專利名稱：一種甘藍型油菜ap2/erf家族轉錄因子基因及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及作物遺傳育種領域，具體涉及一種甘藍型油菜AP2/ERF家族轉錄因子 基因及其制備方法和應用。
背景技術：
植物一生面臨很多的生物和非生物脅迫，嚴重影響植物的生長發育，從而影響作 物的產量。植物在生長發育和對外界刺激的應答反應中，需要對各種逆境和發育信號作出 反應，這就要求對各種功能基因的表達進行精確調控。植物基因表達存在著精確的位置、時 間和空間上的次序性。研究表明導致這種基因表達差異的主要原因是轉錄因子在轉錄水 平上的調節作用。植物通過一系列信號傳導激發相應的轉錄因子，從而啟動相應功能基因 的轉錄表達，最后通過基因產物對外界信號在生理生化等方面作出合適的響應Yamaguchi 和Shinozaki，Annu Rev Plant Biol，2006，57 :781_803。很多基因被這些脅迫誘導表達， 以增強植物對逆境的抗性。轉錄因子是其中重要的一類調控基因，通過與順式元件相互作 用調節植物對各種環境脅迫的適應。隨著分子生物學與生物技術的發展，人們從分子水平對植物抗逆境脅迫開展了 多方面的研究，其研究范圍主要集中在信號傳導及基因表達調控等方面Xiong等，Plant Cell,2002,14 :165_183。目前已經從植物中分離克隆了數十類與提高逆境脅迫抗性相關 的功能基因Chinnusamy等，J Exp Bot，2004，55 :225_236。根據基因編碼產物的功能，可 將它們分成兩個大類(1)編碼直接保護細胞免受逆境脅迫傷害的功能蛋白的基因(如胚 胎發育晚期豐富LEA蛋白、抗凍蛋白、水通道蛋白、離子通道蛋白和伴侶蛋白等)，編碼滲透 調節因子合成酶的基因(如糖醇、脯氨酸、甜菜堿等)，編碼毒性物質的降解酶的基因(如谷 胱甘肽-S-轉移酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及抗壞血酸過氧化物酶等)。抗逆相關功 能蛋白基因的克隆及功能研究，為通過基因工程改良植物的抗逆性開辟了新途徑。人們將 與提高逆境脅迫抗性相關的功能蛋白基因進行遺傳轉化，使轉基因植物的抗逆性有了不同 程度的提高。目前已經通過LEA蛋白基因、脯氨酸合成酶基因及甜菜堿合成酶基因的轉化， 獲得了一些抗旱、耐鹽性顯著提高的轉基因植物。(2)逆境脅迫下信號傳導及轉錄調控有關 的基因，包括感應及轉導脅迫信號的蛋白激酶(如MAP激酶、CDP激酶、受體蛋白激酶、核 糖體蛋白激酶和轉錄調控蛋白激酶等)，信號傳導中起重要作用的蛋白酶(如磷酸酯酶、磷 脂酶C等)，抗逆相關的轉錄因子基因有bZIP轉錄因子、WRKY轉錄因子、MYC/MYB類、AREB 類及AP2/ERF類轉錄因子等劉強等，科學通報，2000，45 :1465_1474。AP2/ERF家族是植 物中重要的一類轉錄因子，包含一個高度保守的AP2-DNA結合域，其基因編碼的產物具有 廣泛的功能Okamuro 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997,94 :7076-7081 。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種甘藍型油菜AP2/ERF家族轉錄因子基因，其堿基序列為SEQ ID No 1。所述轉錄因子基因編碼的蛋白質，其氨基酸序列為SEQ ID No 2。所述甘藍型油菜AP2/ERF家族轉錄因子基因為&iaERF-B3_8基因。所述&iaERF-B3_8基因編碼閱讀框由603bp組成，編碼成一個200個氨基酸的蛋 白質。所述甘藍型油菜AP2/ERF家族轉錄因子基因在制備抗逆轉基因植物中的應用。所述甘藍型油菜AP2/ERF家族轉錄因子基因用于植物轉化。所述甘藍型油菜AP2/ERF家族轉錄因子基因的制備方法，包括以下步驟1)油菜cDNA文庫的構建選取油菜幼苗提取總RNA，以總RNA為模板、Oligo (dT) 為引物，在AMV反轉錄酶的作用下合成cDNA。