專利名稱：誘導干細胞向胰島樣細胞分化的方法及胰島樣細胞的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域，具體地說是涉及一種體外誘導干細胞向胰島樣細胞定向分化的方法及胰島樣細胞的用途。
背景技術：
糖尿病(DM，Diabetes Mellitus)是胰島素分泌相對或絕對不足或胰島素受體作缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質代謝紊亂性疾病。臨床上，I型及部分II型糖尿病多采用皮下注射胰島素來治療。細胞治療是糖尿病尤其是I型糖尿病的理想治療策略，對于已經喪失胰島細胞功能的糖尿病患者來說，植入能分泌胰島素的β細胞或其替代物是最理想的治療方法。近幾年，胰島細胞移植治療糖尿病取得了一些療效，但供者細胞來源不足、嚴重的免疫排斥反應等困難卻極大的限制了這種療法的應用。
干細胞具有極強自我更新能力及多向分化潛能，是基因治療的理想靶細胞。干細胞分為全能干細胞(如胚胎干細胞，可以分化為機體所有組織細胞)、多能干細胞(具有多向分化潛能，可以分化為多種組織細胞，如間充質干細胞等)和專能干細胞(維持某一特定組織細胞的單一方向自我更新，如腸上皮干細胞等)。干細胞技術的不斷突破及干細胞本身所具有的特性使人類有可能在體外培養某些干細胞，定向誘導其分化為我們所需要的各種組織細胞，或作為種子細胞用于組織工程以供臨床所需，以此為目的的干細胞工程涉及人體幾乎所有重要組織器官及人類面臨的大多數醫學難題，如心血管疾病、糖尿病、惡性腫瘤、骨及軟骨缺損、老年性癡呆、帕金森病、燒傷、脊髓損傷和遺傳性缺陷等的治療。由于人臍帶血、外周血和骨髓中的多能干細胞，具有增殖能力強、來源豐富、采集方便等優點，此類干細胞移植在血液系統疾病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病等的治療中發揮了重要的作用。
胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是一種腸促胰島素激素，它是一種由小腸L細胞分泌的多肽激素，具有促進胰島素分泌，抑制胰升糖素釋放，抑制胃排空，增加β細胞增殖等作用。它還具有對葡萄糖依賴的降血糖作用，不會產生低血糖。能使2型糖尿病病人的基礎和葡萄糖刺激后β細胞功能恢復到非糖尿病水平，改善血脂水平。GLP-1受體是一個與G蛋白偶聯的7個跨膜結構，主要第二信使為cAMP，當細胞外液葡萄糖濃度增加時，葡萄糖進入β細胞被氧化使細胞內ATP含量增加，ATP與ATP敏感K+通道結合，導致K+通道關閉，細胞膜去極化，于是Ca2+通道開放，Ca2+內流，刺激胰島素從β細胞排出，從而促進了胰島素的分泌。GLP-1與β細胞膜上的GLP-1受體結合，通過增加細胞內cAMP，使K+ATP酶磷酸化進而促進胰島素的分泌，同時競爭胰高血糖素受體，降低胰高血糖素濃度。
對干細胞進行適當的基因修飾，使之成為能分泌胰島素的細胞，是治療I型糖尿病的理想策略之一，而引入胰高血糖素樣肽-1受體基因(glp-1r基因)，有可能使我們獲得能分泌胰島素的細胞。因此，分離不同組織來源的成體干細胞，將其在體外誘導分化為胰島樣細胞作為種子細胞用于胰島細胞移植、微囊化干細胞制劑等的制備，同時誘導分化的胰島樣細胞可作為體外的藥代動力學模型用于細胞藥物篩選。此方法的建立將在以基因工程、細胞工程乃至組織工程等為基礎的再生醫學中具有極佳的應用前景，并將產生巨大的社會效益和經濟效益。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是建立一種體外誘導干細胞分化為胰島樣細胞的方法。
為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是利用干細胞具有多向分化的潛能，誘導其向胰島樣細胞分化，誘導分化的細胞可分泌胰島素，為胰島細胞移植、微囊化干細胞制劑的制備提供種子細胞，同時誘導分化的細胞可作為體外的藥代動力學模型用于細胞藥物篩選。
