專利名稱：一種源于普通小麥ap2/erf家族的抗凍轉錄因子及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及作物遺傳育種領域，具體涉及一種源于普通小麥AP2/ERF家族的抗凍 轉錄因子及其制備方法與應用。
背景技術：
小麥是我國重要的糧食作物之一，改良其產量和品質對確保我國農業持續穩定的 發展具有十分重要的戰略意義。小麥的一生處于多種非生物脅迫之中，如干旱、高鹽和極端 溫度等逆境，這些脅迫都對植物生長發育產生不利的影響而最終影響其產量和品質楊獻 光等，麥類作物學報，2006，沈(6) :158-161。通過提高單產或擴大種植面積等途徑增加小 麥產量都面臨克服逆境限制或減輕逆境危害的問題。因此，認識小麥對逆境的反應機制，提 高小麥的抗逆性，已成為小麥進一步增產增收的重要基礎。轉錄因子(Transcription factor)又稱反式作用因子，是和專一性DNA序列結 合并激活或抑制其他功能基因轉錄的蛋白質分子。近年來，相繼分離出大量不同類型的轉 錄因子，根據轉錄因子保守DNA結合域的不同，可分為十幾類家族，如AP2/ERF、bZIP、WRKY 和 MYB 等Allen 等，The EMBOJournal，1998，17 (18) :5484-5496] 很多轉錄因子涉及到 植物逆境抗性，AP2/ERF是其中重要的一個家族。AP2/ERF家族轉錄因子通過參與乙烯、脫 落酸、茉莉酸和水楊酸等信號轉導途徑，調控下游基因的表達，從而提高植物的抗性和耐受 性。自從在擬南芥分離克隆AP2/ERF家族成員APETALA2以來，已經從水稻、玉米、葡萄和 油菜等多種植物中分離了一批AP2/ERF家族轉錄因子，并對它們與逆境脅迫抗性的相關功 能進行了研究。根據AP2結構域的數量和序列結構，AP2/ERF家族轉錄因子分為五個亞族 ERF (Ethylene-Responsive-Element-Binding-Factor)、DREB/CBF (Dehydration-Responsi ve-Element-Binding/CRT-Binding-Factor) > AP2 (APETALA2) > RAV (related to ABI3/VP) 和單獨(Soloist)。根據氨基酸同源性關系，其中ERF亞族又進一步分為Bi、B2、B3、B4、 B5 禾口 B6 六個組，DREB/CBF 亞族又分 Al、A2、A3、A4、A5 禾口 A6 六個組Sakuma 等，Biochem Biophys Res Commun, 2002, 290 :998-1009] AP2/ERF 家族轉錄因子一般由 DNA 結合域 (DNA-binding-domain)、轉錄i周控域(Transcription-regulation-domain)、寡聚化位 (Oligomerization-site)禾口核定位/[言號(Nuclear-localization-signal)四^^功能域組 成，轉錄因子通過功能域與啟動子順式作用元件(cis-acting-element)或與其他轉錄因 子的功能域相互作用來調控基因的轉錄表達Allen等，The EMBO Journal, 1998,17 (18) 5484-5496。AP2/ERF家族轉錄因子不同亞族之間，不僅氨基酸序列不同，功能也存在差異。一 般認為，ERF亞族轉錄因子識別結合的順式作用元件多為GCC盒，主要調控乙烯應答以及抗 病相關基因的表達。DREB/CBF亞族轉錄因子通常識別結合干旱應答元件DRE，調控一些與 干旱、高鹽和低溫耐性有關的基因表達。而AP2亞族轉錄因子往往同開花等過程有一定的 關系。通常認為低溫、干旱、高鹽和ABA是DREB/CBF亞族的誘導因素，而乙烯和茉莉酮酸酯是ERF亞族的誘導因素。而且同為DREB或是ERF亞族中不同組的轉錄因子功能也有所分 工Gutterson 等，Curr Opin Plant Biol，2004，7 :465-471 。小麥感應脅迫信號，并通過一系列信號傳遞最后啟動相關基因表達，由這些基因 產物來協助小麥適應或抵御逆境。