專利名稱：能生物合成辣椒素酯類物質的基因修飾植物的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物合成數量增加的辣椒素酯類物質的基因修飾植物，生產該基因修 飾植物的方法，由該基因修飾植物的辣椒素酯類物質的生產方法等。
背景技術：
類辣椒素(辣椒素，二氫辣椒素等)，其是智利辣椒的辛辣組分，有效預防肥胖，因 為其促進能量代謝，刺激中樞神經促進激素分泌和激活脂肪分解酶。另外，它消毒了胃腸道 并且改善了免疫性，還有效激活免疫性和減輕疲勞。然而，因為類辣椒素刺激粘膜，大量攝 取可擾亂胃腸狀況。而且，許多日本人不喜歡辛辣味道。作為較少辛辣性的智利辣椒，“CH-19 Sweet"(品種登記號10375)，其是由^zawa 等選擇并且固定的非辛辣性固定品種的智利辣椒，已經被報道包含大量的新型辣椒素酯類 物質(例如非專利文獻1)。這樣的化合物，屬于辣椒素酯類物質(香草醇的脂肪酸酯、辣椒 素酯、二氫辣椒素酯等，在下文中有時簡稱為“辣椒素酯類物質”或“辣椒素酯類物質類”)， 不同于類辣椒素并且不具有辛辣味道。然而，它們已經被報道顯示出免疫性提高作用、能量 代謝激活作用、氧消耗促進作用等(例如專利文件1和2，和非專利文獻2)，并且被期望在 未來是補充物等的原料。在大多數智利辣椒中，香草胺由苯丙氨酸通過阿魏酸、香草醛等形成，而類辣椒素 是由香草胺和支鏈脂肪酸通過類辣椒素合成酶制備的(圖1 (a))。與此相對，類辣椒素幾乎 沒有在CH-19 Sweet中制備反而制備了辣椒素酯類物質。然而，為此的原因多年未知。如上所述，辣椒素酯類物質具有一些辛辣味道，但是顯示出類似于類辣椒素的那 些的優良的生理活性。因此，期望作為補充物等的原料的未來應用。因此，期望闡明辣椒素 酯類物質的生物合成路徑以便繁育和開發能夠產生辣椒素酯類物質的新的植物品種。[現有技術] [專利文件]
專利文件 1: JP-A-11-246478 專利文件 2: JP-A-2001-026538 [非專利文件]
非 專 利 文 件 1: Yazawa et al. , Journal of the Japanese Society for Horticultural Science, vol. 58, pages 601-607， 1989
非專利文件 2: Biosci. Biotech. Biochem. , 65 (12)，2735-2740 (2001)。
發明內容
本發明所要解決的問題
因此，本發明的目的是闡明辣椒素酯類物質的生物合成路徑并且，基于該發現，提供能 從除目前已知產生辣椒素酯類物質的CH-19 Sweet以外的植物通過基因修飾產生辣椒素酯 類物質的植物。
解決該問題的手段
本發明人已經進行了深入研究以實現上述目的并且發現，在CH-19 Sweet中，編碼催 化從香草醛到香草胺的氨基轉移反應的轉氨酶的PAMT基因包含插入突變。也就是說，關于 CH-19 Sweet已經闡明了由于在辛辣品種“CH-19 Hot”(其是CH-19Weet的親代品種)的 PAMT基因的編碼區中一個堿基的插入突變產生終止密碼子，并且沒有產生功能性轉氨酶。 本發明人假設由于PAMT基因的突變，在CH-19 Sweet中從香草醛到香草醇的還原反應變為 主導，代替了從香草醛到香草胺的氨基轉移，并且進一步的與支鏈脂肪酸的酯化反應導致 辣椒素酯類物質產生(圖1(b))。為驗證該假設，本發明人已經制備了具有被引入辛辣品種(辣椒 annuum)品種‘朝天椒(Takanotsume)’ )的pAMT反義核酸的轉基因植物。已經發現，在所 獲得的轉基因植物中顯示出顯著降低的PAMT基因的表達的譜系中，類辣椒素的產生降低， 但辣椒素酯類物質的產生顯著地增加。本發明人基于這些發現已經進行了進一步的研究并且完成了本發明。