本發明中所用的誘導方法，其特征在于利用含有GLP-1受體基因的載體轉染干細胞，并同時添加細胞因子GLP-1，在GLP-1的作用下誘導干細胞向胰島樣細胞分化。
本發明中的干細胞包括人和哺乳動物胚胎、骨髓、動員的外周血、臍帶血以及其它組織來源的間充質干細胞、胰腺干細胞、肝干細胞、造血干細胞及神經干細胞。
本發明中所用的載體包括腺病毒載體，腺相關病毒載體，慢病毒載體，逆轉錄病毒載體，通過這些載體介導GLP-1R基因在干細胞中表達。
本發明所用的體外誘導方法是將GLP-1直接加入轉染了GLP-1R基因的干細胞的培養液中，在GLP-1的作用下誘導干細胞向胰島樣細胞分化。
本發明用于基因轉染的載體中腺病毒載體是轉染GLP-1R基因的首選病毒載體。
本發明選用的培養液為無血清誘導培養液，其中添加了營養素或細胞因子，包括GLP-1、尼克酰胺、葡萄糖，可以誘導轉染GLP-1R基因的干細胞向胰島樣細胞分化。
本發明中所獲得的胰島樣細胞團能表達胰島相關基因及蛋白，包括葡萄糖轉運子、葡萄糖激酶、胰島素、胰高血糖素、生長抑素。
本發明中體外誘導干細胞向胰島樣細胞分化后的胰島樣細胞能分泌胰島素，可作為種子細胞用于胰島細胞移植、微囊化干細胞制劑的制備及作為體外的藥代動力學模型用于細胞藥物篩選。
具體實施方案如下1.分離不同組織來源的成體干細胞，制備方法是(1)骨髓間充質干細胞的分離無菌條件下，經雙側髂后上棘穿刺，采集骨髓，經Percoll(美國，Sigma公司產品，相對密度1.073g/ml)密度梯度離心后收集人骨髓單個核細胞，貼壁培養72h，去除懸浮細胞后貼壁生長的即為骨髓間充質干細胞。
(2)大鼠肝干細胞分離無菌條件下，沿正中線切開大鼠腹腔并暴露門靜脈，輸注無鈣鎂Hanks液至肝臟變成肉色后，保留門靜脈，離斷肝臟并將肝臟移入無菌平皿中，再輸注含IV型膠原酶的Hanks液，回收平皿內的膠原酶液，去除肝包膜及血管，鈍性撕裂肝組織，以培養基溶解，多層紗布過濾，反復離心洗滌，再以培養基制備成單個肝細胞懸液。
(3)臍帶血單個核細胞的分離無菌及ACD抗凝液抗凝條件下經臍靜脈穿刺取血，采集健康足月順產新生兒臍帶血，依次經過0.5％甲基纖維素(美國，Sigma公司產品)沉降及Ficoll(美國，Sigma公司產品，相對密度1.077g/ml)密度梯度離心后收集人臍帶血單個核細胞，洗滌后重懸于PBS中。
2.構建了含glp-1r基因的腺病毒載體，步驟如下用電穿孔法使穿梭質粒pAdtrack-CMV-glp-1r與病毒骨架質粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183中同源重組。利用脂質體介導重組腺病毒載體轉染293細胞，包裝并擴增腺病毒。
3.構建重組逆轉錄病毒質粒pMSCV-GLP-1R，步驟如下設計含有Sal I、Ecor V位點的GLP-1R基因上、下游引物，從攜帶GLP-1R基因的質粒中獲得目的基因GLP-1R，將反應產物克隆至pGEM-T eassy載體(Promega公司，美國)，獲得克隆質粒T-GLP-1R，用限制性內切酶SalI和Ecor V雙酶切后，回收目的片段插入到pMSCVneo載體，獲得攜帶目的基因的逆轉錄病毒載體pMSCV-GLP-1R。
4.用攜帶目的基因的載體轉染干細胞。
5.在轉染的干細胞培養液中直接添加GLP-1細胞因子，誘導干細胞分化為胰島樣細胞。
6.利用RT-PCR鑒定體外誘導分化的細胞。
本發明的有益效果是1.按照本發明提供的技術方法，可以將人和哺乳動物胚胎、骨髓、外周血、臍帶血以及其它組織來源的間充質干細胞、胰腺于細胞、肝干細胞、造血干細胞及神經干細胞等在體外定向誘導分化為能分泌胰島素的胰島樣細胞；2.按照本發明技術方法得到的體外誘導分化的胰島樣細胞，可作為種子細胞應用于胰島細胞移植及微囊化干細胞制劑的制備；3.按照本發明技術方法得到的體外誘導分化的胰島樣細胞，可作為體外的藥代動力學模型用于細胞藥物篩選。
4.本發明中誘導分化方法的建立將在以基因工程、細胞工程乃至組織工程等為基礎的再生醫學中具有極佳的應用前景，并將產生巨大的社會效益和經濟效益。