AP2/ERF家族轉錄因子能特異地結合相關順式作用元件， 從而調控大量逆境應答基因的表達，使得轉基因植株同時獲得抗寒、抗旱和耐鹽的綜合抗 性，使植物的抗逆性得到了較為理想的綜合改良，其在小麥抗逆過程中的作用受到越來越 廣泛的重視李根英等，麥類作物學報，2003, 23 (2) :92-96。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種源于普通小麥AP2/ERF家族的抗凍轉錄 因子，其堿基序列為SEQ ID No 1。所述轉錄因子編碼的蛋白質，其氨基酸序列為SEQ ID No 2。所述源于普通小麥AP2/ERF家族的抗凍轉錄因子為TaERF_B3基因。所述TaERF_B3基因編碼閱讀框由71 Ibp組成，編碼成一個236個氨基酸的蛋白質所述源于普通小麥AP2/ERF家族的抗凍轉錄因子在制備抗逆轉基因植物中的應用。所述源于普通小麥AP2/ERF家族的抗凍轉錄因子在植物轉化中的應用。所述源于普通小麥AP2/ERF家族的抗凍轉錄因子基因的制備方法，包括以下步 驟1)小麥cDNA文庫的構建選取小麥幼苗提取總RNA，以總RNA為模板、Oligo (dT) 為引物，在AMV反轉錄酶的作用下合成cDNA。2)設計一對弓丨物正向引物 GGATCCATGGCGTTCACGCACCGGCACG，反向引物 GAGCTCTC AGAATTCTCAGTTGACGACCGAGAGCTG ；以上述cDNA為模板進行PCR擴增，獲得小麥AP2/ERF家 族轉錄因子基因TaERF-B3基因片段。3)將上述擴增片段回收后克隆入T載體，測序后即獲得小麥抗逆AP2/ERF家族轉 錄因子基因，即TaERF-B3基因。上述制備方法的具體實驗步驟如下1.構建小麥cDNA文庫將小麥種子經(v/v) NaOCl消毒后種植在黑土 珍珠巖蛭石(1 1 1)混 合基質中，22°C、l^i光照培養生長20d。選生長健壯的幼苗提取總RNA。以總RNA為模板， Oligo (dT)為引物，參照東洋紡上海生物科技有限公司cDNA合成試劑盒說明(http://WWW. bio-toyobo. cn/)，在AMV反轉錄酶的作用下合成cDNA。2.引物的設計與合成設計一對引物，引物兩端分別引入Bam HI和Mc I的酶切位點。
正向引物 GGATCCATGGCGTTCACGCACCGGCACG，反向引物GAGCTCTCAGAATTCTCAGTTGACGACCGAGAGCTG。引物由上海生工生物工程技術有限公司合成(http://WWW. sangon. com/)。3. PCR方法獲得普通小麥AP2/ERF家族抗凍轉錄因子TaERF_B3基因片段PCR擴增采用大連寶生物工程有限公司(http://takara.com.cn/)的PCR試劑，在50 μ 1的體系中進行PCR反應，反應參數為94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin， 共擴增30個循環，再72°C延伸lOmin。經過1. Owt%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物為一 條約700bp的片段(參見圖1)。4.克隆鑒定與序列測定擴增片段采用杭州維特潔生化技術有限公司(ymi axygen. com. cn/)DNA瓊脂糖 凝膠回收試劑盒，回收后克隆到大連寶生物工程有限公司(http://takara.com.cn/)的 pMD-18-Simple T載體上進行克隆鑒定和序列測定。5.序列分析通過核苷酸序列測定分析，獲得普通小麥AP2/ERF家族轉錄因子TaERF_B3基因片 段，它具有如下的堿基和氨基酸序列信息。堿基序列如下
1ATGGCGTTCACGCACCGGCACGACCTCGACCTCATCCGCGCCCACCTCCTCGACGACCTC
61CACGCGGACGCCGTCGCCCTCGCCAGCAGCGGCGGTGACTCCGACTCGAGTGCTTCGTCG