2)設計一對弓丨物正向引物 GGATCCATGGCAACTA TTGAGGAAATC,反向引物 GAGCTCTC AGAATTCGTTTGATGATGAATTGC ；以上述cDNA為模板進行PCR擴增，獲得油菜AP2/ERF家族轉 錄因子基因&iaERF-B3-8基因片段。3)將上述擴增片段回收后克隆入T載體，測序后即獲得油菜抗逆AP2/ERF家族轉 錄因子BnaERF-B3-8基因。上述制備方法的具體實驗步驟如下1.油菜cDNA文庫的構建本發明將油菜種子經(VZV)NaOCl消毒后種植在黑土 珍珠巖蛭石 (1:1: 1)混合基質中，22°C、1^1光照培養生長20d。選生長健壯的幼苗提取總RNA。以 總RNA為模板，Oligo (dT)為引物，參照東洋紡上海生物科技有限公司cDNA合成試劑盒說 明(http://www. bio-toyobo. cn/)，在AMV反轉錄酶的作用下合成cDNA。2.引物的設計與合成設計一對引物，引物兩端分別引入Bam HI和Me I的酶切位點。正向引物 GGATCCATGGCAACTA TTGAGGAAAT C ；反向引物 GAGCTCTCAGAATTCGTTTGATGATGAATTGC。引物 由上海生工生物工程技術有限公司合成(http://WWW. sangon. com/)。3. PCR方法獲得甘藍型油菜AP2/ERF家族轉錄因子&iaERF-B3_8基因片段PCR擴增采用大連寶生物工程有限公司(http://takara. com. cn/)的PCR試劑，在 50 μ 1的體系中進行PCR反應，反應參數為94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共 擴增30個循環，再72°C延伸lOmin。經過1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物為一條約 600bp的片段(參見圖1)。4.克隆鑒定與序列測定擴增片段采用杭州維特潔生化技術有限公司(ymi axygen. com. cn/)DNA瓊脂糖 凝膠回收試劑盒，回收后克隆到大連寶生物工程有限公司(http://takara.com.cn/)的 pMD-18-Simple T載體上進行克隆鑒定和序列測定。5.序列分析通過核苷酸序列測定分析，獲得甘藍型油菜AP2/ERF家族轉錄因子&iaERF-B3_8 基因片段，它具有如下的堿基和氨基酸序列信息。堿基序列1 ATGGCAACTATTGAGGAAATCTCTGATTTGGAGAAGCATCTCTTTGAAGACTTGATGATC
61CCTGATGGTTTCATGGAAGATTTTGTCTTTGATGACGCTGCTTTTTTCTCAGGACTCTGG
121TCTCTAGAACCCTTAAACCAAGTTCCTAAACAGGAGCCTAGTTCACCGGCTCTTGATCCA
181GATTTCTATGTCCAAGAGTTTCTGCAAATGGAAGCAGAATCATCATCATCAACAACAACA
241ACAACTACAACTACAACATCACCTGAGGTTGAAACTGTCTCAAACCGGAAAAGATCAAAG
301AGAGCTGAAGAGACAAGGCATTACAGAGGCGTGAGAAGGAGGCCATGGGGAAAATTCGCA
361GCAGAGATTCGAGATCCGGCGAAGAAAGGATCAAGGATTTGGCTAGGCACTTTTGAGAGT
421GATATTGATGCTGCAAGAGCTTATGACCATGAAGCTTTTAAGCTCGGGGGAAGAAAAGCT
481GTGCTCAACTTTCCTTTGGACGCAGGAAAGTATGATGCTCCGGTCAATTCTTGCCGGAAG
541AGGAGAAGAAACGATGTGCCGGAGCCTCAAGGAACAACTACGAGCAATTCATCATCAAAC
601TGA 氨基酸序列1MATIEEISDLEKHLFEDLMI
21PDGFMEDFVFDDAAFFSGLW
41SLEPLNQVPKQEPSSPALDP
61DFYVQEFLQMEAESSSSTTT
81TTTTTTSPEVETVSNRKRSK
