專利名稱：一種利用微生物酶系對啤酒酵母細胞進行破壁裂解的方法
技術領域：
本發明是利用一株細菌產生的胞外復合酶系對經過預處理的啤酒酵母細胞進行
破壁的一種方法，屬于生物技術技術領域。
背景技術：
我國啤酒行業每年產生的廢棄酵母泥多達幾十萬噸。目前對這些酵母的有效利用有限，可深度開發的空間很大。對這些酵母進行有效的利用將會挖掘其蘊藏的巨大經濟價值，并且能夠緩解其對環境造成的壓力。 酵母菌是一種單細胞真核微生物，其細胞壁厚度約為O. 1 0.3ym，結構堅韌，主
要成分有葡聚糖、甘露聚糖、蛋白質、幾丁質、脂類等，其中葡聚糖和甘露聚糖的含量分別占到細胞壁干重的30%左右；酵母細胞質含有豐富的營養物質，如蛋白質、核糖核酸、B族維生素以及豐富的氨基酸等。酵母細胞壁中的P-(l，3)-葡聚糖能增強哺乳動物的免疫活力、抗癌、抗細菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲、降低膽固醇和血脂、促進傷口愈合等能力，是一種良好的生物效應調節劑。因此，對酵母細胞破壁裂解后，既可以釋放出胞內營養物質，又可以得到細胞壁多糖。 由于酵母細胞壁結構復雜堅韌，破壁較為困難。常用的破壁方法有高壓勻質法、超聲波法、凍融法、有機溶劑法、酸堿法，酶法或其中幾種方法聯用等。其中高壓勻質法處理酵母細胞量大速度快，但是需要重復破碎，而且處理過程中溫度的升高容易造成敏感活性物質的失活。超聲波法也存在散熱困難，產生局部高溫的問題，只適合實驗室規模的應用。酸堿法破壁需要用到大量的強酸強堿，容易對環境造成污染。酶法裂解破壁與其它物理化學方法相比有很多突出的優點，如能耗低、對營養成分破壞程度低，綠色環保等。但是現行的酶法破壁方法也存在很多缺陷，如酶用量大、酶成本高、酶解反應溫度較高以及需要有毒的巰基化合物預處理酵母細胞等。
發明內容
本發明利用細菌Flavobacterium johnsoniae產生的胞外酶系，結合簡單的預處理過程，建立了一種有效破碎啤酒酵母細胞壁的方法。
發明概述 本發明針對現行酶法破壁技術中存在的酶用量大、酶成本高等問題，采用添加廉價高效微生物粗酶制劑的方法，在適宜條件下對經乙醇簡單預處理的啤酒酵母細胞進行酶解處理，達到了破碎酵母細胞壁的目的。破壁率最高可達90 % 。
發明詳述 —種利用微生物酶系對啤酒酵母細胞進行破壁裂解的方法，包括粗酶制劑制備，酵母細胞的預處理和酶解，其特征在于，粗酶制劑制備步驟如下 (1)取菌種保藏號為ATCC 17061的菌種Flavobacterium johnsoniae，無菌條件下吸取100 ii 1接種于30ml CYE活化培養基中，26_32°C ， 150-300rpm搖床培養10-20h，得
3活化菌種；CYE活化培養基pH為7-8，配方如下，均為重量份 酪蛋白胨(Casein P印tone)8-12g 酵母提取物(Yeast Extract)4_7g
氨基丁三醇(Tris) l-2g 硫酸鎂(MgS04))0. 5-1. 5g 蒸餾水1000g。 上述的酵母提取物(Yeast Extract)、酪蛋白胨(Casein P印tone)均為市場購得。
(2)將步驟(1)制得的活化菌種按每100ml產酶培養基接種450-550 ill活化菌種的接種量接種，在26-32°C， 150-300rpm搖床培養18_36h后，在溫度4°C的條件下，6000-15000g離心10-20min，收集上清液； (3)將步驟(2)收集的上清液進行冷凍干燥，得到粗酶制劑。經檢測，所制備的粗
