經長時間曝光可觀察到單一條帶，在相同的位置，可見pZWl - Circ一 Vector 表達載體成功的表達出目的環形RNA。該環形RNA預計大小為336bp，但由于其環形結構， 在變性的TBE - PAGE膠中迀移速度相對較慢。
[0151] 實施例2pZWl - Circ一 Vector - High高效環形RNA分子表達載體的構建及檢測
[0152] 在pZWl - Circ一 Vector表達載體基礎上，用完全反向互補的兩段序列替代原有 的Alu元件，可以更加高效地表達外顯子來源的環形RNA，獲得更多的環形RNA分子，對經過 此優化的載體，命名為pZWl - Circ一 Vector - High高效環形RNA分子表達載體。質粒構 建示意圖參見圖3。具體實施過程如下：
[0153] 1.實驗材料
[0154] 1. 1實驗試劑
[0155] 同實施例1中所用試劑。
[0156] 1.2細胞株和載體
[0157] 此例中仍采用人源胚胎干細胞H9細胞系和人源宮頸癌細胞HeLa細胞系，具體可 參見實施例1中1. 2細胞株和載體部分。構建目的質粒所采用的載體為實施例1中所成功 構建的 pZWl - Circ一 Vector 載體。
[0158] 2.實驗方法
[0159] 2. lpZWl - Circ一 Vector - High高效環形RNA分子表達載體的構建
[0160] 所采用的構建策略仍是Overlap PCR方法。所選用進行替代Alu元件的完全反 向互補序列選自P0LR2A基因的第9、第10外顯子上游經分析后選取的內含子區域，長約 300bp，與被替代的Alu元件大小相當，分析過程主要是避開已知的可能含有影響剪接過程 的序列，防止其對產生環形RNA可能產生不利的影響。具體的，
[0161] 2. 1. lOverlap PCR構建原理同實施例1中2. 1. 1所闡述的方法，采用下面表8中 的引物，以及表1中所列引物P0LR2A-Con- 1 一 F (引物1)和P0LR2A-Con- 1 一 R (引物 2)，并用采用高保真PCR體系（PrimeSTAR，Takara)擴增出Overlap PCR所需要的各個目的 片段。
[0162] 表8引物序列
[0163]
[0164]
[0165] 具體的，pZWl - Circ一 Vector - High高效環形RNA分子表達載體包含以下五個片 段：第一個片段，包含Nhel酶切位點和所插入反向互補左側片段序列上游重疊區域；第二 個片段包含所插入反向互補左側片段序列上、下游重疊區域；第三個片段包含所插入反向 互補左側片段序列下游和所插入方向互補的右側片段的上游重疊區域；第四個片段包含所 插入方向互補的右側片段的上、下游重疊區域；第五個片段包含Mlul酶切位點和所插入方 向互補的右側片段的下游重疊區域。五個片段之間依次包含相互重疊部分（如圖4所示）。
[0166] 進一步的，第一片段以實施例1中構建成功的pZWl - Circ 一 Vector表達載體為模 板，采用引物1、1〇擴增；第二片段以H9細胞基因組為模板，采用引物9、12擴增；第三片段 以實施例1中構建成功的pZWl - Circ一 Vector表達載體為模板，采用引物11、14擴增；第 四片段以H9細胞基因組為模板，采用引物13、16擴增；第五片段以實施例1中構建成功的 pZWl - Circ一 Vector表達載體為模板，采用引物2、15擴增。
[0167] 反應體系和方法參見實施例1中2. 1. 1。
[0168] 將所得的以上5個片段進行回收，加入等摩爾數的5個片段，前五個循環不加引 物，隨后加入P0LR2A - Con- 1 一 F (引物1)和P0LR2A - Con- 1 一 R (引物2)再擴增30個 循環后回收產物。
[0169] 然后將PCR產物和pZWl載體進行雙酶切、連接、轉化（具體參見實施例1中 2. 1.2, 2. 1.3, 2. 1.4)，將轉化后鑒定陽性的克隆進行擴增，提取高質量的質粒，并將其命名 為pZWl - Circ一 Vector - High高效環形RNA分子表達載體。
[0170] 2. 2高效環形RNA分子表達的驗證
[0171] 主要通過Northern Blot的方法進行驗證，采用5%的8M尿素變性TBE - PAGE膠。
[0172] 細胞轉染、總RNA提取，以及Northern Blot的方法同實施例1 (2. 2, 2. 3, 2. 4)。轉 染質粒的量也是lug。Northern Blot上樣量仍為4ug。所用探針與實施例1中制備的Dig 標記的探針相同。
[0173] 具體結果如下，可以清晰地看到與野生型（未經過轉染的正常狀態）、轉染pZWl - Circ一 Vector表達載體的樣本相比，pZWl - Circ一 Vector - High高效環形RNA分子表達 載體所產生的目的條帶更深、量更多，從而證明了其產生了更多的環形分子，說明pZWl - Circ一 Vector - High高效環形RNA分子表達載體的構建是成功的。進一步的，通過對膠圖 進行灰度掃描分析，本載體環形RNA表達效率約為實施例1中載體的3倍以上，說明本載體 可以更加高效地表達環形RNA。
[0174] 對比例1
