一種生產高純度果糖的釀酒酵母系統的制作方法

專利名稱：一種生產高純度果糖的釀酒酵母系統的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物基因工程技術領域，具體涉及一種生產高純度果糖的釀酒酵母系 統及利用菊芋原料生產高純度果糖的方法。
背景技術：
果糖是自然界中最甜的單糖，其甜度是蔗糖的1.7倍、葡萄糖的2倍，具有甜味 純正、熱值低、冷甜性、高溶解度、滲透壓高、保濕性好、發酵性能好等特點，被預測為21世 紀全球代替蔗糖、葡萄糖的新型功能性糖源，廣泛應用于食品和醫藥工業領域(Hanover L. Μ. et al.，Manufacturing，composition, andapplications of fructose，Am. J. Clin. Nutr. 58(5) :7M_732，199 。果糖注射液屬于新一代不依賴胰島素的高能量營養輸液，在 世界醫藥市場的表現十分活躍，在某些國家已成為僅次于葡萄糖的第二大注射液。作為一 種甜度較蔗糖高的天然甜味劑，高果糖漿可以替代和補充蔗糖供應量的不足，而且高果糖 漿還具有優越的代謝特性和營養保健功能，如可被直接吸收，毋須依靠胰島素參與代謝、減 緩體內蛋白質消耗、不會引起齲齒等等，因此高果糖漿得到越來越多的青睞和應用。高果糖漿是由果糖和葡萄糖組成的一種混合糖漿，根據其中果糖的含量，主要分 為卩42、？55、？90等3種類型(即果糖含量分別為42%，55(%，90(%)以及結晶果糖。果糖 含量越高其價值越高。高果糖漿已廣泛應用于廣泛應用于食品加工業、軟飲料工業、醫藥和 煙草等行業中(張樂興，高果糖漿的性質與應用，廣州食品工業科技，19(1) :44-45, 2003) 0 目前商業高果糖漿生產原料主要為玉米淀粉等，采用酶法生產，整個過程需要多種酶作用 淀粉先酶解糖化成為葡萄糖，然后經葡萄糖異構酶轉化為果糖。為獲得高含量果糖，需要采 用色譜分離技術分離果糖和葡萄糖，再催化葡萄糖轉化為果糖，過程復雜，成本較高。菊粉(又稱菊糖，inulin)是由多個果糖分子通過β _2，1_果糖苷鍵連接成的多 聚果糖，其末端有一個葡萄糖殘基以α-1，2鍵與之相連，呈直鏈結構。菊粉廣泛分布在菊 芋(Jerusalem artichoke)、菊苣(Chicory)、大麗花(Dahlia)、牛蒡(Arctium)等植物組織 中。菊芋塊莖菊粉含量達到15% 20%，絕大部分為果糖。菊芋具有耐貧瘠、易種植、產量 高等特點，因此菊芋是一種極具開發價值的果糖基原料作物。菊粉酶anulinase)是天然果聚糖——菊粉的水解酶，分為(1)內切菊粉 酶(Endoinulinase，EC 3.2. 1. 7)，隨機斷開菊粉鏈內部的糖苷鍵，產生寡聚果糖；(2) 外切菊粉酶(Exoinulinase，EC 3. 2. 1. 80)，作用于菊粉鏈非還原性末端的糖苷鍵，逐 一水解釋放單糖，水解產物為果糖和葡萄糖混合物(其中大部分為果糖)(Henrissat B. , A classification of glycosyl hydrolases basedon amino-acid—sequence similarities, Biochem J. 280(2) :309-316,1991)。利用菊粉酶水解菊粉生產寡聚果糖或高果糖漿，具有巨大的工業應用潛力。菊粉 酶主要來源于微生物，如馬克斯克魯維氏酵母(Kluyveromyces marxianus)、脆壁克魯維 氏酵母(Kluyveromyces fragilis)和黑曲霉(Aspergillus niger)等[周幗萍，沙濤， 程立忠，丁驊孫.O001).菊粉酶的研究及應用.食品與發酵工業.27 (7) :54-58.]。自1991年首次報道從馬克斯克魯維氏酵母克隆菊粉酶基因(Laloux 0. et al.，Cloning and sequencing of the inulinase gene ofKluyveromyces marxianus var. marxianus ATCC 12424，FEBS Lett. 289 =64-68,1991)，陸續有多個菊粉酶基因克隆并在大腸桿菌中和酵母 中重組表達(Kim H. S. et al. , Expression of the INU2 gene for an endoinul inase of Aspergillusficuum in Saccharomyces cerevisiae, Biotechnology Letters 21 621-623，1999)。

發明內容
本發明的目的在于提供一種生產高純度果糖的新方法，包括重組釀酒酵母工程菌 構建和發酵生產高純度果糖的方法。己糖激酶(Hexokinase，HXK)是釀酒酵母糖酵解途徑中的第一個酶，催化葡 萄糖和果糖等磷酸化。果糖的磷酸化基因只有HXKl和HXK2，而葡萄糖還有葡萄糖激 (glucokinase, GK)可以催化其憐酸化(Lobo Ζ. , et al. , Genetics ofyeast hexokinase, Genetics 86 :727-44,1977).本發明對所構建的分泌菊粉酶重組釀酒酵母工程菌進行改 造，同時敲除宿主釀酒酵母細胞基因組HXKl和HXK2基因，改造后的重組釀酒酵母工程菌能 夠在菊芋培養基中生長，分泌菊粉酶水解菊粉成為果糖和葡萄糖，在發酵過程中，工程菌僅 利用葡萄糖而不消耗果糖，導致果糖在發酵液中積累。