121CCGCCTGGGTGGCGGAGGCCGGCGCTCTCCTTGTCGCTGCCGCCGMGCTAGCGATGACG
181GTCATGGAGCAGCAGCCTCAGCAGGAGAGCTGCGGCTACGTGGAGGGACAGGACGAGGAG
241GAGGACTTCCGGCGGTACCGGGGCGTGCGGCTGAGGTCGTGGGGCMGTTCGCGGCGGAG
301ATCAGGGACCCGGCGCGGMGGGCGCGCGCGTGTGGCTCGGCACCTACGACGACGCCGTG
361GAGGCCGCGCGCGCCTACGACCGCGCCGCCTTCCGCCTCCGCGGGTCCMGGCCATCCTC
421MCTTCCCCAACGAGGTCGGCACCCMTCCATCCMTGGACCTCGCCTGCTCCCCTCGCC
481GACACCATCGCTGCCGTGCCCACCGGCGGCMGAGGATGAGGCCGGCACAGGAGGMGAG
541CGCCTGAGGGAGGTGMGMGGAGAGGCTGCAGCTGAMGAGGAGGAGGAGGAGGGTGCT
601AGGGACGCCGACTTCTGGGAGGAGCTGMGGTGATCTGCAGCCTGCCGCCCCTCTCGCCG
661CTGTCGCCGTACCCGCACTT CGCCTTCCCG CAGCTCTCGG TCGTCAACTG A。
氨基酉堯序列如下1MAFTHRHDLDLIRAHLLDDL
21HADAVALASSGGDSDSSASS
41PPGWRRPALSLSLPPKLAMT
61VMEQQPQQESCGYVEGQDEE
81EDFRRYRGVRLRSWGKFAAE
101IRDPARKGARVWLGTYDDAV
121EAARAYDRAAFRLRGSKAIL
141NFPNEVGTQSIQWTSPAPLA
161DTIAAVPTGGKRMRPAQEEE
181RLREVKKERLQLKEEEEEGA
201RDADFWEELKVICSLPPLSP
221LSPYPHFAFPQLSVVN本發明實現的有益效果本發明克隆了普通小麥AP2/ERF家族轉錄因子基因，即TaERF_B3基因，為了進一 步分析該基因在低溫逆境中的作用與功能，比較了轉TaERF-B3基因的擬南芥植株和野生型擬南芥植株對低溫脅迫的耐受性。結果表明野生型和轉TaERF-B3基因擬南芥植株在存 活率上有明顯的差異，轉基因植株比野生型擬南芥有明顯的抗凍能力，這也表明TaERF-B3 的轉入提高了擬南芥植株的抗低溫的能力。
圖1為瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物結果。圖2為本發明的普通小麥AP2/ERF家族抗凍轉錄因子的進化樹分析結果。
具體實施例方式以下結合具體實施例進一步詳細描述本發明的技術方案。下述實施例中，所用的試驗材料及其來源分別如下普通小麥的種子經過(VZV)NaOCl消毒后種植在黑土 珍珠巖蛭石 (1:1: 1)的基質中，22°c，培養(1^1光照，8h黑暗，冷光源)生長20天。大腸桿菌(Escherichia coli)DH5 α和釀酒酵母菌株由上海市農業科學院生物技 術研究所植物基因工程研究室保存。克隆載體pMD-18-Simple Τ、各類限制性內切酶、Taq 聚合酶、連接酶、dNTP、10XPCR buffer和DNAmarker購自寶生物工程大連有限公司。所有 的化學試劑都從美國西格瑪化學公司和上海國藥化學試劑公司購買。ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA測序試劑盒購自美國應用系統公司。下述實施例中常規的基因操作參照分子克隆文獻進行Sambrook J, FretsE F， Mannsdes T et al. In :Molecular Cloning. 2nd ed. Cold Spring HarborLaboratory Press,1989。