101RAEETRHYRGVRRRPWGKFA
121AEIRDPAKKGSRIWLGTFES
141DIDAARAYDHEAFKLGGRKA
161VLNFPLDAGKYDAPVNSCRK
181RRRNDVPEPQGTTTSNSSSN本發明實現的有益效果本發明克隆了甘藍型油菜AP2/ERF家族轉錄因子基因&iaERF-B3_8，為了進一步 分析該基因在低溫逆境中的作用與功能，比較了轉&iaERF-B3-8基因的擬南芥植株和野 生型擬南芥植株對低溫脅迫的耐受性。結果表明野生型和轉&iaERF-B3-8基因擬南芥 植株在存活率上有明顯的差異，轉基因植株比野生型擬南芥有明顯的抗凍能力，這也表明 BnaERF-B3-8的轉入提高了擬南芥植株的抗低溫的能力。
圖1為瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。圖2為轉&iaERF-B3_8基因的擬南芥植株和野生型擬南芥植株對低溫脅迫的耐受 性，其中A為轉&iaERF-B3-8基因的擬南芥植株，B為野生型擬南芥植株。
具體實施例方式以下結合具體實施例進一步詳細描述本發明的技術方案。下述實施例中，所用的試驗材料及其來源分別如下雙低甘藍型油菜滬油15(Brassica napus L. Huyou 15)的種子經過(ν/ν) NaOCl消毒后種植在黑土 珍珠巖蛭石(1 1 1)的基質中，22°C，培養(16h光照，8h 黑暗，冷光源)生長20天。
6
大腸桿菌(Escherichia coli)DH5 α和釀酒酵母菌株由上海市農業科學院生物 技術研究所植物基因工程研究室保存。克隆載體pMD-18-SimpleT、各類限制性內切酶、 Taq聚合酶、連接酶、dNTP、10XPCR buffer和DNA marker購自寶生物工程大連有限公 司。所有的化學試劑都從美國西格瑪化學公司和上海國藥化學試劑公司購買。ABI PRIAM Big-DyeTerminator DNA測序試劑盒購自美國應用系統公司。下述實施例中常規的基因操作參照分子克隆文獻進行Sambrook J, Frets E F, Mannsdes T et al. In :Molecular Cloning. 2nd ed. Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989。實施例1雙低甘藍型油菜滬油15幼苗RNA的抽提和cDNA合成(一 )試驗方法1、RNA 的抽提加入IOOmL提取緩沖液(油菜RNA提取緩沖液配方CTAB 3% (ff/V) ；PVP 3% (W/ V) (Mw 4000) ；EDTA 25mM ；NaCl 2.OM ；Tris-HClIOOmM, pH 8.0 ；Spermidine 0.5g/L ；DEPC 0. 1% (V/V) ；0. 1% DEPC 處理的 SDS 0. 5% (W/V) ；0. 1% DEPC 處理的 LiCl 10Μ)到 50mL 聚丙烯管，65°C預熱；稱取5g植物材料倒入液氮使材料始終保持凍結和易碎的狀態，研磨；研磨后細粉轉移至預先加入65°C預熱的提取緩沖液的50mL離心管；將離心管放入65°C水浴45min，并偶爾搖動以混合各成分；加入等體積氯仿-異戊醇混合液，輕柔地上下顛倒混合約IOmin ；在18°C，于 12000g 離心 IOmin ；吸取上清液，重復5，6步驟操作；吸取上清液，加入1/4體積的10M LiCl溶液，徹底混勻，4°C放置12h ；在4"C，12000g 離心 30min ；RNA沉淀用500 μ L 0. 5% SDS輕柔溶解，用氯仿-異戊醇混合液抽提，4°C，12000g 離心30min ；上清液轉移至另一新的管子，加入2倍體積_20°C冰冷的無水乙醇，充分混合，放 置在_20°C條件下2h，沉淀總RNA ；12000g，4°C離心30min，用75%乙醇漂洗兩次，保留RNA，真空風干；用200yL DEPC處理的去離子水重新溶解，取少量用于RNA質量和濃度的檢測，其 余儲存于_70°C，備用。2、cDNA 合成加入01igo(dT)20(10pmol/y L) 1 μ 1 ；總 RNA :10 IOOng ；補足 RNase Free H20 至Ij 12 μ L。65°C，5min后，立即置于冰上。再加入5 X RT Buffer 4 μ L ；dNTP Mixture (各 IOmM) 2 μ L ；RNaseInhibitor (10U/ yL)lyL;反轉錄酶IyL0反轉錄反應過程為30°CIOmin ；42°C 20min ；85°C 5min ；4°C 5min。瞬間離心，保存。