因此本發明所構建的分泌表達菊粉 酶的重組釀酒酵母工程菌能夠利用直接利用菊芋原料生產高純度果糖(高果糖漿)，該方 法與傳統的果糖生產工藝相比，具有工藝簡單、成本低的特點。本發明提供了一種生產高純度果糖的釀酒酵母系統，該系統包括釀酒酵母菌株、 菊粉酶基因表達盒、HXKl基因敲除盒DNA片段、HXK2基因敲除盒DNA片段和由酵母終止子、 釀酒酵母2 μ質粒完整序列、酵母營養缺陷篩選基因、酵母啟動子序列依次連接構成的酵 母-大腸桿菌穿梭質粒的酵母載體部分。所述的釀酒酵母菌株可以采用本領域常規的酵母發酵生產用菌株，例如本發明實 施例采用的Υ16，或者Υ19，等等。所述的菊粉酶基因來源于微生物，包括但不限于鷹嘴豆克魯維酵母 (Kluyveromyces cicerisporus)、馬禾斗斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、脆壁克 魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)和黑曲霉(Aspergillus niger)。例如，本發明的一 個實施例中，外切型菊粉酶基因來源于鷹嘴豆克魯維酵母(Kluyveromyces cicerisporus) (Wen Τ. Q. , Cloning andanalysis of the inulinase gene from Kluyveromyces cicerisporus CBS4857,World Journal of Microbiolog y &Biotechnology 19 :423-426, 2003)，GenBank 登入號為 AF17897。菊粉酶可以具有信號肽，包括菊粉酶信號肽、酵母α因子信號肽、釀酒酵母轉化 酶(invertase)信號肽、釀酒酵母酸性磷酸酯酶(acid phosphatase)信號肽。所述的菊粉酶基因表達盒含有酵母啟動子、菊粉酶基因和酵母終止子。其中的酵 母啟動子和酵母終止子與酵母-大腸桿菌穿梭質粒中的酵母啟動子和酵母終止子相同。HXKl基因敲除盒DNA片段的功能是敲除基因組中HXKl基因，或者使其突變失活。 同理，HXK2基因敲除盒DNA片段的功能是敲除基因組中HXK2基因，或者使其突變失活。上述酵母-大腸桿菌穿梭質粒的酵母載體部分可以是酵母終止子、釀酒酵母2 μ質粒完整序列、酵母營養缺陷篩選基因、酵母啟動子的DNA片段，然后將其依次連接。也可 以先構建含有酵母終止子、釀酒酵母2 μ質粒完整序列、酵母營養缺陷篩選基因、酵母啟動 子序列的酵母-大腸桿菌穿梭質粒，然后切除其中的大腸桿菌載體部分。目前已建立了多種釀酒酵母表達載體，其中整合型(YIp)和附加體型(YEp)載體 使用最多。整合型載體沒有自主復制序列(ARS)，而是被整合到酵母細胞基因組上，這類載 體的優點是穩定性好，基因不易丟失，但拷貝數較低，有可能影響基因表達量。附加體型載 體具有來自釀酒酵母天然質粒2 μ復制子(Ori)序列，能夠在酵母細胞內自主復制，附加體 型載體具有很高的轉化效率和拷貝數。所述的酵母啟動子是酵母菊粉酶基因啟動子、TEFl基因啟動子、ADHl基因啟動 子、ADH2基因啟動子、GAPDH基因啟動子、GALl基因啟動子、GALlO基因啟動子中的任意一 種，或者其中兩種及兩種以上啟動子的融合啟動子。所述的酵母終止子是菊粉酶基因終止子、CYCl基因終止子、TEFl基因終止子、 ADHl基因終止子中的一種或者幾種。例如，本發明一個實施例中使用的Tcyc。所述的酵母營養缺陷篩選基因是LEU2、ADE2、URA3、TRP1或者HIS3中的一種或者 幾種。上述營養缺陷篩選基因與篩選時使用的營養缺陷型培養基是相應匹配的。利用上述的釀酒酵母系統生產果糖的方法，包括如下步驟(1)酵母-大腸桿菌穿梭質粒的酵母載體部分與菊粉酶基因表達盒共轉染釀酒酵 母菌株，獲得菊粉酶表達重組釀酒酵母工程菌；(2)將HXKl基因敲除盒DNA片段、HXK2基因敲除盒DNA片段先后轉化菊粉酶表達 重組釀酒酵母工程菌，獲得釀酒酵母HXKl和HXK2基因雙缺失突變工程菌；(3)將釀酒酵母HXKl和HXK2基因雙缺失突變工程菌接種于培養基，制備種子液， 發酵，獲得果糖。步驟(3)可以以菊芋作為原料生產果糖。制備種子液的培養基可以是選擇性SD培養基或菊芋培養基。菊芋培養基糖濃度較好為2-20% (w/v)。發酵培養基糖濃度較好為2-20% (w/v)。較好地，制備種子液的溫度為-32°C，時間為12h_120h。利用上述的釀酒酵母系統生產果糖的方法，具體說明如下1、分泌表達菊粉酶的重組釀酒酵母工程菌構建。1)菊粉酶基因表達盒構建PCR特異擴增菊粉酶基因(INU)，限制性內切酶酶切，與經相同限制性內切酶酶切 后的Pinu-RH質粒連接，轉化大腸桿菌，PCR鑒定轉化子，測序鑒定重組質粒Pinu-INU-RH。 Pinu-INU-RH質粒Notl酶切，電泳分離、回收菊粉酶基因表達盒(Pinu-INU-Tcyc)。所采用 的PCR、酶切、連接、大腸桿菌轉化、電泳等基因工程技術方法均為常規方法，參照《分子克隆 實驗指南》(J. Sambrook, et al.，第二版，1996)。其中，Pinu-RH質粒的制備參見發明專利申請“一種食品級釀酒酵母重組質粒的制 備方法”，發明人劉建平等。