專利名稱：利用鰒發光桿菌檢測環境污染物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物，特別是涉及一株可用于環境污染物檢測的海洋發光細菌 Photobacteriumleiognathi YL 菌株。
背景技術：
據本發明人通過查閱資料、文獻檢索所知，目前已知的海洋發光細菌只有三屬， 分別是弧菌屬(Vibrio)，明亮發光菌屬(PhotcAacterium)，及希瓦氏菌屬(Shewanella)， 陸地上則有異短桿菌屬(Xenorhabdus)。在有氧的自然環境下，發光細菌可產生熒光素酶 (LE)，催化黃素單核苷酸(FMNH2)及長鏈脂肪醛類發生氧化反應，而發出藍綠色的熒光。目前在我國應用較廣的是明亮發光桿菌(PhotcAacterium phosphoreum)，利用 明亮發光桿菌進行環境污染物檢測的研究有所報道。而除了明亮發光桿菌以外，均沒有 利用其他種屬的發光細菌進行環境污染物檢測的報道。本發明中涉及的菌種鰒發光桿菌 (Photobacterium leiognathi)與明亮發光桿菌(Photobacteriumphosphoreum)為同屬 異種，在菌體形態特征、生理生化特征及16S rDNA序列上二者均有很大差異。但該菌株 Photobacterium leiognathi YL表現出穩定的發光性能，對環境污染物敏感，作為環境污 染物的指示菌，可以用于環境污染物的檢測。
發明內容
本發明的目的是提供一株來源于海洋環境的發光細菌菌株Wiotobacterium leiognathi YL(鰒發光桿菌以及利用該菌株進行環境污染物的定量檢測。本發明分離純化出一株來源于海洋環境的發光細菌1，該菌種為革蘭氏陰性菌， 桿狀(附圖1)。結合16S rDNA測序結果構建的系統發育樹(附圖2)和生理生化結果(表 1)，發光細菌1被鑒定為鰒發光桿菌(Photobacterium leiognathi)。該菌株于2006年12 月27日委托中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)保藏，保藏號為M 206139。該菌株的 16S rDNA基因序列已經提交GenBank核酸序列數據庫，存取號為EF017227。該菌株具有發 光特性，能夠用來檢測環境污染物。該菌株具有生長快、發光性能穩定、對營養要求低、對環境污染物敏感等特點，熒 光掃描確定該發光細菌的發光強度在474nm形成最大峰。多種受試環境污染物的濃度與污 染物對該菌株Wiotobacteriumleiognathi YL發光強度抑制率呈正比，能夠實現對受試環 境污染物的定量檢測。利用本菌株檢測環境污染物具有成本低、操作簡便、靈敏度高等特 點，能夠滿足多種污染物的快速檢測的需要。
附圖1發光細菌孔掃描電鏡照片。附圖2根據細菌16S rDNA序列分析結果構建的系統發育樹，括號內為該菌株在 GenBank中的收錄號，分支上的數字代表置信度。
附圖3發光細菌1的發光光譜圖。附圖4 2+濃度與發光細菌YL發光抑制率的線性關系圖。附圖5Cu2+濃度與發光細菌YL發光抑制率的線性關系圖。附圖6pb2+濃度與發光細菌YL發光抑制率的線性關系圖。附圖7氯霉素濃度與發光細菌YL發光抑制率的線性關系圖。
具體實施例方式實施例1從青島近海捕得常見海產品，包括魷魚、對蝦、黃魚、黑頭魚、安康魚等。將各種水 產品分割成小塊置于固體培養基平板內，在隔水式恒溫培養箱25°C恒溫培養10h，暗室觀 察發光情況。標記發光的菌落，進行平板劃線培養。經過多次分離純化，得到發光細菌YL。實施例2取發光細菌YL單菌落接種于IOOml液體培養基中(培養基組成蛋白胨5g、酵母 膏lg、FePO4 0. lg、NaCl 20g、甘油3ml、蒸餾水1000ml)，27°C搖床培養8hr使菌體達到對 數生長末期。取5ml不同濃度的重金屬鋅溶液加入到5ml菌液中，27°C搖床培養反應20min。反 應完畢后，于微弱發光測量儀中測量發光值，測量時間為50s，結果取平均值。