( 二)試驗結果采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA產物，結果可見明顯的RNA條帶。實施例2PCR方法獲得甘藍型油菜AP2/ERF家族轉錄因子基因&iaERF-B3_8基因片段(一 )試驗方法設計一對正向和反向引物，為了克隆鑒定等構建的需要，引物兩端分別引入Bam HI和Me I的酶切位點。PCR 反應體系10 XPCR buffer 5. 0 μ L ;dNIPs (各 2. 5mM) 4 μ L ；雙低甘藍型油菜 滬油15的cDNA模板1 μ U20ng)；正向引物0. 5yL;反向引物0. 5yL ；Ex-Taq 0. 4 μ L(預 變性后加入)；加無菌水定容至50 μ L。PCR反應程序94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延 伸lmin，共擴增30個循環，再72°C延伸IOmin0( 二)試驗結果經過1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物為一條約600bp的片段(參見圖1)。實施例3克隆鑒定、序列測定(一)試驗方法擴增片段采用杭州維特潔生化技術有限公司DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后 克隆到大連寶生物工程有限公司的pMD-18-Simple T載體上進行克隆鑒定和序列測定。通過核苷酸序列測定分析，最終獲得甘藍型油菜AP2/ERF家族轉錄因子基因 &iaERF-B3-8基因，具有如SEQ ID No 1和SEQ ID No 2的堿基和氨基酸序列信息(參見序 列表)。( 二)試驗結果測序分析結果顯示甘藍型油菜AP2/ERF家族轉錄因子基因&iaERF-B3_8基因編碼 閱讀框由603bp組成，編碼成一個200個氨基酸的蛋白質。實施例4擬南芥轉化(一 )試驗方法1.農桿菌的準備1)挑取農桿菌單菌接種于5mL LB液體培養基(利福平50 μ g/mL，氯霉素100 μ g/ mL)中，28°C，250轉/分鐘培養20h。2)取ImL菌液轉接入20_30mL LB液體培養基(利福平50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/ mL)中，28°C，250 轉 / 分鐘培養約 12h，測 OD 600 ^ 1. 5。3)8000轉/分鐘，4°C，IOmin離心收集菌體，重懸于農桿菌轉化滲透液(5%蔗糖， 0. 05% Silwet L-77)并稀釋至 OD 600 ^ 0. 8。2.擬南芥蘸花法轉化1)將擬南芥的花苔浸入滲透液中，輕輕攪動約IOs后取出，全部轉化完畢后，托盤 中加入水，用保鮮膜罩住擬南芥，以保持濕潤環境，水平放置22°C避光培養，24h去掉保鮮
膜直立培養。2)初次轉化四天后，可再進行一次轉化，重復兩次，總共轉化三次，這樣可以對花序上發育的不同時期的花蕾進行轉化，提高轉化效率。3)生長約兩個月后，收集種子，4°C冰箱貯存待用。(二)試驗結果經過蘸花法轉化的擬南芥生長約兩個月后，正常開花結子。實施例5擬南芥種子的篩選(一)試驗方法1)稱25-30mg種子放入1. 5mL離心管。2) ImL 75%乙醇消毒Imin (不停搖晃振蕩)，8000轉/分鐘離心5s，去上清。3)加入ImL過濾后的漂白粉(5% )消毒15min(不停搖晃振蕩，充分消毒)，8000 轉/分鐘離心&，去上清。4)無菌水洗滌3-4次。5)將種子均勻的播撒到V2MS平板(潮霉素50μ g/mL)上，Parafilm膜封口，4°C 冰箱放置兩天，220C，16h光照培養6天。