因此，本發明提供以下 一種能產生辣椒素酯類物質的基因修飾植物，其相比于野生株來說顯示出催化從 香草醛到香草胺的氨基轉移反應的酶的降低的表達或活性。[2]上述[1]中所述的植物，其中上述的酶是pAMT基因產物；上述[1]或[2]中所述的植物，其中上述的酶的降低的表達或活性是由以下引起 的該酶基因的破壞或突變，該基因的轉錄產物的分解或翻譯抑制，或該酶對香草醛的作用 的抑制。[4]上述[1]至[3]中任一項所述的植物，其中該野生株具有類辣椒素生物合成系 統；上述W]中所述的植物，其中該野生株是屬于辣椒屬的植物；一種生產能產生辣椒素酯類物質的基因修飾植物的方法，包括進行基因修飾以降 低在具有類辣椒素生物合成系統的植物中催化從香草醛到香草胺的氨基轉移反應的酶的 表達或活性；上述W]中所述的方法，其中該基因修飾選自編碼針對上述的酶基因的反義RNA、 iRNA、核酶或顯性-失活突變體的DNA的引入，通過敲除方法或誘變劑處理的基因破壞和編 碼對該酶的抗體的基因的引入；上述[6]或[7]中所述的方法，其中上述的酶是pAMT基因產物。[9]上述[6]至[8]中任一項所述的方法，其中具有類辣椒素生物合成系統的植物 屬于辣椒屬；和 一種生產辣椒素酯類物質的方法，其包括從上述[1]至[5]中任一項所述的植物 的果實中回收辣椒素酯類物質。本發明的效果
本發明使得能夠在基本上不產生辣椒素酯類物質或僅僅產生少量的辣椒素酯類物質 的植物品種中還增加辣椒素酯類物質的產生。
4
圖1顯示了辣椒素(a)和辣椒素酯(b)的預期的合成路徑。圖2是具有在反義方向中插入的pAMT基因的Ti-質粒載體，pIG121-Hm的示意圖。圖3顯示了使用從轉化的智利辣椒的葉片提取的DNA作為模板的基因組PCR的結 果，其中M是標記物，C是對照物(沒有基因修飾的辣椒品種‘朝天椒’)，并且每個數字顯示 所選擇的轉化的智利辣椒個體。圖4顯示了轉化的智利辣椒和CH-19 Sweet，和辣椒品種‘朝天椒’的果實的辣椒 素酯含量(a)和辣椒素含量(b)的分析結果。圖5顯示了在轉化的智利辣椒和辣椒品種‘朝天椒’的果實中pAMT基因的轉錄表 達的分析結果。圖6顯示了通過蛋白質印跡分析的從轉化的智利辣椒的果實提取的蛋白質的分 析結果，其中各泳道是 1: CH-19 Hot, 2: TG-1, 3: TG-3, 4: TG-8, 5: TG-14, 6: CH-19 Sweet。
具體實施例方式本發明提供了一種能產生辣椒素酯類物質的基因修飾植物，其相比于野生株來說 顯示出催化從香草醛到香草胺的氨基轉移反應的酶的降低的表達或活性。在本發明中，“野生株”是指這樣的植物，其是在本發明中的基因修飾的目標。待 用于本發明中的野生株可以是任何一種，只要它官能地表達酶基團(例如苯丙氨酸解氨酶 (PAL)，肉桂酸4-水解酶(Ca4H)，香豆酸3-水解酶(Ca3H)，咖啡酸0-甲基轉移酶(COMT)， 類辣椒素合成酶(⑶))，其為類辣椒素的生物合成所需的。植物可以天生地具有這樣的酶 基團，或可以通過外源基因的表達來提供一種或多種酶。優選地，可為本發明使用的野生 株是天生地具有類辣椒素產生能力的植物，更優選屬于辣椒屬的植物。其實例包括但不 局限于辣椒(C annuum)(品種‘朝天椒’，CH-19 Hot,彩椒(Yatsufusa) ’，‘虎尾草 (Toranoo)，，‘舌甘椒(Fushimiama)，等)，番椒(C baccatum)(黃椒(aji amarillo)等)， 燈籠椒(C chinense )(古巴辣椒(habanero ρ印per),印度鬼椒(Bhut Jolokia)等)，小 米椒(C frutescens )(小米椒(Capsicum frutescens L.)等)，和彩葉椒(C pubescens) (茸毛椒(rocoto)等)。