1、克隆載體I3X-RH構建(l)pAG61質粒經Notl酶切，電泳回收含有大腸桿菌質粒復制子Ori和氨芐青霉素5抗性基因Apr序列的DNA片段；(2)以兩端含有限制性內切酶位點的引物分別PCR擴增酵母啟動子及終止子序 列，限制性內切酶分別酶切酵母啟動子、終止子PCR產物；(3)分別合成多克隆位點區的正反鏈單鏈，變性退火形成多克隆位點雙鏈序列，兩 端分別含有與酵母啟動子&序列3’粘端、酵母終止子序列5’粘端互補的粘端；(4)大腸桿菌質粒復制子和氨芐青霉素抗性基因序列與酶切后的酵母啟動子、酵 母終止子以及多克隆位點雙鏈連接，轉化大腸桿菌DH5 α，對形成的轉化子進行PCR篩選鑒 定，PCR陽性轉化子抽取質粒，測序鑒定，獲得克隆載體I^x-RH。Px-RH載體具有大腸桿菌質 粒復制子、氨芐青霉素抗性基因篩選標記、酵母啟動子、多克隆位點區和酵母終止子元件。2、外源基因表達盒構建需表達的外源基因開發閱讀框(ORF)經PCR特異擴增、限制性內切酶酶切，與經過 同樣限制性內切酶酶切處理的I3X-RH載體連接，外源基因插入I^x-RH載體多克隆位點區，形 成的質粒具有酵母啟動子I3X-外源基因ORF-酵母終止子組成的外源基因表達盒，然后轉化 大腸桿菌DH5 α，對轉化子中的重組質粒進行PCR、測序鑒定。重組質粒經Notl酶切，電泳 回收與大腸桿菌質粒復制子、氨芐青霉素抗性基因序列分離的外源基因表達盒。以菊粉酶基因(INU，參見SEQ NO 21)代替外源基因，即可獲得Pinu-RH。2)分泌表達菊粉酶的重組釀酒酵母工程菌構建酵母-大腸桿菌穿梭載體pHR-Pinu經Ml、Sacl雙酶切，電泳分離去除大腸桿 菌質粒序列和氨芐青霉素抗性基因序列部分，回收酵母載體部分，與1)中菊粉酶基因表達 盒(Pinu-INU-Tcyc) —起共轉化釀酒酵母Y16菌株(劉軼婷等，在雜合啟動子控制下乙肝 病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的表達及調控，復旦學報，37 (4) =439-444,1998)， SD-Leu選擇性培養基上篩選轉化子，經PCR鑒定、菊粉酶分泌表達測試，獲得分泌表達菊粉 酶的重組釀酒酵母工程菌PHR-INU/Y16。其中，酵母-大腸桿菌穿梭載體pHR-Pinu的制備參見發明專利申請“一種食品級 釀酒酵母重組質粒的制備方法”，發明人劉建平等。酵母-大腸桿菌穿梭載體pHR-I^x構建pHCll載體(劉軼婷等，在雜合啟動子控制 下乙肝病毒表面抗原SA-觀融合基因在酵母中的表達及調控，復旦學報，37 (4) =439-444, 1998)酶切，電泳回收包括酵母2 μ質粒完整序列和酵母營養缺陷篩選基因Leu2的8. 7kb 片段、與中間插入了大腸桿菌復制子Ori和氨芐青霉素抗性基因Apr序列的酵母啟動子I^x 和酵母終止子連接，轉化大腸桿菌DH5 α，對轉化子中的重組質粒進行PCR、測序鑒定，得到 PHR-Px穿梭載體。2、重組釀酒酵母工程菌基因組改造，構建HXKl和HXK2基因缺失突變的重組釀酒 酵母工程菌。1)以釀酒酵母基因組DNA為模板，分別PCR特異擴增釀酒酵母HXK1基因 (S⑶登入號YFR053C)5，端片段HXK1-A、3，端片段HXKl-B以及HXK2基因(S⑶登入號 YGL253W)5’端片段HXK2_A、3，端片段。將HXK1-A、HXKl-B片段先后通過酶切、連接，克 隆于pAGR質粒(由pAG61質粒改造而成)的兩個多克隆位點區，獲得pAGR-HXKl-A_B 質粒。同樣，HXK2-A、HXK2-B片段先后通過酶切、連接，克隆于pAGR質粒的兩個多 克隆位點區，獲得PAGR-HXK2-A-B質粒。pAGR-HXKI-A-B質粒經酶切獲得HXKl基因中斷盒HXK1-A-K1URA3-HXK1-B，pAGR-HXK2-A_B質粒經酶切獲得HXK2基因中斷盒 HXK2-A-K1URA3-HXK2-B。HXKl基因中斷盒HXK1-A-K1URA3-HXK1-B轉化重組釀酒酵母工程 菌pHR-hu/Y16，在SD-Ura選擇性培養基篩選轉化子，PCR確認陽性轉化子，在添加5-F0A 的SD培養基反篩丟失整合于HXKl基因中的K1URA3基因，得到工程菌Y16 Δ hxkl/pHR-Inu0 HXK2 基因中斷盒 HXK2-A-K1URA3-HXK2-B 再轉化 Y16 Δ hxkl/pHR-INU 菌株，在 SD-toa 選 擇性培養基篩選轉化子，PCR確認陽性轉化子，在添加5-F0A的SD培養基反篩丟失整合于 HXK2基因中的K1URA3基因，從而得到HXK1、HXK2基因雙突變的工程菌Y16 Δ hxkl Δ hxk2/ pHR-Inu。3、改造后的重組釀酒酵母工程菌利用菊芋原料發酵生產高純度果糖。工程菌Y16 Δ hxk 1 Δ hxk2/pHR_Inu接種于菊芋培養基或選擇性SD培養基中， 30°C，250rpm培養過夜，然后按照1 20比例接種于菊芋培養基中30°C，250rpm發酵培養 96小時，間隔不同時間點取樣，分析發酵液中總糖、葡萄糖、果糖等的變化。本發明中，基因的切除通常使用到外切酶。上述載體和菌株的構建操作方法，除非 特別指出，均可采用本領域常規的操作方法。例如，參照冷泉港實驗室的《分子克隆》、《抗 體》、《細胞》，以及《冷泉港實驗室實驗方案》等通用的實驗手冊。所采用的pAGR質粒，pAG61 質粒，K1URA3基因等均為可市購商品。本發明對所構建的分泌菊粉酶重組釀酒酵母工程菌進行改造，同時敲除宿主釀酒 酵母細胞基因組HXKl和HXK2基因，改造后的重組釀酒酵母工程菌能夠在菊芋培養基中生 長，分泌菊粉酶水解菊粉成為果糖和葡萄糖，在發酵過程中，工程菌僅利用葡萄糖而不消耗 果糖，導致果糖在發酵液中積累。因此本發明所構建的分泌表達菊粉酶的重組釀酒酵母工 程菌能夠利用直接利用菊芋原料生產高純度果糖(高果糖漿)，該方法與傳統的果糖生產 工藝相比，具有工藝簡單、成本低的特點。本發明所構建的重組釀酒酵母基因工程菌能夠直接水解糖化菊芋原料中的菊粉， 產生果糖和葡萄糖，在發酵過程中工程菌僅消耗利用葡萄糖而不消耗果糖，果糖在發酵液 中積累，產物總糖中果糖所占比例達到95%以上。利用本發明所構建的酵母工程菌生產高 純度果糖工藝簡單，生產成本低。