6)將抗性植株移栽到盆中培養，苗稍大后，進行GUS活性檢測，選出陽性植株(Ttl) 培養至開花結實，收集Ttl植株上所結T1種子。實施例6轉錄因子基因&iaERF-B3-8轉化植物后的抗逆分析幼苗生長四周后將幼苗放置于_20°C冷凍處理50分鐘，然后于_4°C恢復M小時 后，在光照培養室恢復生長一周后拍照。結果表明野生型和轉甘藍型油菜AP2/ERF家族轉錄因子基因&iaERF-B3_8擬南 芥植株在幼苗期抗凍性能上有明顯的差異，轉基因植株比野生型擬南芥抗凍能力有明顯提 高(參見圖2)。最后應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參 照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的 技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在 本發明的權利要求范圍中。
0123]序列表0124]<110>上海市農業科學院0125]<120> 一種甘藍型油菜AP2/ERF家族轉錄因子基因及其制備方法和應用0126]<160>20127]<170>PatentIn version 3. 30128]<210>SEQ ID No 10129]<211>6030130]<212>DNA0131]<213> 甘藍型油菜(Brassica napus)0132]<400>0133]1 ATGGCAACTATTGAGGAAATCTCTGATTTGGAGAAGCATCTCTTTGAAGACTTGATGATC0134]61 CCTGATGGTTTCATGGAAGATTTTGTCTTTGATGACGCTGCTTTTTTCTCAGGACTCTGG
121 TCTCTAGAACCCTTAAACCAAGTTCCTAAACAGGAGCCTAGTTCACCGGCTCTTGATCCA181 GATTTCTATGTCCAAGAGTTTCTGCAAATGGAAGCAGAATCATCATCATCAACAACAACA241 ACAACTACAACTACAACATCACCTGAGGTTGAAACTGTCTCAAACCGGAAAAGATCAAAG301 AGAGCTGAAGAGACAAGGCATTACAGAGGCGTGAGAAGGAGGCCATGGGGAAAATTCGCA361 GCAGAGATTCGAGATCCGGCGAAGAAAGGATCAAGGATTTGGCTAGGCACTTTTGAGAGT421 GATATTGATGCTGCAAGAGCTTATGACCATGAAGCTTTTAAGCTCGGGGGAAGAAAAGCT481 GTGCTCAACTTTCCTTTGGACGCAGGAAAGTATGATGCTCCGGTCAATTCTTGCCGGAAG541 AGGAGAAGAAACGATGTGCCGGAGCCTCAAGGAACAACTACGAGCAATTCATCATCAAAC601 TGA<210>SEQ ID No 2<211>200<212>PRT<213> 甘藍型油菜(Brassica napus)<400>
0149]1MATIEEISDLEKHLFEDLMI0150]21PDGFMEDFVFDDAAFFSGLW0151]41SLEPLNQVPKQEPSSPALDP0152]61DFYVQEFLQMEAESSSSTTT0153]81TTTTTTSPEVETVSNRKRSK0154]101RAEETRHYRGVRRRPWGKFA0155]121AEIRDPAKKGSRIWLGTFES0156]141DIDAARAYDHEAFKLGGRKA0157]161VLNFPLDAGKYDAPVNSCRK0158]181RRRNDVPEPQGTTTSNSSSN
權利要求