實施例1普通小麥幼苗RNA的抽提和cDNA合成(一 )試驗方法1、RNA 的抽提加入IOOmL提取緩沖液(小麥RNA提取緩沖液配方CTAB 3% (ff/V) ；PVP 3% (W/ V) (Mw 4000) ；EDTA 25mM ；NaCl 2. OM ；Tris-HCl IOOmM, ρΗ8· 0 ；Spermidine 0.5g/L ；DEPC 0. 1% (V/V) ；0. 1% DEPC 處理的 SDS 0. 5% (W/V) ；0. 1% DEPC 處理的 LiCl 10Μ)到 50mL 聚丙烯管，65°C預熱。稱取5g植物材料倒入液氮使材料始終保持凍結和易碎的狀態，研磨。研磨后細粉轉移至預先加入65°C預熱的提取緩沖液的50mL離心管。將離心管放入65°C水浴45min，并偶爾搖動以混合各成分。加入等體積氯仿-異戊醇混合液，輕柔地上下顛倒混合約lOmin。在18°C，于 12000g 離心 IOmin0吸取上清液，重復5，6步驟操作。吸取上清液，加入1/4體積的10M LiCl溶液，徹底混勻，4°C放置12h。在4"C，12000g 離心 30min。RNA沉淀用500 μ L 0. 5% SDS輕柔溶解，用氯仿-異戊醇混合液抽提，4°C，12000g 離心30min。
7
上清液轉移至另一新的管子，加入2倍體積-20°C冰冷的無水乙醇，充分混合，放 置在_20°C條件下2h，沉淀總RNA。12000g，4°C離心30min，用75%乙醇漂洗兩次，保留RNA，真空風干。用200yL DEPC處理的去離子水重新溶解，取少量用于RNA質量和濃度的檢測，其 余儲存于_70°C，備用。2、cDNA 合成WA01igo(dT)20(10pmol/yL)lyl ；總 RNA :10 IOOng ；補足 RNaseFree H20 到 12μ Lo65°C，5min后，立即置于冰上。再力口入 5 X RT Buffer 4 μ L ；dNTP Mixture (各 IOmM) 2 μ L ；RNaseInhibitor (IOU/ yL)lyL;反轉錄酶IyL0反轉錄反應過程為30°CIOmin ；42°C 20min ；85°C 5min ；4°C 5min。瞬間離心，保存。( 二)試驗結果采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA產物，結果可見明顯的RNA條帶。實施例2PCR方法獲得普通小麥AP2/ERF家族的抗凍轉錄因子TaERF_B3基因片段(一 )試驗方法設計一對正向和反向引物，為了克隆鑒定等構建的需要，引物兩端分別引入Bam HI和Mc I的酶切位點。引物序列為正向引物GGATCCATGGCGTTCACGCACCGGCACG，反向引 物 GAGCTCTCAGAATTCTCAGTTGACGA CCGAGAGCTG。PCR 反應體系10XPCR buffer 5. 0 μ L ;dNTPs (各 2. 5mM) 4 μ 1 ；普通小麥幼苗 的cDNA模板1 μ 1 QOng)；正向引物0. 5 μ 1 ；反向引物0. 5 μ 1 ；Ex-TaqO. 4 μ 1 (預變性后加 入)；加無菌水定容至50 μ 1。PCR反應程序94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共擴增30個循環，再 72°C延伸 IOmin0( 二)試驗結果經過1. Owt%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物為一條約700bp的片段(參見圖1)。實施例3克隆鑒定、序列測定(一)試驗方法擴增片段采用杭州維特潔生化技術有限公司DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后 克隆到大連寶生物工程有限公司的pMD-18-Simple T載體上進行克隆鑒定和序列測定。通過核苷酸序列測定分析，最終獲得普通小麥AP2/ERF家族轉錄因子TaERF_B3基 因，具有如SEQ ID No 1和SEQ ID No 2的堿基和氨基酸序列信息(參見下文序列表)。進化樹繪制使用NJ (Neighbor-joining)方 ^ [Saitou 等，Mol Biol Evol, 1987，4 :406-425 ，利用程序 MEGA4 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA) software version 4. 0) (http://www.megasoftware.net/mega.html)完成Tamura等，Mol Bio Evo，2007，24 :1596-1599。