圖1 PCR產物電泳圖MDL2000 -陰性對照 1非特異性條帶 21300bp左右的目的基因GLP-1R。
圖2 T載體連接產物酶切、PCR鑒定圖MDL15000Marker1、目的基因與Teasy載體連接產物2、PCR鑒定圖3、酶切鑒定圖(I3.0kb；II1.3kb)圖3帶目的基因的腺病毒穿梭質粒酶切鑒定圖MDL15000Marker
1酶切鑒定圖(I9.7kb；II1392bp)圖4重組質粒的鑒定4aMDL15000Marker1未重組的質粒大小9kb左右2重組成功的質粒大小40kb左右4bMDL15000Marker1PacI性酶切鑒定圖(I38.6kb II4.5kb)圖5lGLP-1R基因的表達1.未轉染的MSC；2.轉染glp-1r于MSC 3天；3.轉染glp-1r于MSC 7天；4.轉染glp-1r于MSC 14天；+.陽性對照IIPDX-1基因的表達1.未轉染的MSC；2.轉染glp-1r于MSC 3天；3.轉染glp-1r于MSC 7天；4.轉染glp-1r于MSC 14天III胰島素基因的表達1 未轉染的MSC；2 轉染glp-1r于MSC3天；3.轉染glp-1r于MSC 7天；4.轉染glp-1r于MSC 14天圖6免疫組織化學檢測結果具體實施方式
實施例1、GLP-1R基因的獲得攜帶GLP-1R基因的質粒由德國Lankette教授饋贈。設計含有Sal I、Ecor V位點的GLP-1R基因全長上、下游引物，引物序列及其多聚酶鏈式反應(PCR)的條件如下上游引物5′-gtc gac tcc tga act ccc cgc catg-3′下游引物5′-gat atc gct gga gtc tca gct gca cgga-3′
20μl反應體系包括1μl cDNA(100ng/μl)，primer1和2各0.5μl(20μM)，1.5μl dNTP(2.5mM)，0.25μl La Taq DNA聚合酶(TakaRa公司，5u/μl)，2μl 5×GC Buffer I，14.75μl滅菌水。反應條件為94℃變性3min；94℃45s，56℃45s，72℃2min，28個循環；72℃7min。電泳后1300bp左右為目的基因GLP-1R(見圖1)。反應產物克隆至pGEM-T eassy載體(Promega公司，美國)，獲得克隆質粒T-GLP-1R(見圖2)。
實施例2、pAdv-GLP-1R腺病毒載體的構建用Sal I、Ecor V雙酶切連入pGEM-T easy載體的GLP-1R基因后，回收目的片斷插入腺病毒穿梭質粒pAdtrack-cmv的Sal I、Ecor V位點，獲得帶有GLP-1R基因的腺病毒穿梭質粒，經Sal I及Ecor V雙酶切鑒定，切出了1392bp的小片段及9.7kb的大片段(見圖3)。
選用PmeI酶切1μg穿梭質粒pAdtrack-cmv-GLP-1R，70％乙醇沉淀質粒，加5μl H2O。線性化的穿梭質粒與100ng超螺旋質粒pAdEasy-1電穿孔共轉化至BJ5183感受態菌中，菌液涂卡那霉素抗性平板篩選。選擇20個小克隆，分別接種于含卡那霉素的LB培養液，37℃搖菌過夜。提取質粒，重組質粒均大于40kb，所以經0.7％瓊脂糖電泳可初步鑒定。根據電泳結果，選取質粒作PacI限制性酶切鑒定。重組質粒可被酶切出4.5kb的小片段及38.6kb的大片段(見圖4)。
取鑒定好的重組病毒質粒5μg行PacI限制性酶切。用Lipofectine 2000包裹線性化質粒轉染293細胞，轉染12h后去掉轉染液，加含5％胎牛血清的DMEM培養液繼續培養7～10天，當細胞出現CPE時，收集細胞，-70℃和37℃反復凍融三次，離心取上清。用病毒上清再次感染293細胞，收集上清。用TCID50法測定病毒滴度(參考AdEasy Vector Systerm操作方法)，滴度為2.0×108PFU/mL。
實施例3、重組逆轉錄病毒質粒pMSCV-GLP-1R的構建。