1.一種甘藍型油菜AP2/ERF家族轉錄因子基因，其特征在于，所述轉錄因子基因的堿 基序列為SEQ ID No 1，具體如下1 ATGGCAACTATTGAGGAAATCTCTGATTTGGAGAAGCATCTCTTTGAAGACTTGATGATC 61 CCTGATGGTTTCATGGAAGATTTTGTCTTTGATGACGCTGCTTTTTTCTCAGGACTCTGG 121 TCTCTAGAACCCTTAAACCAAGTTCCTAAACAGGAGCCTAGTTCACCGGCTCTTGATCCA 181 GATTTCTATGTCCAAGAGTTTCTGCAAATGGAAGCAGAATCATCATCATCAACAACAACA 241 ACAACTACAACTACAACATCACCTGAGGTTGAAACTGTCTCAAACCGGAAAAGATCAAAG 301 AGAGCTGAAGAGACAAGGCATTACAGAGGCGTGAGAAGGAGGCCATGGGGAAAATTCGCA 361 GCAGAGATTCGAGATCCGGCGAAGAAAGGATCAAGGATTTGGCTAGGCACTTTTGAGAGT 421 GATATTGATGCTGCAAGAGCTTATGACCATGAAGCTTTTAAGCTCGGGGGAAGAAAAGCT 481 GTGCTCAACTTTCCTTTGGACGCAGGAAAGTATGATGCTCCGGTCAATTCTTGCCGGAAG 541 AGGAGAAGAAACGATGTGCCGGAGCCTCAAGGAACAACTACGAGCAATTCATCATCAAAC 601 TGA。
2.如權利要求1所述的甘藍型油菜AP2/ERF家族轉錄因子基因，其特征在于，所述轉錄基因編碼的蛋白質，3ζ氨基酉I序列為SEQIDNo 2，具體如下1MATIEEISDLEKHLFEDLMI21PDGFMEDFVFDDAAFFSGLW41SLEPLNQVPKQEPSSPALDP61DFYVQEFLQMEAESSSSTTT81TTTTTTSPEVETVSNRKRSK101RAEETRHYRGVRRRPWGKFA121AEIRDPAKKGSRIWLGTFES141DIDAARAYDHEAFKLGGRKA161VLNFPLDAGKYDAPVNSCRK181RRRNDVPEPQGTTTSNSSSN。
3.如權利要求1所述的甘藍型油菜AP2/ERF家族轉錄因子基因，其特征在于，所述轉錄 因子基因為BnaERF-B3-8基因。
4.如權利要求3所述的甘藍型油菜AP2/ERF家族轉錄因子基因，其特征在于，所述 BnaERF-B3-8基因編碼閱讀框由603bp組成，編碼成一個200個氨基酸的蛋白質。
5.一種制備權利要求1所述的油菜AP2/ERF家族轉錄因子基因的方法，包括以下步驟1)油菜cDNA文庫的構建選取油菜幼苗提取總RNA，以總RNA為模板、Oligo(dT)為引 物，在AMV反轉錄酶的作用下合成cDNA ；2)設計一對弓丨物正向引物GGATCCATGGCAACTA TTGAGGAAATC,反向引物 GAGCTCTCAGAA TTCGTTTGATGATGAATTGC ；以上述cDNA為模板進行PCR擴增，獲得油菜AP2/ERF家族轉錄因 子基因&iaERF-B3-8基因片段；3)將上述擴增片段回收后克隆入T載體，測序后即獲得油菜抗逆AP2/ERF家族轉錄因 子 BnaERF-B3-8 基因。
6.如要求1所述的甘藍型油菜AP2/ERF家族轉錄因子基因在制備抗逆轉基因植物中的應用。
7.如要求1所述的甘藍型油菜AP2/ERF家族轉錄因子基因在植物轉化中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種甘藍型油菜AP2/ERF家族轉錄因子基因及其制備方法和用途。所述甘藍型油菜AP2/ERF家族轉錄因子基因為BnaERF-B3-8，其堿基序列為SEQ ID No 1，其蛋白質的氨基酸序列為SEQ ID No 2。本發明利用聚合酶擴增技術從油菜幼苗中克隆甘藍型油菜AP2/ERF家族轉錄因子基因序列，所獲得的轉錄因子基因用于植物轉化，培育提高植物抗逆性。
文檔編號C12N15/10GK102094025SQ20091020101
公開日2011年6月15日 申請日期2009年12月11日 優先權日2009年12月11日
發明者付曉燕, 姚泉洪, 彭日荷, 朱波, 熊愛生, 田永生, 趙偉, 金曉芬, 高峰 申請人:上海市農業科學院