沒有特別地限制催化從香草醛到香草胺的氨基轉移反應的酶，只要它是具有轉氨 酶活性并且通過上述野生株產生的蛋白質，其可以使用香草醛作為底物。優選的是存在于 古巴辣椒中的具有與來自稻或番茄的GABA轉氨酶高同源性的轉氨酶pAMT (假定的轉氨酶) 基因，和在其它植物品種中通過其直向同源物(ortholog)編碼的轉氨酶。更具體地說，本發明的pAMT蛋白質(也稱為pAMT基因產物)是這樣的蛋白質，其 包含與SEQ ID N0: 2顯示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列，并且具有與由 SEQ ID N0: 2顯示的氨基酸序列構成的蛋白質至少等價(例如0.5倍或更大，優選地0.7 倍或更大)的轉氨酶活性。在本文中，“基本上相同的氨基酸序列”是指衍生自SEQ ID N0: 2顯示的氨基酸序列構成的CH-19 Hot的pAMT蛋白質的天然等位基因變異體或基因多態性 的氨基酸序列，和其它植物品種等中的它的直向同源物的氨基酸序列。其它植物品種中的 pAMT的直向同源物的實例包括衍生自古巴辣椒的pAMT (Refseq No. AAC78480)，來自稻的 GABA 轉氨酶(Refseq No. AAQ14479)和來自番茄的 GABA 轉氨酶(Refseq No. AA092257)等可以被提及。上述“基本上相同的氨基酸序列”令人期望地具有不少于80%，優選地不少于90%， 更優選地不少于95%，最優選地不少于97%的與SEQ ID NO: 2顯示的氨基酸序列的相似性 (優選地，一致性)。在本文中“相似性”是指，當使用本領域已知的數學算法比對兩個氨基 酸序列時，在最佳比對中相同的和相似的氨基酸殘基與總重疊氨基酸殘基的比例(%)(優 選地，算法可以考慮將空位引入序列之一或兩者用于最佳比例)。在以下條件(預期值=10 ； 允許空位；基質=BL0SUM62 ；過濾=關)下，使用同源性計算算法NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)，可以計 算本說明書中的氨基酸序列的相似性。在本發明中，辣椒素酯類物質生物合成系統的酶基團至少部分與構成類辣椒素生 物合成系統的酶基團一樣，除了催化從香草醛到香草醇的還原反應的那些之外，并且本發 明基于如下發現所產生的辣椒素酯類物質和類辣椒素的定量比取決于上述還原反應和從 香草醛到香草胺的氨基轉移反應哪一個更占優勢地進行。因此，通過相比于野生株降低催 化從香草醛到香草胺的氨基轉移反應的酶的表達或活性，從香草醛到香草醇的還原反應變 得更占主導，結果辣椒素酯類物質產生能力可以被改善。催化從香草醛到香草胺的氨基轉移反應的酶的“表達”是指翻譯產物(S卩，蛋白 質)是由編碼該酶的基因(例如PAMT基因等)產生的，并且以機能狀態在其作用位點定位。 酶的“較低的表達”是指，相比于野生株來說，存在于基因修飾植物中的該酶的蛋白質量顯 著降低的結果。因此，在任何階段，例如在基因水平，轉錄水平，轉錄后調節水平，翻譯水平， 翻譯后修飾水平等，可以進行基因修飾至較低的酶表達。例如，作為在基因水平抑制酶表達的基因修飾，可以提及破壞該酶基因和引入功 能性缺陷的突變。在本文中，“功能性缺陷的突變”可以是降低該酶活性的突變，使得相比于 野生株來說，辣椒素酯類物質產生顯著地增加，和非必須完全消除酶活性的突變。這樣的基 因修飾可以通過利用同源重組的酶基因的敲除(或敲入)技術來實現。作為敲除酶基因的具體手段，可以優選地使用這樣的方法，其包括通過常規方法 分離衍生自待作為基因修飾的目標的植物(即，野生株)的酶基因(基因組DNA)(例如在 pAMT基因的情況下，pAMT基因組DNA可以使用含SEQ ID NO: 1所顯示的源自CH-19 Hot 的pAMT cDNA的全部或部分堿基序列的核酸作為探針，通過菌落或噬斑雜交方法自從由野 生株分離的基因組DNA制備的基因組DNA文庫克隆)并且通過同源重組等將具有為滅活該 基因而構建的DNA序列的DNA鏈(目標載體)插入野生株的酶基因位點。例如，通過下述 方式制備具有為滅活該基因而構建的DNA序列的DNA鏈(目標載體)