圖1、重組釀酒酵母工程菌中菊粉酶基因表達質粒pHR-INU。圖2、重組釀酒酵母工程菌利用菊芋原料發酵過程中總糖變化。圖3、重組釀酒酵母工程菌利用菊芋原料發酵過程中葡萄糖變化。圖4、重組釀酒酵母工程菌利用菊芋原料發酵過程中果糖變化。
具體實施例方式實施例1分泌菊粉酶重組釀酒酵母工程菌pHR-INU/Y16構建(1)菊粉酶基因表達盒構建以克魯維酵母Kluyveromyces cicerisporus CBS4857基因組DNA為模板，引物 Pl和P2PCR擴增菊粉酶基因開放閱讀框ORF，PCR產物經Hindlll、Sail雙酶切后，與同樣 經過HindIIUall雙酶切的Pinu-RH載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α，PCR鑒定轉化子，抽提陽性轉化子重組質粒，測序鑒定，得到菊粉酶基因克隆于Pinu-RH載體MCS區的重組質 粒(Pinu-INU-RH)，該重組質粒具有Pinu啟動子-菊粉酶基因-Tcyc終止子組成的菊粉酶 基因表達盒(Pinu-INU-Tcyc)，重組質粒經Notl酶切，電泳分離、回收菊粉酶基因表達盒 (Pin-INU-Tcyc)。菊粉酶基因開放閱讀框ORF克隆引物Pl :5，TGAAGCTTATGAAGTTAGCATACTCCCTCTTG(SEQ NO DHindIIIP2 :5， CAGTCGACTTGTTCGTTAGTAAAGTAAGCCCA(SEQ NO 2)Sail其中，克隆載體Pinu_RH(S卩Pinu-RH載體)構建(參見發明專利申請“一種食品級 釀酒酵母重組質粒的制備方法”，發明人劉建平等)A. pAG61質粒Not 1酶切，電泳回收大腸桿菌質粒復制子(Ori)-氨芐青霉素抗性基 因(Ap1O部分，堿性磷酸酶處理去磷。B.以克魯維酵母 Kluyveromyces cicerisporus CBS4857 基因組 DNA 為模板，以 Pl和P2為引物PCR擴增菊粉酶基因(GenBank登入號AF178979，序列如SEQ. ID. NO 21, Wen Τ. Q. ,Cloning and analysis of the inulinase gene fromKluyveromyces cicerisporus CBS4857, World Journal of Microbiology &Biotechnology 19 :423-426,2003),GenBank 登入號為AF17897)啟動子Pinu片段。以釀酒酵母基因組DNA為模板，以P13和P14 為引物PCR擴增CYCl基因(S⑶登入號YJR048W)終止子Tcyc片段。按照各個片段設計的 酶切位點進行相應的限制性內切酶酶切處理。所用的4條引物的核苷酸序列如下克隆菊粉酶基因啟動子Pinu兩條引物序列是Pll :5，AG GCGGCGC AAAACGACAAGAGAAGCAAACACA3，(SEQ NO ll)NotlP12 :5，ACMGCTT ATCTAACAAAAAAAAAATTAAATGTGT3，(SEQ NO 12)HindIII克隆CYCl終止子Tcyc兩條引物序列是P13 5' ATACTAGTGTCATGTAATTAGTTATGTCACGC(SEQ NO 13) SpelP14 :5’ AGCGGCCGCGGTACCGGCCGCAAATTAAA(SEQ NO 14)NotlC.構建多克隆位點區(MCS)分別合成MCS正反鏈P15、P16，經T4磷酸激酶作用磷酸化，變性退火形成MCS雙 鏈，兩端分別為HindIII、Spel粘性末端。MCS正反鏈序列是P15 :5’ AGCTTGATATCGAGCTCCCGGGATCCAGCTGGGCCCGTCGACA (SEQ NO 15)P16 :5’ CTAGTGTCGACGGGCCCAGCTGGATCCCGGGAGCTCGATATCA (SEQ NO 16)D. pAG61質粒Ori-Aplr片段、菊粉酶基因啟動子Pinu酶切產物、CYCl基因終止子 Tcyc和MCS雙鏈進行多片段連接、轉化大腸桿菌DH5 α，PCR鑒定轉化子，陽性轉化子抽取 質粒，測序鑒定，得到克隆載體Pinu-RH。(2)菊粉酶表達重組釀酒酵母工程菌構建酵母-大腸桿菌穿梭載體？!11 - ^111經&^1、3￡111雙酶切，電泳去除大腸桿菌復制 子Ori-氨芐青霉素抗性基因Af片段，回收酵母載體部分，與(1)所得菊粉酶基因表達盒 一起采用醋酸鋰法共轉化釀酒酵母Y16菌株，在選擇性培養基SD-Leu篩選轉化子，對轉化 子中的重組表達質粒進行PCR鑒定，菊粉酶基因PCR陽性的酵母轉化子即為菊粉酶表達重8組釀酒酵母工程菌Y16/pHR-hu。其中，酵母-大腸桿菌穿梭載體pHR-Pinu的構建方法如下(參見發明專利申請 “一種食品級釀酒酵母重組質粒的制備方法”，發明人劉建平等)(a)pHCll載體(劉軼婷等，在雜合啟動子控制下乙肝病毒表面抗原SA-觀融合基 因在酵母中的表達及調控，復旦學報，37 (4) =439-444,1998)Bgl I、Sal雙酶切，回收8. 