從測定結果可 知抑制率和Si2+濃度成正比(圖4)，因而在進行食品或環境中該種污染物的測定時，可根 據抑制率推測出污染物的含量。實施例3取發光細菌YL單菌落接種于IOOml液體培養基中(培養基組成蛋白胨5g、酵母 膏lg、FePO4 0. lg、NaCl 20g、甘油3ml、蒸餾水1000ml)，27°C搖床培養8hr使菌體達到對 數生長末期。取5ml不同濃度的重金屬銅溶液加入到5ml菌液中，27°C搖床培養反應20min。反 應完畢后，于微弱發光測量儀中測量發光值，測量時間為50s，結果取平均值。從測定結果可 知抑制率和Cu2+的濃度成正比(圖幻，因而在進行食品或環境中該種污染物的測定時，可 根據抑制率推測出污染物的含量。實施例4取發光細菌YL單菌落接種于IOOml液體培養基中(培養基組成蛋白胨5g、酵母 膏lg、FePO4 0. lg、NaCl 20g、甘油3ml、蒸餾水1000ml)，27°C搖床培養8hr使菌體達到對 數生長末期。取5ml不同濃度的重金屬鉛溶液加入到5ml菌液中，27°C搖床培養反應20min。反 應完畢后，于微弱發光測量儀中測量發光值，測量時間為50s，結果取平均值。從測定結果可 知抑制率和Pb2+的濃度成正比(圖6)，因而在進行食品或環境中該種污染物的測定時，可 根據抑制率推測出污染物的含量。實施例5取發光細菌YL單菌落接種于IOOml液體培養基中(培養基組成蛋白胨5g、酵母 膏lg、FePO4 0. lg、NaCl 20g、甘油3ml、蒸餾水1000ml)，27°C搖床培養6hr使菌體達到對 數生長初期。
取5ml不同濃度的氯霉素溶液加入到5ml菌液中，27°C搖床培養反應20min。反應 完畢后，于微弱發光測量儀中測量發光值，測量時間為50s，結果取平均值。從測定結果可知 抑制率和氯霉素的濃度成正比(圖6)，因而在進行食品或環境中該種污染物的測定時，可 根據抑制率推測出污染物的含量。表1 1與其他相近菌種的生理生化特征比較
Photobacterium 明亮發光桿菌 哈維氏弧菌 美麗發光弧菌 費氏弧菌 leiognathi YL P. phosphoreum V. harveyi V. splendidus V. fischeri
固體培養基上 的側生鞭毛 直的桿菌 PHB積累 精氨酸雙水解 酶 氧化酶 發光 接觸酶反應
V. P實驗 精氨酸雙水解 酶
0/129敏感 N03—還原為N02_ 利用葡萄糖 產氣 生長時需要Na+ 形成3—羥基丁 酮和/或二乙酰
權利要求
1.一種能定量檢測環境污染物的鰒發光細菌Wiotobacterium Ieiognathi 1菌株，其 保藏號為CCTCC M206139
2.權利要求1所述的菌株在環境污染物檢測中的應用。
全文摘要
本發明的目的是提供一株來源于海洋環境的鰒發光細菌Photobacterium leiognathi YL以及利用該菌株進行環境污染物的定量檢測。本發明分離純化出一株來源于海洋環境的發光細菌YL，該菌種為革蘭氏陰性菌，桿狀。根據16S rDNA測序結果構建的系統發育樹和生理生化結果，發光細菌YL被鑒定為鰒發光桿菌(Photobacterium leiognathi)。該菌種于2006年12月27日委托中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)保藏，保藏號為M 206139。該發光細菌的16S rDNA基因序列已經提交GenBank核酸序列數據庫，存取號為EF017227。該菌株具有生長快、發光性能穩定、對營養要求低、對環境污染物敏感等特點，熒光掃描確定該發光細菌的發光強度在474nm形成最大峰。發光強度抑制率與多種受試環境污染物的濃度呈正比，能夠實現對受試環境污染物的定量檢測。利用本菌株檢測環境污染物具有成本低、操作簡便、靈敏度高等特點，能夠滿足污染物的快速檢測的需要。
文檔編號C12R1/01GK102071159SQ200910230499
公開日2011年5月25日 申請日期2009年11月20日 優先權日2009年11月20日
發明者朱蘭蘭, 林洪, 王亞群, 王靜雪 申請人:中國海洋大學