(1)將其它的DNA片段(例如耐藥性基因、報告基因等的選擇標記基因)插入其外顯 子區域或啟動子區域來破壞外顯子或啟動子功能，
(2)通過使用Cre-IoxP系統或Flp-frt系統劈開全部或部分的該酶基因來刪除該基
因，
(3)將終止密碼子插入蛋白質編碼區來防止蛋白質的完全翻譯，或
(4)插入終止基因轉錄的DNA序列(例如多聚腺苷酸化信號等)到轉錄區域來防止完 全的mRNA的合成。選擇標記基因優選地是表達盒(expression cassette)的形式，其包含任何在目標植物中能在細胞內起作用的啟動子。當插入該基因使得其被置于該目標酶基因的內源性 啟動子的控制下時，選擇標記基因不需要啟動子。通常，在植物中的基因重組大部分是非同源的，并且被引入的DNA隨機被插入染 色體的任何位置。因此，僅僅通過同源重組靶向到酶基因的克隆的有效的選擇，不能基于選 擇耐藥性、報告基因的表達等的檢測來實現。因此，通過Southern雜交方法或PCR方法的任 何所選擇的克隆的重組位點的確認變得必需。因此，例如，當賦予丙氧鳥苷敏感性的源自單 純皰疹病毒的胸苷激酶(HSV-tk)基因在目標載體中在與目標序列同源的區域外連結時， 具有隨機插入其中的該載體的細胞具有HSV-tk基因，并且因此，該細胞不能在含丙氧鳥苷 的培養基中生長。然而，通過同源重組靶向酶基因位點的細胞變為耐受丙氧鳥苷，因為它不 具有HSV-tk基因并且可以被選擇。備選地，例如，當白喉毒素基因代替該HSV-tk基因被連 結時，因為具有隨機插入其中的該載體的細胞被它產生的毒素殺死，在不存在藥物的情況 下，還可以選擇同源性重組體。引入的DNA的存在可以通過將一部分的形成的耐受菌落施 加到PCR或Southern雜交來確認。作為在基因水平抑制酶表達的另一基因修飾，可以提及通過誘變劑處理將功能性 缺陷的突變引入酶基因。作為誘變劑處理，可以使用任何一種，只要它在野生株的DNA中誘 發點突變、刪除或移碼突變。特別地，可以提及用乙基亞硝基脲，亞硝基胍，苯并芘，吖啶染 料，輻射等的處理。另外，還可以使用各種烷化劑和致癌物質作為誘變劑。作為使誘變劑與 細胞反應的方法，可以使用以下文獻中描述的方法technique of Tissue Culture, 3rd edition (Asakura Publishing Co. , Ltd. ), The Japan Tissue Culture Association ed. (1996)，Nature Genet. , 314 (2000)等。使用目標蛋白質的量作為指標，可以選擇酶 基因的功能性缺陷的變體。在PAMT的情況下，例如，使用針對pAMT蛋白質的多克隆抗體， 可以進行蛋白質印跡分析，并且可以確定PAMT蛋白質的量。至于顯示出顯著降低的pAMT 蛋白質水平的植物，將突變引入該基因可以通過測定從植物的一部分分離的該酶基因的核 苷酸序列來確認。作為在翻譯水平的抑制酶表達的基因修飾，可以提及引入具有分解酶基因的轉錄 產物的活性的核酸，或抑制轉錄產物翻譯為酶蛋白質的核酸。作為這樣的核酸，可以提及 含與該酶的mRNA的核苷酸序列互補的或基本上互補的核苷酸序列或該序列的一部分的核酸。與目標酶的mRNA的核苷酸序列基本上互補的核苷酸序列是指這樣的核苷酸序 列，在受體植物中的生理條件下其具有能結合到mRNA的目標序列并且抑制其翻譯的水平 的互補。