克隆質粒T-GLP-1R用限制性內切酶Sal I和Ecor V雙酶切后，回收目的片段插入到pMSCVneo載體的Sal I和Ecor V位點上，獲得攜帶目的基因的逆轉錄病毒載體pMSCV-GLP-1R，重組質粒分別經Sal I.Ecor V雙酶切后，TAE瓊脂糖凝膠電泳分別得到5.15KB、1300bp的條帶，與預期結果符合；對其進行正、反向測序及分析表明，其開放閱讀框正確，沒有發生移碼改變。表明我們克隆的目的基因序列正確，重組逆轉錄病毒載體pMSCV-GLP-1R構建成功。
實施例4、逆轉錄病毒產生細胞株的建立和篩選。
PT67細胞用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養液(完全培養液)培養至95％匯合。將pMSCV-GLP-1R 5μg加入250μl無血清培養液，取LF2000 10μl加入250μl上述培養液，兩者混勻室溫放置20min。將PT67細胞用培養液洗2次，緩慢滴入用1ml培養液稀釋的DNA-LF2000混合液。培養6h后，加入1ml含20％胎牛血清的培養液，繼續培養24h后更換完全培養液。細胞轉染48h后按1∶15傳代，加入含600μg/ml G418篩選14d，直至抗性細胞集落形成。挑選大的健康的細胞集落，用完全培養液擴大培養，以制備含病毒的包裝細胞上清、測定病毒滴度并凍存細胞。
實施例5、重組逆轉錄病毒pMSCV-GLP-1R病毒滴度的測定和PT-GLP-1R細胞株的建立。
生長狀態良好的NIH3T3細胞常規培養24h至60％匯合，將制備的病毒液相應作10-2、10-4、10-6倍稀釋，加入polybrene至終濃度為8μg/ml。倒去細胞培養液，分別吸取1ml稀釋的病毒液加入培養皿中，常規培養5h，補加2ml含胎牛血清的培養基常規培養24h，更換新鮮含500μg/mlG418的培養基，每3d換液一次，培養14d待長出肉眼可見的集落后，傾去培養液，以純甲醛固定后用姬母薩染色，用克隆計數儀自動計數，再乘以稀釋倍數后得病毒滴度(CFU)。我們共挑選出病毒滴度＞106CFU的包裝細胞6個，篩選出具有最高滴度(1.5×108PFU/mL)的包裝細胞，擴大培養后建立高滴度表達GLP-1R的包裝細胞株PT-GLP-1R。
實施例6、重組逆轉錄病毒液中野生型病毒的檢測。
將以上病毒滴度測定所得NIH3T3多克隆用完全培養液擴大培養48h，收集所得細胞上清再次感染NIH3T3細胞，加500μg/ml G418篩選，5d后細胞全部死亡。提示PT67細胞不產生可檢測出的輔助病毒，用它制備的逆轉錄病毒可以感染人和其他哺乳動物細胞可以廣泛使用而且較為安全。
實施例7、骨髓間充質干細胞的分離培養和擴增由非血液系統疾病胸外科手術后獲得肋骨，無菌條件下擠出肋骨中的骨髓；或由非血液系統疾病或正常人髂后上棘抽取骨髓。向骨髓液中加入含10％胎牛血清的α-MEM(Gibco公司)充分混合，1500r/min離心5min，棄上清，再加入5ml完全培養液混勻后輕輕疊加到密度為1.073的Percoll分離液上，1500r/min離心20min，取白細胞膜層以上的部分，加入完全培養液洗兩遍。按1×106/ml密度接種于完全培養基中，置37℃，5％CO2飽和濕度的孵箱中培養。培養72h后更換培養液，以后每4d換液一次。細胞達80％融合后用25％胰酶消化，按1∶3傳代繼續擴增培養。
實施例8、大鼠肝干細胞的分離雄性Wister大鼠，體重300～350g，3％苯巴比妥鈉麻醉，常規消毒鋪巾，沿正中線切開腹腔并暴露門靜脈，將硅膠管針頭端插入門靜脈繼以細線固定，硅膠管輸液端與一次性輸血器連接，后者連接輸液瓶，先輸注無鈣鎂Hanks液(含EDTA 1mmol/L)200ml，速度為30ml/min，肝臟變成肉色后，除保留門靜脈外離斷肝臟血管、韌帶及系膜，將肝臟移入無菌平皿中，再輸注含0.05％IV型膠原酶Hanks液100ml，輸注速度為15ml/min，可回收平皿內的膠原酶液，視消化程度決定是否繼續輸注。液體溫度為39℃。去除肝包膜及血管，鈍性撕裂肝組織，以培養基溶解，多層紗布過濾，以50g×3min反復離心洗滌3次，再以培養基制備成單個肝細胞懸液。