酶制劑具有明顯的昆布多糖酶、幾丁質酶和蛋白酶等活性。 所述的步驟(2)中的產酶培養基pH為7-8，配方如下，均為重量份硝酸鉀(KN03) 0. 8-1. 2g 磷酸氫二鉀(K2HP04) 0. 8-1. 2g 硫酸鎂(MgS04)0. 15-0. 3g 氯化鈣(CaCl2)0. 05-0. 15g 氯化鐵(FeCl3) 0. 01-0. 03g 干酵母5g 蒸餾水lOOOg 所述的啤酒酵母預處理步驟如下 ①將啤酒酵母泥過濾、除雜、水洗，得含水量70_90wt%的酵母泥；該步驟可除去大部分啤酒酵母泥中的雜質。 ②將步驟①制得的酵母泥，按每3-5g酵母泥加入100-800 ill乙醇和0. 1-0. 5gNaCl，混勻，然后放入40-6(TC水浴鍋中水浴加熱3_7h，得到預處理酵母泥；
所述的酶解操作如下 將啤酒酵母預處理步驟獲得的預處理酵母泥按照每lg干重的預處理酵母泥，用10-20mlpH 7. 5的Tris-HCl緩沖液懸浮，然后加入經粗酶制劑制備步驟中制得的粗酶制劑0. 1-0. 5g，在30-6(TC下，震蕩水浴反應3-7h，即得到破壁裂解的啤酒酵母細胞。通過顯微鏡對產物觀察檢測酵母細胞壁的破碎情況，破壁率可達70-90% 。 所述步驟(2)產酶培養基中的干酵母可按現有技術自制，本發明提供通過如下制備方法 將步驟①制得的酵母泥先在-8(TC冷凍，然后用真空冷凍干燥機凍干即可。
本發明的有益效果如下 本發明提供的利用微生物發酵粗酶制劑破碎乙醇預處理酵母細胞壁的方法，所用粗酶成本低且破壁能力較強，操作比較簡單，整個破壁過程所需時間較短，并且在生產過程中不需要添加有毒的化學試劑，因此，該方法生產的產品可應用于食品、醫藥等領域。
圖1是酶解前完整的酵母細胞顯微鏡照片；
圖2是酶解后破壁的酵母細胞顯微鏡照片；
具體實施例方式
下面結合實施例，對本發明做進一步闡述，但本發明所保護范圍不限與此。
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實施例中涉及的菌株Flavobacterium johnsoniae是美國典型物保藏中心ATCC17061strain UWIOI，從該中心購買。酵母提取物(Yeast Extract)購自0xoid公司，酪蛋白胨(CaseinP印tone)購自Solarbio公司。
實施例中涉及的其他試劑均為市售普通產品。
實施例1干酵母的制備 將購自趵突泉啤酒廠的廢棄酵母泥經8層紗布過濾除雜和水洗，得到酵母泥。將酵母泥先在-8(TC冷凍，然后用真空冷凍干燥機凍干，使用前用研缽將其研磨成粉末狀即可。 實施例2 —種利用微生物酶系對啤酒酵母細胞進行破壁裂解的方法，包括粗酶制劑制備，酵母細胞的預處理和酶解，步驟如下 無菌條件下吸取100 ii 1甘油管保藏的Flavobacterium johnsoniae菌液接種于30ml CYE培養基中(CYE培養基配方為酪蛋白胨10g、酪蛋白胨10g、酵母提取物5g、氨基丁三醇1. 2g、 MgS04 lg、水1000g，pH 7. 5)30。C，200rpm搖床培養14h，得活化菌種。然后將活化菌種接種于產酶培養基中(硝酸鉀lg、磷酸氫二鉀lg、硫酸鎂0. 2g、氯化鈣0. lg、氯化鐵0. 02g、干酵母5g、蒸餾水1000g， pH 7. 5)，每100ml培養基中接種500 y 1活化菌種，30°C ， 100rpm搖床培養24h，然后離心(15000g， 10min， 4°C )，收集上清液，細菌所產生的胞外酶溶于該上清液中。將該上清液冷凍干燥，得到粉末狀的粗酶制劑。