(二)試驗結果測序分析結果顯示所述普通小麥AP2/ERF家族的抗凍轉錄因子TaERF_B3基因編 碼閱讀框由711bp組成，編碼成一個236個氨基酸的蛋白質(參見序列表)。構建的同源進化樹表明普通小麥AP2/ERF家族的抗凍轉錄因子TaERF_B3基因在 進化關系上屬于AP2/ERF家族的抗凍轉錄因子中的ERF-B3亞族(參見圖2)。實施例4擬南芥轉化(一)試驗方法1.農桿菌的準備1)挑取農桿菌單菌接種于5mL LB液體培養基(利福平50 μ g/mL，氯霉素100 μ g/ mL)中，28°C，250轉/分鐘培養20h。2)取ImL菌液轉接入20_30mL LB液體培養基(利福平50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/ mL)中，28°C，250 轉 / 分鐘培養約 12h，測 OD 600 ^1.5。；3)8000轉/分鐘，4°C，IOmin離心收集菌體，重懸于農桿菌轉化滲透液(5wt%蔗 糖，0. 05% Silwet L-77)并稀釋至 OD 600 ^ 0. 8。2.擬南芥蘸花法轉化1)將擬南芥的花苔浸入滲透液中，輕輕攪動約IOs后取出，全部轉化完畢后，托盤 中加入水，用保鮮膜罩住擬南芥，以保持濕潤環境，水平放置22°C避光培養，24h去掉保鮮
膜直立培養。2)初次轉化四天后，可再進行一次轉化，重復兩次，總共轉化三次，這樣可以對花 序上發育的不同時期的花蕾進行轉化，提高轉化效率。3)生長約兩個月后，收集種子，4°C冰箱貯存待用。(二)試驗結果經過蘸花法轉化的擬南芥生長約兩個月后，正常開花結子。實施例5擬南芥種子的篩選(一)試驗方法1)稱25_30mg種子放入1. 5mL離心管。2) ImL 75wt%乙醇消毒Imin (不停搖晃振蕩)，8000轉/分鐘離心5s，去上清。3)加入ImL過濾后的漂白粉(5% )消毒15min(不停搖晃振蕩，充分消毒)，8000 轉/分鐘離心&，去上清。4)無菌水洗滌3-4次。5)將種子均勻的播撒到V2MS平板(潮霉素50μ g/mL)上，Paraf i Im膜封口，4°C 冰箱放置兩天，220C，16h光照培養6天。6)將抗性植株移栽到盆中培養，苗稍大后，進行GUS活性檢測，選出陽性植株(Ttl) 培養至開花結實，收集Ttl植株上所結T1種子。實施例6普通小麥AP2/ERF家族轉錄因子TaERF_B3基因轉化植物后的抗逆分析幼苗生長10-20天，轉入4°C低溫馴化M小時，然后轉入_20°C處理30分鐘，然后再移置到正常溫度，觀察植物的耐冷效果。(二)試驗結果結果表明，野生型和轉TaERF_B3基因擬南芥植株在存活率上有明顯的差異，轉基 因植株比野生型擬南芥抗凍能力有明顯提高。經過抗凍處理的轉基因與野生型擬南芥的存 活率如表1所示。表1轉基因與野生型擬南芥的抗凍后存活率
權利要求
1. 一種源于普通小麥AP2/ERF家族的抗凍轉錄因子，其特征在于，所述轉錄因子的堿 基序列為SEQ ID No 