專利名稱：藏綿羊腐蹄病抗性等位基因pcr-sscp檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型主要涉及動物生物技術領域中的綿羊分子標記輔助育種技術，具體涉及 到藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測試劑盒。
技術背景
綿羊腐蹄病是由節瘤擬桿菌引起高度接觸性傳染病，其特征是蹄局部組織發炎、壞 死。綿羊患病后生長不良、掉膘、羊毛品質下降,病情嚴重且得不到及時治療時會引起羊 只死亡。藏綿羊易患腐蹄病，于每年7-9月份的多雨季節爆發，如在甘肅和青海境內的
藏綿羊發病率高達30%以上，死亡率最高可達10%，嚴重影響牧區養羊業發展。
動物主要組織相容性(基因)復合體(major histocompatibility complex ， MHC)與 多種疾病有密切關系，是目前開展抗病育種的首選基因座或候選基因。綿羊主要組織相 容性(基因)復合體也稱為OLA (ovine lymphocyte antigen) ， OLAII區與人的相似， 區域內的DQ和DR 2個基因家族表現豐富的多態性，但綿羊的多態性更集中在DQ家 族。OLA-DQ基因家族有2個DQA基因座位，即DQA1和DQA2基因，都具有多態性。 目前國內綿羊腐蹄病主要采用藥物防治措施，較難控制病情且有藥物殘留風險。在
國外OLA-DQA2基因已經作為抗腐蹄病的遺傳標記加以應用,并且該檢測巳商業化并用 來開展抗病選育。藏綿羊腐蹄病抗性分子選種技術主要利用PCR-SSCP技術對待測綿羊 的DQA2基因第2外顯子進行多態性分析，然后根據檢測結果確定攜帶不同等位基因的 羊只對腐蹄病的抗性強弱，從而判斷是否可以留作種用
實用新型內容
本實用新型的目的在于避免現有技術的不足之處而提供一種藏綿羊腐蹄病抗性等 位基因PCR-SSCP檢測試劑盒。以解決快速、敏感性高、成本低用于藏綿羊腐蹄病抗性 分子選種技術。
本實用新型涉及一種藏綿腐蹄病抗性等位基因檢測試劑盒。通過PCR-SSCP對表型 正常和患腐蹄病藏綿羊OLA-DQA2基因第2外顯子進行遺傳多態性分析，并克隆、測 序群體內變異產生的各等位基因序列，結合表型觀測資料，確定易感等位基因和抗性較強的等位基因，為藏綿羊沒有感染時的抗病選育進行指導。
本實用新型的目的可以通過采用以下技術方案來實現 一種藏綿羊腐蹄病抗性等位 基因PCR-SSCP檢測試劑盒，包括有盒體(1)，襯墊(2)，在襯墊(2)上設有數個容 器孔，其主要特點是在容器孔中分別放置第一PCR反應液(4)，第二PCR反應液(ll)， OLA-DQA2*L的DNA標準樣(10)。
所述的藏綿羊腐蹄病抗性等位基因PCR-SSCP檢測試劑盒，還包括在容器孔中還分 別放置SSCP檢測試劑，去離子水(5)， 10%過硫酸銨(7)，變性上樣緩沖液(6)， TEMED (四甲基乙二胺)(8)，聚丙烯酰胺(Acr:Bis = 39:1) (9)。
上述各種液體分別裝在容器內，插入容器孔內。
上樣變性緩沖液(6)，包括98%去離子甲酰胺、0.025%溴酚藍、0.025%二甲苯青、 10mmol/LEDTApH8.0 。
所述的第一PCR反應液(4)的成分用量及濃度第一組DQA2-up和DQA2-dn引 物各為0.5|aL/10pmol， dNTP為1.2pL/2.5證，Taq DNA聚合0.2|aL/2.5U/pL， lOxbuffer 為2.0&L含Mg2+15nM，雙純水為14.6pL。
所述的第二PCR反應液(11)的成分用量及濃度第二組DQA2s-up和DQA2s-dn 引物各為0.5pL/10pmoI， dNTP為1.2nL/2.5mm， DNA聚合酶為0.2pL/2.5U/|iL， lOxbuffer為2.0pL含Mg^l5nM，雙純水為14.6^L。
所述的檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的PCR-SSCP特異性擴增引物，第一組引物 上游長度為24bp的核苷酸，下游長度為22bp的核苷酸，第二組引物上游長度為23bp 的核苷酸，下游長度為24bp的核苷酸，包括用于擴增OLA-DQA2基因第2外顯子的特 異性引物，序列如下