將購自趵突泉啤酒廠的廢棄酵母泥經8層紗布過濾除雜和水洗，得到酵母泥，顯微鏡觀察，如圖l所示。用恒溫干燥箱105t:條件下測得所制備酵母泥的含水量為78%。每4. 55g酵母泥(酵母細胞干重lg)加入400ii1乙醇，O. 2gNaCl，混勻后，放入55t:水浴鍋中水浴加熱5小時。然后用10ml pH 7. 5的Tris-HCl緩沖液懸浮，加酶制劑0. lg，45。C震蕩水浴反應6h，即得到破壁裂解的啤酒酵母細胞。通過顯微鏡對產物觀察檢測酵母細胞壁的破碎情況，如圖2所示。經計算，酵母細胞破壁率為90%。
實施例3 如實施例2所述的對啤酒酵母細胞進行破壁裂解的方法，不同之處在于，每4. 55g酵母泥(酵母細胞干重lg)加入400 iU乙醇，Tris-HCl緩沖液懸浮后，加酶制劑0. 15g，55t:震蕩水浴反應5h。經計算，酵母細胞破壁率為70%。
權利要求
一種利用微生物酶系對啤酒酵母細胞進行破壁裂解的方法，包括粗酶制劑制備，酵母細胞的預處理和酶解，其特征在于，粗酶制劑制備步驟如下(1)取菌種保藏號為ATCC 17061的菌種Flavobacterium johnsoniae，無菌條件下吸取100μl接種于30ml CYE活化培養基中，26-32℃，150-300rpm搖床培養10-20h，得活化菌種；所述CYE活化培養基pH為7-8，配方如下，均為重量份酪蛋白胨 8-12g酵母提取物4-7g氨基丁三醇1-2g 硫酸鎂0.5-1.5g蒸餾水1000g(2)將步驟(1)制得的活化菌種按每100ml產酶培養基450-550ul活化菌種接種，在26-32℃，150-300rpm搖床培養18-36h后，在溫度4℃的條件下，6000-15000g離心10-20min，收集上清液；(3)將步驟(2)收集的上清液進行冷凍干燥，得到粗酶制劑。
2. 如權利要求l所述的破壁裂解的方法，其特征在于，所述的步驟(2)中的產酶培養基 pH為7-8，配方如下，均為重量份硝酸鉀 0.8-1.2g 磷酸氫二鉀 0.8-1.2g硫酸鎂 0. 15-0. 3g氯化鈣 0.05-0. 15g氯化鐵 0.01-0.03g 干酵母 5g 蒸餾水 lOOOg。
3. 如權利要求1所述的破壁裂解的方法，其特征在于，所述的啤酒酵母預處理步驟如下將啤酒酵母泥過濾、除雜、水洗，得含水量70-90wt^的酵母泥；將制得的酵母泥，按每 3-5g酵母泥加入100-800 ill醇和0. 1-0. 5g NaCl，混勻，然后放入40-6(TC水浴鍋中水浴 加熱3-7h，得到預處理酵母泥。
4. 如權利要求1或3所述的破壁裂解的方法，其特征在于，所述的酶解操作如下 將啤酒酵母預處理得到的預處理酵母泥按照每lg干重的預處理酵母泥，用10-20mlpH7. 5的Tris-HCl緩沖液懸浮，然后加入粗酶制劑0. 1_0. 5g，在30-6(TC下，震蕩水浴反應 3-7h，即得到破壁裂解的啤酒酵母細胞。
全文摘要
本發明涉及一種用微生物酶系對啤酒酵母細胞進行破壁的方法，該方法包括粗酶制劑制備，酵母細胞的預處理和酶解，屬于生物技術領域。本發明提供的啤酒酵母破壁方法，操作簡單，整個破壁過程所需時間較短，可重復操作，而且生產過程中未添加有毒化學試劑，因此，用該方法生產的產品可應用于飼料、食品、醫藥等領域。
文檔編號C12N1/06GK101717733SQ200910229778
公開日2010年6月2日 申請日期2009年11月6日 優先權日2009年11月6日
發明者劉巍峰, 盧雪梅, 史偉, 朱永濤, 陳冠軍 申請人:山東大學