[0175] 互換核酸構建物pZWl - Circ一 Vector - High中C1和D1位置的質粒構建及檢測
[0176] 為了進一步說明本專利中用于構建RNA環化分子的核酸構建物各結構序列位置 的重要性，將實施例2互換核酸構建物pZWl - Circ一 Vector - High中C1和D1位置互換 (如圖5所示），從而檢測結構序列位置對環形RNA表達效率的影響。
[0177] 1.實驗材料
[0178] 1.1實驗試劑
[0179] 同實施例2中所用試劑。
[0180] 1.2細胞株和載體
[0181] 同實施例2中所用細胞株和載體。
[0182] 2.實驗方法
[0183] 載體構建及Overlap PCR方法同實施例2,引物設計時僅將實施例2中C1和D1 位置互換，其他序列位置保持不變。
[0184] Northern Blot檢測同實施例2。結果顯示，相對于實施例2中所構載體，環形RNA 形成效率大幅下降（環形RNA形成效率< 30% )，說明各結構序列位置對于核酸構建物環 形RNA產生效率影響較大。
[0185] 對比例2
[0186] 互換核酸構建物pZWl - Circ一 Vector - High中C2和D2位置的質粒構建及檢測
[0187] 為了進一步說明本專利中用于構建RNA環化分子的核酸構建物各結構序列位置 的重要性，將實施例2互換核酸構建物pZWl - Circ一 Vector - High中C2和D2位置互換 (如圖6所示），從而檢測結構序列位置對環形RNA表達效率的影響。
[0188] 1.實驗材料
[0189] 1. 1實驗試劑
[0190] 同實施例2中所用試劑。
[0191] 1.2細胞株和載體
[0192] 同實施例2中所用細胞株和載體。
[0193] 2.實驗方法
[0194] 載體構建及Overlap PCR方法同實施例2,引物設計時僅將實施例2中C2和D2位 置互換，其他序列位置保持不變。
[0195] Northern Blot檢測同實施例2。結果顯示，相對于實施例2中所構載體，環形RNA 形成效率大幅下降（環形RNA形成效率< 30% )，說明各結構序列位置對于核酸構建物環 形RNA產生效率影響較大。
[0196] 在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可 以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范 圍。
【主權項】
1. 一種用于構建RNA環化分子的核酸構建物，其特征在于，所述的構建物具有式I所示 的從5'至3'的結構： A1-B1-C1-D1-E1-F-B2-C2-D2-E2-A2 (I) 式中， A1和A2共同構成一報告基因； B1為第一 5'剪接位點序列； C1為第一環化配對序列； D1為嘧啶富含區； E1為第一 3'剪接位點序列； F為外源的RNA環化分子的線性序列； B2為第二5'剪接位點序列； C2為第二環化配對序列； D2為嘧啶富含區；和 E2為第二3'剪接位點序列； 其中，第一環化配對序列C1和第二環化配對序列C2為互補序列，且長度100 - 500bp。2. 如權利要求1所述的核酸構建物，其特征在于，所述的第一環化配對序列含有序列 如SEQ ID NO. : 2所示的核心互補區。3. 如權利要求1所述的核酸構建物，其特征在于，所述的第一環化配對序列的長度為 200 - 2000bp，較佳地為 300 - 1500bp，更佳地為 500 - lOOObp。4. 如權利要求1所述的核酸構建物，其特征在于，所述的D1和D2的長度各自獨立為 20一 100bp 〇5. 如權利要求1所述的核酸構建物，其特征在于，所述的D1的序列如SEQ ID NO. :3。6. 如權利要求1所述的核酸構建物，其特征在于，所述的D2的序列如SEQ ID NO. :7。7. 如權利要求1所述的核酸構建物，其特征在于，第一環化配對序列Cl長度L1和第二 環化配對序列C2的長度L2之比為1 :8至8 :1，較佳地為1 :4至4 :1 ;更佳地為1 :2至2 : 1 (如約 1:1)。8. 如權利要求1所述的核酸構建物，其特征在于，所述的F含有miRNA的海綿序列；和 /或所述的F的長度為100 - 500bp。9. 如權利要求1所述的核酸構建物，其特征在于，在A1與F之間序列總長度TL1以及 F與A2之間序列總長度TL2各自獨立地為300 - 3000bp，較佳地所述的500 - 2000bp，更佳 地為800- 1200bp ;和/或所述的總長度TL1和總長度TL2之比為5 :1至1:5 ;較佳地為2 : 1 至 1:2〇10. -種在體外非治療性地產生環形RNA的方法，其特征在于，包括步驟：將權利要求 1 一 9中任一所述的用于構建RNA環化分子的核酸構建物導入真核細胞，從而在所述真核細 胞中產生來源于所述構建物的環形RNA。
【文檔編號】C12N15/10GK105985978SQ201510100793
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年3月6日
【發明人】楊力, 陳玲玲, 張曉鷗, 張楊
【申請人】中國科學院上海生命科學研究院