7kb 大片段(包含完整2 μ質粒序列和Leu2基因序列)，Klenow酶處理補平。(b)引物P17和P18PCR擴增菊粉酶基因啟動子Pinu，引物P19和P20PCR擴增CYCl 基因終止子！"eye。Pinu PCR產物經EcoRl、BamHl雙酶切處理，iTcyc PCR產物經BamHl、 HindIII雙酶切處理，Pinu、Tcyc酶切片段與經過HindIII、EcoRl雙酶切處理的質粒pSP72 連接，轉化大腸桿菌DH5 α，PCR和測序鑒定，得到pSP72-Pinu-TCyC質粒。(c)pSP72-Pinu-Tcyc 質粒 BamHl 單酶切線性化，Klenow 酶補平，與(1)中 pHCll 酶切片段(8. 7kb)連接，轉化大腸桿菌DH5 α，PCR鑒定陽性轉化子，抽提質粒，測序確證，得 到酵母-大腸桿菌穿梭載體pHR-Pinu。所用的4條引物核苷酸序列如下克隆菊粉酶基因啟動子Pinu兩條引物序列P17 :5， ATGGATCCGCGGCCGC AAAACGACAAGAGAAGCAAACACA (SEQ NO 17)BamHlP18 :5，ACGAATTCGTCGAC ATCTAACAAAAAAAAAATTAAATGTGT(SEQ NO 18)EcoRl Sail克隆CYCl終止子Tcyc兩條引物序列P19 :5， TG AAGCTTGAGCTC TCATGTAATTAGTTATGTCACGCTT (SEQ NO 19)HindIII SaclP20 :5， ATGGATCCGCATGCGGTACCGGCCGCAAATTAAAG (SEQ NO 20)BamHl實施例2 HXKl和HXK2基因雙缺陷工程菌(Y16 Δ hxkl Δ hxk2/pHR)構建(1)用于HXKl基因敲除質粒PAGR-HXK1-A-B構建以釀酒酵母Y16基因組DNA為模板，分別以P3和P4、P5和P6兩對引物PCR擴增 HXKl基因5，端片段HXKl-A和3，端片段HXK1-B。HXK1-A片段經HindIII、Bgl II雙酶切， 所得酶切產物與同樣經過HindIII、Bgl II雙酶切的pAGR載體(pAG61載體改造而成)連 接，轉化DH5 α，篩選鑒定，獲得PAGR-HXK1-A質粒。PAGR-HXK1-A質粒Clal、Xbal雙酶切， 與ClalJbal酶切后的HXKl-B片段連接，轉化DH5 α，篩選鑒定，獲得PAGR-HXK1-A-B質粒。(2)用于ΗΧΚ2基因敲除質粒PAGR-HXK2-A-B構建以釀酒酵母Υ16基因組DNA為模板，分別以Ρ7和Ρ8、Ρ9和PlO兩對引物PCR擴 增ΗΧΚ2基因5，端片段ΗΧΚ2-Α和3，端片段ΗΧΚ2-Β。ΗΧΚ2-Α片段經HindIII、Bgl II雙酶 切，所得酶切產物與同樣經過HindIII、Bgl II雙酶切的pAGR載體連接，轉化DH5 α，篩選 鑒定，獲得PAGR-HXK2-A質粒。PAGR-HXK2-A質粒Kpn 1、Spel雙酶切，與Kpn 1、Spel酶切后 的ΗΧΚ2-Β片段連接，轉化轉化DH5 α，篩選鑒定，獲得PAGR-HXK2-A-B質粒。克隆HXKl基因片段A兩條引物序列是Ρ3 5' TCA AAGCTTTCTCAACTGCTTCTGTTTCCTCCTT(SEQ NO 3)HindIII9
P4 :5，ACCAGATCTCCTCTTGGTGCTTAGTGGTTCTCAT(SEQ NO 4)BglII克隆HXKl基因片段B兩條引物序列是P5 :5， ACCATCGATAAGATGGGTGTGATTTTCGGTACTG(SEQ NO 5)ClalP6 :5， ACCTCTAGATTTCGGACAATGCAGCAATAACAG(SEQ NO 6)Xbal克隆HXK2基因片段A兩條引物序列是P7 :5， TCA AAGCTTGAGTTTTCTGAACCTCCTCGCACA(SEQ NO 7)HindIIIP8 :5， ACCAGATCTGAAATGAAGTGCTTGGTAACGGC(SEQ NO 8)Bgl II克隆HXK2基因片段B兩條引物序列是P9 :5， AATGGTACCAAGAATCTCCAAGACCAGGCCAAC(SEQ NO 9)KpnlPlO :5， CAAACTAGTACGCAAGCTATCTAGAGGAAGTGTA(SEQ NO 10)Spel(3)釀酒酵母HXKl和HXK2基因雙缺失突變工程菌構建將(1)中PAGR-HXK1-A-B質粒Notl酶切，得到HXKl基因敲除盒DNA片段 HXK1-A-K1URA3-HXK1-B,采用醋酸鋰法轉化菊粉酶表達重組釀酒酵母工程菌pHR_INU/Y16， 在選擇性培養基SD-Ura篩選轉化子，轉化子再在含有5-F0A的SD培養基反篩，丟失HXKl 基因中整合的K1URA3基因，獲得HXKl基因缺失突變的Y16 Δ hxkl/pHR-INU菌株。將(1)中質粒PAGR-HXK2-A-B質粒Notl酶切，得到HXK2基因敲除盒DNA片段 HXK2-A-K1URA3-HXK2-B,采用醋酸鋰法轉化Y16 Δ hxkl/pHR-Inu菌株，在選擇性培養基 SD-Ura篩選轉化子，轉化子再在含有5-F0A的SD培養基反篩，丟失HXK2基因中整合的 K1URA3基因，獲得HXKl和HXK2基因雙缺失突變的Y16 Δ hxkl Δ hxk2/pHR_INU工程菌。實施例4 Y16AhxklAhxk2/pHR-INU工程菌利用菊芋原料發酵生產果糖。①將重組釀酒酵母工程菌Y16 Δ hxkl Δ hxk2/pHR_INU和對照菌株Y16/pHR_INU分 別接入3ml選擇性SD液體培養基中，在30°C，250rpm轉速搖床中培養過夜后作為種子液。 