實施例9、GLP-1誘導干細胞向胰島樣細胞分化以骨髓間充質干細胞為例，選擇病毒感染MSC合適的MOI(Multiplicity of Infection)值(MOI＝300Virus/Cell)，根據細胞數計算所需病毒量，運用收集的病毒上清液感染MSC，孵育2h后，補加含有10％胎牛血清的α-MEM培養液，同時在培養液中直接添加GLP-1細胞因子，繼續培養1周，誘導MSC在體外分化為胰島樣細胞。
實施例10、胰島樣細胞團的鑒定1)利用RT-PCR鑒定不同時間PDX-1、胰島素，胰高血糖素基因的表達。利用primer 3軟件設計基因引物，序列如下
結果表明轉染GLP-1R基因的細胞(1周)高表達GLP-1R、PDX-1、胰島素基因。(見圖5)2)將轉染3天后的MSC接種在96孔板中(5×103/孔)，進行胰島素的免疫細胞染色，結果顯示細胞表達胰島素蛋白陽性，同時我們可以觀察到細胞逐漸變圓并聚集成胰島樣細胞團(見圖6)。未轉染的細胞無相應蛋白質表達。
權利要求
1.一種誘導干細胞向胰島樣細胞分化的方法，其特征在于利用干細胞具有多向分化的潛能，誘導其向胰島樣細胞分化，誘導分化的細胞可分泌胰島素，為胰島細胞移植、微囊化干細胞制劑的制備提供種子細胞，同時誘導分化的細胞可作為體外的藥代動力學模型用于細胞藥物篩選。
2.按照權利要求1所述的誘導方法，其特征在于利用含有GLP-1(胰高血糖素樣肽-1)受體基因的載體轉染干細胞，并同時添加細胞因子GLP-1，在GLP-1的作用下誘導干細胞向胰島樣細胞分化。
3.按照權利要求1所述的誘導方法，其特征在于，所述的干細胞具有多向分化潛能，包括人和哺乳動物胚胎、骨髓、動員的外周血、臍帶血以及其它組織來源的間充質干細胞、胰腺干細胞、肝干細胞、造血干細胞及神經干細胞。
4.按照權利要求1所述的誘導方法，其特征在于，所述的載體包括腺病毒載體，腺相關病毒載體，慢病毒載體，逆轉錄病毒載體，通過這些載體介導GLP-1R基因在干細胞中表達。
5.按照權利要求1所述的誘導方法，其特征在于，將GLP-1直接加入轉染了GLP-1R基因的干細胞的培養液中，在GLP-1的作用下誘導干細胞向胰島樣細胞分化。
6.按照權利要求1或4所述的誘導方法，其特征在于，所述的載體中腺病毒載體是轉染GLP-1R基因的首選病毒載體。
7.按照權利要求1所述的誘導方法，其特征在于，選用的培養液為無血清誘導培養液，其中添加了營養素或細胞因子，包括GLP-1、尼克酰胺、葡萄糖，可以誘導轉染GLP-1R基因的干細胞向胰島樣細胞分化。
8.按照權利要求1所述的誘導方法，其特征在于獲得的胰島樣細胞團能表達胰島相關基因及蛋白，包括葡萄糖轉運子、葡萄糖激酶、胰島素、胰高血糖素、生長抑素。
9.體外誘導干細胞向胰島樣細胞分化后的胰島樣細胞的用途，其特征在于誘導分化后的細胞可分泌胰島素，可作為種子細胞用于胰島細胞移植、微囊化干細胞制劑的制備。
10.按照權利要求9所述的用途，其特征在于誘導分化后的細胞可作為體外的藥代動力學模型用于細胞藥物篩選。
全文摘要
本發明涉及生物醫學領域，具體地說是涉及一種體外誘導干細胞向胰島樣細胞定向分化的方法及胰島樣細胞的用途。本發明的目的是提供一種體外獲得大量胰島樣細胞的方法，并將誘導分化的胰島樣細胞作為種子細胞用于胰島細胞移植、微囊化干細胞制劑的制備以及作為體外的藥代動力學模型用于細胞藥物篩選。為實現上述目的，本發明采用以下技術方案1)獲得GLP－1R基因；2)構建含有GLP－1R基因的病毒載體；3)分離、培養及擴增干細胞；4)向培養液中添加細胞因子GLP－1，誘導干細胞向胰島樣細胞分化；5)獲得的胰島樣細胞鑒定。此方法的建立將在以基因工程、細胞工程乃至組織工程等為基礎的再生醫學中具有極佳的應用前景，并將產生巨大的社會效益和經濟效益。
文檔編號C12N15/85GK1772885SQ20041009078
公開日2006年5月17日 申請日期2004年11月11日 優先權日2004年11月11日
發明者裴雪濤, 張銳, 李艷華, 王韞芳, 閆舫 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所