特別地，例如，核苷酸序列具有和與該mRNA的核苷酸序列完全互補的核苷酸序列 (即，mRNA互補鏈的核苷酸序列)重疊的區域不少于約80%，優選地不少于約90%，更優選地 不少于約95%，最優選地不少于約97%的相似性。在以下條件(預期值=10 ；允許空位；過濾 =開；相配得分=1 ；失配得分=-3)下，使用同源計算算法NCBIBLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool),可以計算本發明中 的“核苷酸序列的相似性”。更具體地說，例如，當該酶是pAMT時，與pAMT mRNA的核苷酸序列互補的或基本上 互補的核苷酸序列的實例包括
(a)由SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列或(b)在嚴格條件下雜交至如下核苷酸序列的核苷酸序列，其是與編碼具有相當于 由SEQ ID NO: 2顯示的氨基酸序列構成的蛋白質的活性的蛋白質的序列互補的或基本 上互補的核苷酸序列。在嚴格的條件下是指，例如，以下文獻中所描述的條件=Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons，6. 3. 1-6. 3. 6, 1999，例如，用 6XSSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)/45° C雜交，然后用0.2XSSC/0. 1% SDS/50 - 65° C洗滌 一次或多次等，并且本領域技術人員能夠適當地選擇雜交條件，得到與其等價的嚴格。pAMT mRNA優選地是含由SEQ ID NO: 1顯示的核苷酸序列的CH-19 Hot的 pAMT mRNA，或在其它植物品種中的其直向同源物(例如源自古巴辣椒的pAMT (Refseq No. AF085149)，稻的 GABA 轉氨酶(Refseq No. AF297651)和番茄的 GABA 轉氨酶(Refseq No. AY240231)等)，或進一步地，天然等位基因變體，或其基因多態性。在長度和位置方面，沒有特別地限制“與目標酶的mRNA的核苷酸序列互補的或基 本上互補的核苷酸序列的部分”，只要它可以特定地結合到目標酶mRNA并且抑制從該mRNA 的蛋白質的翻譯。但是，從序列特異性的方面來說，它包含至少10個堿基，優選地不少于約 15個堿基，更優選地不少于約20個堿基的與該目標序列互補的或基本上互補的部分。特別地，含與目標酶的mRNA的核苷酸序列互補的或基本上互補的核苷酸序列或 這樣的序列的一部分的該核酸的優選的實例包括以下(a)至(C)。(a)針對目標酶mRNA的反義RNA
(b)針對目標酶mRNA的iRNA(干擾RNA)
(c)針對目標酶mRNA的核酶
(a)針對目標酶mRNA的反義RNA
在本發明中的“反義RNA”是含與目標mRNA的核苷酸序列互補的或基本上互補的核苷 酸序列或其一部分的核酸，并且具有通過與目標mRNA形成特定的和穩定的雙鏈抑制蛋白 質合成的功能。在長度方面，不特別地限制反義RNA的目標區域，只要該反義RNA的雜交導 致抑制目標mRNA翻譯為酶蛋白質，并且其可以是編碼該酶的總mRNA序列或其部分序列，其 中較短的是約10個堿基長，較長的是總mRNA序列。而且，本發明的反義RNA不僅可以雜交至目標酶mRNA來抑制翻譯為蛋白質， 也可以結合到該酶的基因，其是雙鏈DNA，而形成三鏈體并且抑制轉錄為RNA(抗基因 (anti-gene))。(b)針對目標酶mRNA的iRNA