選擇性SD液體培養基成分為0. 67% YNB，2%葡萄糖，0. 002%尿嘧啶，0. 002%組氨酸和 0. 002%色氨酸。②將種子液以1 20的比例接入裝有40ml菊芋培養基的150ml三角瓶中，在 30°C，250rpm轉速搖床中培養96小時。菊芋培養基成分為12. 5%菊芋粉(由20目全菊芋 粉配制)。③每隔6-M小時吸取發酵液樣品，5000rpm離心5min沉淀菌體，對上清液糖組分 進行分析。結果如圖2-圖4所示，與對照相比，重組釀酒酵母工程菌Y16 Δ hxkl Δ hxk2/ PHR-INU能夠較快產生大量的果糖。產物總糖中果糖所占比例達到95%以上。序列表<210>1<211>32<212>DNA<213>artifical<400>1
tgaagcttat gaagttagca tactccctct tg32<210>2<211>32<212>DNA<213>artifical<400>2cagtcgactt gttcgttagt aaagtaagcc ca32<210>3<211>34<212>DNA<213>artifical<400>3tcaaagcttt ctcaactgct tctgtttcct cctt34<210>4<211>34<212>DNA<213>artifical<400>4accagatctc ctcttggtgc ttagtggttc teat34<210>5<211>34<212>DNA<213>artifical<400>5accatcgata agatgggtgt gattttcggt actg34<210>6<211>33<212>DNA<213>artifical<400>6acctctagat ttcggacaat gcagcaataa cag33<210>7<211>33<212>DNA<213>artifical<400>7tcaaagcttg agttttctga acctcctcgc aca33<210>8
<211>32
<212>DNA<213>artifical<400>8accagatctg aaatgaagtg cttggtaacg gc32<210>9<211>33<212>DNA<213>artifical<400>9aatggtacca agaatctcca agaccaggcc aac33<210>10<211>34<212>DNA<213>artifical<400>10caaactagta cgcaagctat ctagaggaag tgta34<210>11<211>33<212>DNA<213>artifical<400>11aggcggcgca aaacgacaag agaagcaaac aca33<210>12<211>35<212>DNA<213>artifical<400>12acaagcttat ctaacaaaaa aaaaattaaa tgtgt35<210>13<211>32<212>DNA<213>artifical<400>13atactagtgt catgtaatta gttatgtcac gc32<210>14<211>29<212>DNA<213>artifical<400>1412agcggccgcg gtaccggccg caaattaaaZ9<210>15<211>43<212>DNA<213>artifical<400>15agcttgatat cgagctcccg ggatccagct gggcccgtcg aca43<210>16 <211>43 <212>DNA <213>artifical <400>16ctagtgtcga cgggcccagc tggatcccgg gagctcgata tea43<210>17 <211>40<212>DNA<213>artifical<400>17atggatccgc ggccgcaaaa cgacaagaga agcaaacaca40<210>18 <211>41 <212>DNA <213>artifical <400>18acgaattcgt cgacatctaaattaaatgtg t41<210>19<211>39<212>DNA<213>artifical<400>19tgaagcttga gctctcatgt aattagttat gtcacgctt39<210>20 <211>35 <212>DNA <213>artifical <400>20atggatccgc atgcggtacc ggccgcaaat taaag35<210>21 <211>3325CN 102051373 A說明 書11/13頁