上游引物24bp: DQA2-up: CACATGTTACAGTGCAAAARCAGC; 下游引物22bp: DQA2-dn: CCCTCYCACCAACGTTTCCCAG; 上游弓I物23bp: DQA2s-up: ACTACCAATCTCATGGTCCCTCT; 下游引物24bp: DQA2s-dn: GGAGTAGAATGGTGGACACTTACC; 其中R=A或G，Y=C或T。
DQA2-up和DQA2-dn的擴增產物大小為828bp， DQA2s-up和DQA2s-dn以DQA2-up 和DQA2-dn的擴增產物為模板的擴增產物大小為242bp。 所述的PCR-SSCP擴增引物的擴增條件為-
第一次第一組引物PCR反應條件預變性94°C2 min ，變性94'C30s ，退火 64。C30s，延伸72。C50s，共32個循環,最后72'C延伸5 min;
4第二次第二組引物PCR反應條件預變性94'C2min ，變性94。C30s ，退火67。C30s， 延伸72'C30s ，共32個循環，最后72'C延伸5 min。
藏綿羊腐蹄病抗性等位基因OLA-DQA2*L的DNA標準樣的核苷酸序列為
actaccaatc tcatggtccc tctagcgagt acaccctgga atttgacgaa gacgagctgc 60
tttatgtgga cctggagaag aaagagactg tctggcggct gcctatgttt ggccagtttg 120
caggttttca cattcaagtt gcactgagta acatagctac agagaaacac aacttggatg 180
tcatgactaa atggtacaac tttaccccag ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact 240
cc 242
藏綿羊腐蹄病抗性等位基因PCR-SSCP檢測試劑盒的使用方法，
(1) 待檢基因組DNA (lpL/50ng)與試劑盒中第一PCR擴增液混合，按上述第一 組引物PCR反應條件進行擴增；
(2) 試劑盒中第二 PCR擴增液與步驟(1)的PCR擴增產物混合，按上述第二組 引物PCR反應條件進行擴增；
(3) 用步驟(2)中擴增的PCR產物和OLA-DQA2*L的DNA標準樣與試劑盒中 SSCP檢測試劑各組分混合進行SSCP檢測；
(4) 步驟(3)中檢測到的帶型與OLA-DQA2*L標準樣帶型一致的樣品為攜帶藏 綿羊腐蹄病抗性等位基因的個體。
本實用新型的有益效果反應靈敏、特異性強、易操作，適用于各級畜牧獸醫教學 科研單位，獸用生物制品廠以及各大、中型藏綿羊養殖企業的抗腐蹄病的選種。
本實用新型利用PCR-SSCP對表型正常和患腐蹄病藏綿羊OLA-DQA2基因第2外顯 子進行遺傳多態性分析，并克隆、測序群體內變異產生的各等位基因，結合表型觀測資 料，確定易感等位基因和抗性等位基因，為藏綿羊沒有感染時的抗病選育進行指導。本 實用新型通過對試驗羊只OLA-DQA2基因第2外顯子的PCR-SSCP檢測，發現了16個等位 基因，其中14個等位基因(OLA-DQA2*A 、 OLA-DQA2*B 、 OLA-DQA2*C 、 OLA-DQA2*D、 OLA-DQA2*E 、 OLA-DQA2*F 、 OLA-DQA2*G 、 OLA曙DQA2"、 OLA-DQA2*J、 OLA-DQA2*K、 OLA-DQA2*M、 OLA-DQA2*N、 OLA-DQA2*0、 OLA-DQA2*P)在正常和患病群體中都存在，l個等位基因(OLA-DQA2*L)只在正常 群體中存在，另有l個等位基因(OLA-DQA2*H)只在患病群體中存在。將等位基因 OLA-DQA2化作為藏綿羊腐蹄病抗病相關MHC基因標記，建立了抗病相關基因標記輔助
5選種技術。本實用新型對藏綿羊抗腐蹄病的分子標記選種具有快速、敏感性高、成本低 等特點。
-
圖1是本實用新型的立體示意圖。
具體實施方式
以下對所示之最佳實施例作進一步詳述-
下面以藏綿羊腐蹄病抗性分子選種技術的建立為例，對本實用新型的內容進行詳細 的說明。
實施例1: 一種藏綿羊腐蹄病抗性等位基因PCR-SSCP檢測試劑盒，包括有盒體1 ，