在本說明書中，雙鏈RNA由以下構成與目標酶mRNA互補的寡RNA和其互補的鏈，即 iRNA，也被定義為包涵在含與目標酶的mRNA的核苷酸序列互補的或基本上互補的核苷酸 序列或其一部分的核酸內。在線蟲、昆蟲、植物等中，很久以來已經知道雙鏈RNA的細胞內 引入導致與其RNA互補的mRNA的分解，所謂的RNA干擾(RNAi)的現象。自從這種現象被 證實廣泛發生于動物細胞中[Nature，411(6836) 494-498 Q001)]，其已經廣泛地用作 核酶的備選技術。基于待作為目標的mRNA的核苷酸序列的信息并且使用市售可得的軟件 (例如 RNAi Designer ；Invitrogen)，iRNA 可以被適當地設計。(c)針對目標酶mRNA的核酶
作為具有最寬實用性的核酶，可以提及在感染性RNA如類病毒、擬病毒中發現的自剪 接的RNA，并且已知錘頭型、發夾型等。錘頭型具有僅僅約40個堿基顯示出酶活性，并且有可能通過使與具有錘頭結構的部分相鄰的兩端上的若干堿基(總共約10個堿基)形成 與mRNA期望切割位點互補的序列而單獨特異性地使目標mRNA裂解。因為這類核酶僅僅 包含RNA作為底物，其是進一步有利的，因為其不攻擊基因組DNA。當目標酶mRNA本身具 有雙鏈結構時，目標序列可以通過使用雜化核酶被轉化為單鏈，其中連結了能夠特異性地 結合到RNA解旋酶的源自病毒核酸的RNA基序[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10) 5572-5577 (2001) ]0而且，為促進轉移到細胞質，可以使用雜化核酶，其中通過修飾tRNA 獲得的序列被進一步連結[Nucleic Acids Res. , 29(13) 2780-2788 (2001)] 編碼針對該目標酶的mRNA的反義RNA的DNA，當反義RNA比較長，并且是例如不少 于100個bp時，可以通過下述方式產生，根據常規方法克隆該目標酶的CDNA，并且直接將其 連結，或者在通過用合適的限制酶消化分裂為含期望區域的期望長度后，連結到能在反義 方向中在目標植物的細胞中起作用的啟動子的下游。當反義RNA比較短并且例如是100個 bp或更小時，其還可以通過市售可得的DNA/RNA自動合成儀來化學合成。編碼針對目標酶mRNA的iRNA的DNA可以構建為編碼發夾型dsRNA的DNA，這是通 過下述方式實現的通過RT-PCR擴增mRNA上的目標序列(例如，約200-500個堿基)而得 到雙鏈DNA，并且通過使用限制酶和連接酶經由合適的連接體序列在正義方向和反義方向 中連結兩個雙鏈DNA。在它的序列和長度方面沒有特別地限制該連接體序列，只要其可以形 成能夠在構建的DNA的轉錄時形成發夾型dsRNA的環。例如，當報告基因如β -葡糖苷酸酶 基因用作連接體序列時，通過檢測報告基因的表達，可以監測從該發夾型dsRNA切斷iRNA。編碼針對目標酶mRNA的核酶的DNA可以通過由DNA/RNA自動合成儀合成具有設 計的核酶的核苷酸序列的DNA來制備。通過任何基因工程方法可以將含與目標酶的mRNA的核苷酸序列互補的或基本上 互補的核苷酸序列或其一部分的核酸引入目標植物。例如，可以提及用含基因工程處理以 包含該核酸的病毒基因組的植物病毒感染，和用含該核酸的表達載體轉化目標植物細胞。優選地，本發明的基因修飾植物是在能在目標植物(野生株)細胞中起作用的啟 動子的控制下用含上述核酸的表達載體通過轉化該野生株的細胞獲得的轉基因植物。能在野生株細胞中起作用的啟動子可以根據用作該野生株的植物品種適當地選 擇。通常，可以提及在植物細胞中固有表達的基因啟動子，優選地，衍生自植物或植物病毒 的固有啟動子(例如花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子、CaMV 19S啟動子、NOS啟動子等)， 或在野生株目標酶基因中的順式啟動子等。