<212>DNA<213>克魯!隹酵母<400>21gaattctcaaaccgaaatggggcgttgttttaccccaggtatccggttgtagttggcact60ggggatggaaaaaaatgatgttgatgttgagttagttgggttgagtcaattagtgcgtga120aagtatcaccacttttgtcatccggcgtttctgtgcgaatC3.C3.C3.C3.C3.cacacagttt180attggagcacttgtttctggcgtattcgtaattgttctgcggtgcggttctgtgtgcatt240tttcctggggtgtctgccgcacctactcatcacccacgccgtgggtttgagccatggcgg300aggtacgactgactggctgcctgcctgcctgactgactgcctgactgcaggaaaagaggg360tttcgaaggaaaaacttttcctgtgttaatCCggCCgtgCgccgctgctcCclclclclt C CclC420cttcatgagaaggagtttga3.3.3.3.3. C 3.3.3.3.aaattcacatataaaaagcgtatctcgaga480tctcaaagtctcccttgaatCgtgtttgCCagttgtaactcatcctttattcttctattc540tatctctctctttccttcccctaatcagcaattaaatccggggtaaggaagaattactac600tgtgtgtaacggttatatttcgttttttattttttttttccattgccatagagaaagaaa660SLSLSLSLSLSLSLSLSLSLgagagtttgtgaagatcttccattcgaatcccataagtgacacatttaat720tttttttttgttagatatgaagttagcatactccctcttgcttccattggcaggagtcag780tgcttcagttatcaattacaagagagatggtgacagcaaggccatcactaacaccacttt840cagtttgaacagaccttctgtgcatttcactccatcccatggttggatgaacgatccaaa900tggtttgtggtacgatgccaaggaagaagactggcatttgtactaccagtacaacccagc960agccacgatctggggtactccattgtactggggtcacgctgtttccaaggatttgacttc1020ttggacagattacggtgcttCtttgggCCCaggttccgacgacgctggtgcgttcagtgg1080tagtatggttatcgattataacaatacttctggtttcttcaacagctctgtggacccaag1140acaaagagcagttgcagtctggaccttgtctaagggcccaagccaagcccagcacatcag1200ttactcgttggacggtggttacaccttccaacactattccgacaacgccgtgttggacat1260caacagctccaacttcagagaccctaaggtgttctggcacgagggcgagaacggcgaaga1320tggtcgttggatcatggccgttgctgaatcgcaagtgttctctgtgttgttctactcttc1380tccaaacttgaaaaactggaccttggaatccaacttcaccatcacggtctggactggtac1440ccaatacgaatgcccaggtctagttaaggttccatacgacagtgttgctgactcttcgaa1500ctcctccgactccaagccagactccgcatgggtcttgtttgtctccatcaaccctggtgg1560tccattgggtggttccgttacccaatactttgttggtgacttcaacggtactcacttcac1620tccaatcgacgaccaaaccagattcctagacatgggtaaggactactacgCclCtclCclclclC1680tttcttcaacactccaaacgagaaggacgtctacggtatcgcatgggcttctaactggca1740atacgcccaacaagccccaactgacccatggcgttcatctatgagtttggttagacaatt1800cacattgaaagacttcagcacaaaccctaactccgccgatgtcgtcttgaacagtcaacc1860agtcttgaactatgatgctttgagaaagaacggtaccacttacagcatcaCclclclCtclCclC1920cgtcacctccgaaaacggcaagaagatcaagctagacaacccatccggttctcttgaatt1980ccatcttgaatacgtgtttaacggctccccagatatcaagagcaacgtgttcgctgatct2040ttccttgtacttcaagggtaacaacgacgacaacgaatacttgagattgggttacgaaac2100caacggtggtgccttcttcttggaccgtggccacaccaagattcctttcgtgaaggagaa2160