襯墊2，在襯墊2上設有數個容器孔，在容器孔中分別放置第一 PCR反應液4，第二 PCR 反應液11 ， OLA-DQA2*L的DNA標準樣10。
所述的藏綿羊腐蹄病抗性等位基因PCR-SSCP檢測試劑盒，還包括在容器孔中還分 別放置SSCP檢測試劑，去離子水5， 10%過硫酸銨7，變性上樣緩沖液6， TEMED(四 甲基乙二胺)8，聚丙烯酰胺(Acr:Bis-39:1)9。上述各種液體分別裝在容器內，插入容 器孔內。
上樣變性緩沖液6，包括98%去離子甲酰胺、0. 025%溴酚藍、0. 025%二甲苯青、 10讓ol/LEDTApH8.0 。
藏綿羊腐蹄病抗性等位基因PCR-SSCP檢測試劑盒的使用方法，
(1) 待檢基因組DNA (lpL/50ng)與試劑盒中第一 PCR擴增液混合，按上述第一 組引物PCR反應條件進行擴增；
(2) 試劑盒中第二PCR擴增液與步驟(1)的PCR擴增產物混合，按上述第二組 引物PCR反應條件進行擴增；
(3) 用步驟(2)中擴增的PCR產物和0LA-DQA2*L的DNA標準樣與試劑盒中 SSCP檢測試劑各組分混合進行SSCP檢測；
(4) 步驟(3)中檢測到的帶型與0LA-DQA2*L標準樣帶型一致的樣品為攜帶藏 綿羊腐蹄病抗性等位基因的個體。
實施例2: 試驗材料
藏綿羊選自甘肅省甘南藏族自治州大水種畜場104只，甘南州碌曲縣牧民羊群791只(患腐蹄病223只)，青海省海晏縣哈里鄉哈里村牧民羊群72只(患腐蹄病22只)，頸靜 脈采血10ml,ACD抗凝,-20'C凍存。用酚-氯仿抽提法從凍存血樣中提取基因組DNA，溶 于TE， 4'C保存。 試驗方法
l.引物設計和PCR擴增
采用巢式PCR進行基因擴增。DQA2-up和DQA2-dn的擴增產物大小為828bp ， DQA2s-up和DQA2s-dn以DQA2-up和DQA2-dn的擴增產物為模板的擴增產物大小為 242bp，引物序列為
上游弓I物24bp: DQA2-up: CACATGTTACAGTGCAAAARCAGC; 下游引物22bp: DQA2-dn: CCCTCYCACCAACGTTTCCCAG; 上游弓I物23bp: DQA2s-up: ACTACCAATCTCATGGTCCCTCT; 下游弓1物24bp: DQA2s-dn: GGAGTAGAATGGTGGACACTTACC; 其中R=A或G，Y《或T。
PCR反應體系20pL的反應體系，其成分的用量及濃度為四種引物各為 0.5pL/10pmol， dNTP為1.2pL/2.5mm， Taq DNA聚合酶為0.2nL/2.5U/nL， 10xbuffer為2.(VL 含Mg2+15一，模板DNA為lnL/50ng，雙純水為14.6pL。
PCR反應條件:第一次第一組引物:PCR反應條件:預變性94'C2min ，變性94。C30s ， 退火64'C30s，延伸72'C50s，共32個循環，最后72'C延伸5 min。
第二次第二組引物PCR反應條件預變性94'C2min ，變性94'C30s ，退火67'C30s， 延伸72'C30s，共32個循環，最后72'C延伸5 min。
DQA2-up和DQA2-dn的擴增產物大小為828bp, DQA2s-up和DQA2s-dn以DQA2-up 和DQA2-dn的擴增產物為模板的擴增產物大小為242bp。
得到242bp的特異性擴增產物，可直接進行SSCP檢測。
2.SSCP檢測
取步驟l中2pl的PCR產物加入8^il的上樣變性緩沖液[包括98。/。去離子甲酰胺、0.025% 溴酚藍、0.025%二甲苯青、10mmol/LEDTA(pH 8.0)]， 98 。C變性10min，立即冰浴10min。 12 。/。的非變性聚丙烯酰胺凝膠(Arc: Bis = 39:1)140V電壓條件下,4 'C電泳19h ，銀染法顯 色后拍照。
其中，對PCR擴增產物進行SSCP檢測，在所檢測的967只藏綿羊中共發現16個等位
基因，分別指定為OLA-DQAH、 *B.......*0和* 。各等位基因的電泳條帶從1條到4
條不等。藏綿羊腐蹄病抗性等位基因OLA-DQA2*L的DNA標準樣的核苷酸序列為 actaccaatc tcatggtccc tctagcgagt acaccctgga atttgacgaa gacgagctgc 60 tttatgtgga cctggagaag aaagagactg tctggcggct gcctatgttt ggccagtttg 120