1，具體如下1ATGGCGTTCACGCACCGGCACGACCTCGACCTCATCCGCGCCCACCTCCTCGACGACCTC61CACGCGGACGCCGTCGCCCTCGCCAGCAGCGGCGGTGACTCCGACTCGAGTGCTTCGTCG121CCGCCTGGGTGGCGGAGGCCGGCGCTCTCCTTGTCGCTGCCGCCGAAGCTAGCGATGACG181GTCATGGAGCAGCAGCCTCAGCAGGAGAGCTGCGGCTACGTGGAGGGACAGGACGAGGAG241GAGGACTTCCGGCGGTACCGGGGCGTGCGGCTGAGGTCGTGGGGCAAGTTCGCGGCGGAG301ATCAGGGACCCGGCGCGGAAGGGCGCGCGCGTGTGGCTCGGCACCTACGACGACGCCGTG361GAGGCCGCGCGCGCCTACGACCGCGCCGCCTTCCGCCTCCGCGGGTCCAAGGCCATCCTC421AACTTCCCCAACGAGGTCGGCACCCAATCCATCCAATGGACCTCGCCTGCTCCCCTCGCC481GACACCATCGCTGCCGTGCCCACCGGCGGCAAGAGGATGAGGCCGGCACAGGAGGAAGAG541CGCCTGAGGGAGGTGAAGAAGGAGAGGCTGCAGCTGAAAGAGGAGGAGGAGGAGGGTGCT601AGGGACGCCGACTTCTGGGAGGAGCTGAAGGTGATCTGCAGCCTGCCGCCCCTCTCGCCG661CTGTCGCCGTACCCGCACTTCGCCTTCCCGCAGCTCTCGGTCGTCAACTGA0
2.如權利要求1所述的源于普通小麥AP2/ERF家族的抗凍轉錄因子，其特征在于，所述 轉錄因子基因編碼的蛋白質，其氨基酸序列為SEQ ID No 2，具體如下1MAFTHRHDLDLIRAHLLDDL21HADAVALASSGGDSDSSASS41PPGWRRPALSLSLPPKLAMT61VMEQQPQQESCGYVEGQDEE81EDFRRYRGVRLRSWGKFAAE101IRDPARKGARVWLGTYDDAV121EAARAYDRAAFRLRGSKAIL141NFPNEVGTQSIQWTSPAPLA161DTIAAVPTGGKRMRPAQEEE181RLREVKKERLQLKEEEEEGA201RDADFWEELKVICSLPPLSP221LSPYPHFAFPQLSVVN
3.如權利要求1所述的源于普通小麥AP2/ERF家族的抗凍轉錄因子，其特征在于，所述 轉錄因子為TaERF-B3基因。
4.如權利要求3所述的源于普通小麥AP2/ERF家族的抗凍轉錄因子，其特征在于，所述 TaERF-B3基因編碼閱讀框由711bp組成，編碼成一個236個氨基酸的蛋白質。
5.一種制備權利要求1所述的源于普通小麥AP2/ERF家族的抗凍轉錄因子的方法，包 括以下步驟1)構建小麥cDNA文庫選取小麥幼苗提取總RNA，以總RNA為模板、Oligo(dT)為引物， 在AMV反轉錄酶的作用下合成cDNA ；2)設計一對引物正向引物GGATCCATGGCGTTCACGCACCGGCACG， 反向引物GAGCTCTCAGAATTCTCAGTTGACGACCGAGAGCTG ；以上述cDNA為模板進行PCR擴增，獲得小麥AP2/ERF家族抗凍轉錄因子基因TaERF_B3 基因片段；3)將上述擴增片段回收后克隆入T載體，測序后即獲得小麥抗逆AP2/ERF家族轉錄因 子TaERF-B3基因。
6.權利要求1所述的源于普通小麥AP2/ERF家族的抗凍轉錄因子在制備抗逆轉基因植 物中的應用。
7.權利要求1所述的源于普通小麥AP2/ERF家族的抗凍轉錄因子在植物轉化中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種源于普通小麥AP2/ERF家族的抗凍轉錄因子及其制備方法與應用。所述普通小麥AP2/ERF家族的抗凍轉錄因子為TaERF-B3基因，其堿基序列為SEQ ID No 1，其蛋白質的氨基酸序列為SEQ ID No 2。本發明利用聚合酶擴增技術從普通小麥幼苗中克隆普通小麥AP2/ERF家族轉錄因子基因序列，所獲得的轉錄因子基因用于植物轉化，培育提高植物抗逆性。
文檔編號C12N15/10GK102094005SQ20091020101
公開日2011年6月15日 申請日期2009年12月11日 優先權日2009年12月11日
發明者付曉燕, 姚泉洪, 彭日荷, 朱波, 熊愛生, 田永生, 趙偉, 金曉芬, 高峰 申請人:上海市農業科學院