cttgttcttcaaccaccaattggcagttaccaacccagtttccaactacaccacaaacgt2220cttcgacgtttacggtgtcattgacaagaacatcatcgaattgtacttcgacaacggtaa2280cgtcgtctccaccaacactttcttcttctc13<CC3HC3<3<Cgttattggtgaaattgacat2340caagtcaccatacgacaaggcttacaccattaactcatttaacgttacccaatttaacct2400ttgatctgatctgggcttactttactaacg3.3.3.3.3.3.C C 3.3.2460tcagtccttctcttcttacgatatgatatgattaaatgatgctatgaaatcatcttcttc2520ttaactttcttaaatcttacgcgtcacttactctatatacccgtttagctttgcctggtc2580acagcgacattttatataagtgtacgtattttcttttttt 3.3.3.3.3. ttctattcta2640accttagaaaagtgccctttaaaccagctgtcctggcactatatctttatcatgtgccgg2700tcgctttccctttccgtttcccttttcctttcaattggtggcctggaattccgaactcat2760tttcgcatctgaaactaattctcgaaacctttaacatcaaacaattgaaaagatcatcat2820caccagaaataagaaaaagatcaacacaacagctaataacagtacgaaagaaagatcgct2880cgagtgaaaaggcagccaagaccggtcattcgatctgggtctagactgattatagacata2940ccaattgcactcagtaagaaaatgagtttcaaatttgacgatgacggtgtggtaaaagaa3000tttcacggcgacaccatcatatgccatattCC t C3HC3<3<3<ccgaattcttcaacaaattg3060ttggacttctaccgttttgcgaaacgactttccttctacgacaagatcaccctacttcct3120ccttcaagctaccacgttacgatcatgaattgctgccacgaacacgatcgttctgagggc3180cactggcccaaaggtaatcgatccggacacaagcatgctgcggtgtacatctacatctga3240ccaacattctaacgtccgagaatgcggccactgcgggctctgctgattccgaactcgaat3300tacaggtgta tcacagccct gccta332權利要求
1.一種生產高純度果糖的釀酒酵母系統，其特征在于，該系統包括釀酒酵母菌株、菊粉 酶基因表達盒、HXKl基因敲除盒DNA片段、HXK2基因敲除盒DNA片段和由酵母終止子、釀酒 酵母2 μ質粒完整序列、酵母營養缺陷篩選基因、酵母啟動子序列依次連接構成的酵母-大 腸桿菌穿梭質粒的酵母載體部分。
2.如權利要求1所述的釀酒酵母系統，其特征在于，所述的酵母啟動子是酵母菊粉酶 基因啟動子、TEFl基因啟動子、ADHl基因啟動子、ADH2基因啟動子、GAPDH基因啟動子、GALl 基因啟動子、GALlO基因啟動子中的任意一種，或者其中兩種及兩種以上啟動子的融合啟動 子。
3.如權利要求1所述的釀酒酵母系統，其特征在于，所述的酵母終止子是菊粉酶基因 終止子、CYCl基因終止子、TEFl基因終止子、ADHl基因終止子中的一種或者幾種。
4.如權利要求1所述的釀酒酵母系統，其特征在于，所述的酵母營養缺陷篩選基因是 LEU2、ADE2、URA3、TRP1或者HI S3中的一種或者幾種。
5.一種利用權利要求1所述的釀酒酵母系統生產果糖的方法，其特征在于，該方法包 括如下步驟(1)酵母-大腸桿菌穿梭質粒的酵母載體部分與菊粉酶基因表達盒共轉染釀酒酵母菌 株，獲得菊粉酶表達重組釀酒酵母工程菌；(2)將HXKl基因敲除盒DNA片段、HXK2基因敲除盒DNA片段先后轉化菊粉酶表達重組 釀酒酵母工程菌，獲得釀酒酵母HXKl和HXK2基因雙缺失突變工程菌；(3)將釀酒酵母HXKl和HXK2基因雙缺失突變工程菌接種于培養基，制備種子液，發酵， 獲得果糖。
6.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟3以菊芋為原料生產果糖。
7.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，制備種子液的培養基是選擇性培養基或菊芋培養基。
8.如權利要求7所述的制備方法，其特征在于，菊芋培養基糖濃度2-20%w/Vo
9.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，發酵培養基糖濃度2-20%w/Vo
10.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，制備種子液的溫度為^°C-32°C，時間 為 12h-120h。
全文摘要
本發明屬生物基因工程技術領域，提供了一種生產高純度果糖的釀酒酵母系統。該系統包括釀酒酵母菌株、菊粉酶基因表達盒、HXK1基因敲除盒DNA片段、HXK2基因敲除盒DNA片段和由酵母終止子、釀酒酵母2μ質粒完整序列、酵母營養缺陷篩選基因、酵母啟動子序列依次連接構成的酵母-大腸桿菌穿梭質粒的酵母載體部分。利用該系統，能夠在菊芋培養基中生長，分泌菊粉酶水解菊粉成為果糖和葡萄糖。在發酵過程中，工程菌僅利用葡萄糖而不消耗果糖，導致果糖在發酵液中積累。利用本發明，能夠直接以菊芋原料生產高純度果糖或者高果糖漿，傳統的果糖生產工藝相比，具有工藝簡單、成本低、效率高的特點。
文檔編號C12N15/81GK102051373SQ200910198659
公開日2011年5月11日 申請日期2009年11月11日 優先權日2009年11月11日
發明者俞靜, 劉建平, 李育陽 申請人:復旦大學