caggttttca cattcaagtt gcactgagta acatagctac agagaaacac aacttggatg 180
tcatgactaa atggtacaac tttaccccag ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact 240 cc 242
3. 不同等位基因的克隆測序 經SSCP檢測后,利用瓊脂糖凝膠純化試劑盒回收不同等位基因的PCR產物。回收后的片
段用載體連接，構建重組質粒，并轉化大腸桿菌DH5a菌株，菌落PCR鑒定后送上海桑尼生
物工程有限公司進行測序。
4. 藏綿羊DQA2基因第2外顯子等位基因頻率
表1藏綿羊DQA2基因第2外顯子的基因型頻率
"^i~ 觀察值 等位基因頻率 —
基因 ~"111 健康羊 患病羊 健康羊
合計 245 722
5.結果分析
禾IJ用PCR-SSCP方法檢測了967只表型正常和患病藏綿羊0LA-DQA2基因第2外顯子 的多態性后，發現了16個等位基因，其中14個等位基因(OLA-DQA2*A、 OLA-DQA2*B、 OLA-DQA2*C、 OLA-DQA2*D 、 OLA-DQA2*E、 OLA-DQA2*F、 OLA-DQA2*G、 OLA-DQA2*I、 OLA-DQA2*J、 OLA-DQA2*K、 OLA-DQA2*M 、 OLA-DQA2*N 、 OLA-DQA2*0、 OLA-DQA2*P )在正常和患病群體中都存在，l個等位基因
94 0.1673 0.1302
79 0.0653 0.1094
23 0.0245 0.0319
26 0.0204 0.0360
27 0.0245 0.0374 87 0.1469 0.1205 56 0.0857 0.0776 0 0.0204 0.0000 58 0.0898 0.0803 48 0.0653 0.0665 54 0.0857 0.0748 7 O細O 0.0097 56 0.0571 0.0776 18 0.0490 0.0249 36 0.0163 O., 53 0.0816 0.0734
61 261 42 o
32521201142
ABCDEFGHIJKLMNOP
8(OLA-DQA2*L)只在正常群體中存在，另有l個等位基因(OLA-DQA2*H)只在患病 群體中存在。
以上所述僅為本實用新型的較佳實施例，并不用以限制本實用新型，凡在本實用新 型的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本實用新型的 保護范圍之內。
權利要求1.一種藏綿羊腐蹄病抗性等位基因PCR-SSCP檢測試劑盒，包括有盒體(1)，襯墊(2)，在襯墊(2)上設有數個容器孔，其特征是在容器孔中分別放置第一PCR反應液(4)，第二PCR反應液(11)，OLA-DQA2*L的DNA標準樣(10)。
2. 如權利要求1所述的藏綿羊腐蹄病抗性等位基因PCR-SSCP檢測試劑盒，其特征是還 包括在容器孔中還分別放置SSCP檢測試劑，去離子水(5)， 10%過硫酸銨(7)，變 性緩沖液(6) ， TEMED (8)，聚丙烯酰胺(9)。專利摘要本實用新型主要涉及動物生物技術領域中的綿羊分子標記輔助育種技術，具體涉及到藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測試劑盒。一種藏綿羊腐蹄病抗性等位基因PCR-SSCP檢測試劑盒，包括有盒體(1)，襯墊(2)，在襯墊(2)上設有數個容器孔，其主要特點是在容器孔中分別放置第一PCR反應液(4)，第二PCR反應液(11)，OLA-DQA2*L的DNA標準樣(10)。本實用新型的優點反應靈敏、特異性強、易操作，適用于各級畜牧獸醫教學科研單位，獸用生物制品廠以及各大、中型藏綿羊養殖企業的抗腐蹄病的選種。
文檔編號C12Q1/68GK201381325SQ2009201528
公開日2010年1月13日 申請日期2009年4月10日 優先權日2009年4月10日
發明者秀 劉, 王繼卿, 羅玉柱, 江 胡, 馬小軍 申請人:甘肅農業大學