在本發明的表達載體中，含與目標酶的mRNA的核苷酸序列互補的或基本上互補 的核苷酸序列或其一部分的核酸位于能在野生株細胞中起作用的啟動子的下游，以便其轉 錄可以由該啟動子調節。優選地，在該核酸序列的下游，進一步添加能在野生株中起作用的 轉錄終止信號(終止子區域)。該終止子的實例包括NOS (胭脂氨酸合成酶)基因終止子等。本發明的表達載體可以進一步包含順-調節元件如增強子序列等。而且，期望該 表達載體進一步包含用于選擇轉化體的標記基因如耐藥性基因標記等[例如，新霉素磷酸 轉移酶II (NPTII)基因，潮霉素磷酸轉移酶(HPT)草胺膦乙酰轉移酶(PAT)基因，抗草甘膦 (glyphosate)基因等。而且，為有助于大規模制備和提純，期望該表達載體包含在大腸桿菌中使得能夠自發復制的復制起點和在大腸桿菌中的選擇標記基因(例如，氨芐青霉素抗性基因，四環 素抗性基因等)。本發明的表達載體可以通過下述方式來方便地構建，將上述核酸的表達盒 和，根據必需的選擇標記基因，插入PUC或pBR大腸桿菌載體的克隆位點。當上述核酸通過利用以根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或發根土壤 桿菌(Agrobacterium rhizogenes )感染引入時，該核酸的表達盒可以被插入細菌所保留的 Ti或Ri質粒上的T-DNA區域(待轉移到植物染色體的區域)，并且投入使用。對于通過土 壤桿菌方法的轉化的標準方法，使用二元載體系統。T-DNA轉移所需的作用獨立地由T-DNA 本身和Ti (或Ri)質粒提供，并且每個組成因子可以在不同的載體上分開。在為T-DNA的 切斷和插入所需的兩端上，二元質粒具有25個bp邊界序列，并且沒有引起冠嬰(或發根) 的植物激素基因，因此同時得到插入外源基因的空間。作為這樣的二元載體，例如，PBI101、 PBI121 (都是CL0NTECH)等是市售可得的。在插入T-DNA時起作用的vir區域位于不同的 Ti (或Ri)質粒上，被稱為輔助質粒。通常已知的各種方法可用于轉化植物。其實例包括這樣的方法，其包括通過用 細胞壁分解酶如纖維素，半纖維素等處理從目標植物的細胞中分離原生物，并且向該原生 物和含上述PAMT基因表達盒的表達載體的懸浮液添加聚乙二醇以便通過類似胞吞的方法 (PEG法)將表達載體插入該原生物；這樣的方法，其包括通過聲處理等將表達載體插入脂 質膜泡如磷脂酰膽堿等，并在PEG存在下融合該泡和原生物(脂質體方法)；這樣的方法， 其包括通過相似的方法使用迷你細胞的融合；和這樣的方法，其包括向原生物和表達載體 的懸浮液施加電脈沖以便將胞外溶液中的載體插入該原生物(電穿孔方法)。然而，這些方 法是復雜的，因為用于從原生物至植物的再分化的培養技術是必需的。作為轉基因到具有 細胞壁的完整細胞中的方法，可以提及顯微注射方法，其包括將微量吸液管推入細胞，并通 過液壓或氣壓胞內注入該移液管中的載體DNA;直接引入方法，其包括通過火藥爆炸或氣 壓使以DNA涂布的金屬微粒加速以便胞內引入，如粒子槍方法等，和這樣的方法，其利用以 土壤桿菌進行感染。顯微注射具有缺陷，其操作需要實踐，并且可操作的細胞的數量少。因 此，考慮操作的便利性，優選通過土壤桿菌方法或粒子槍方法轉化植物。粒子槍方法是更有 用的，因為在收割前基因可直接被引入植物的頂端分生組織。而且，在土壤桿菌方法中，通 過在二元載體的邊界序列間同時插入植物病毒，例如，雙生病毒的基因組DNA如番茄金色 花葉病毒(TGMV)等，僅通過在收割前在植物的任何部分用注射筒等嫁接細胞懸浮液至細 胞，病毒感染遍及整個植物，并且目標基因被同時引入整個植物。然而，在粒子槍方法和土壤桿菌方法中，因為轉基因常常是嵌合體的，允許以高頻 率在種系細胞中引入上述核酸的樣品細胞需要用于轉化。例如，可以提及胚，下胚軸切片， 胚性愈傷組織，分離的生長點等。另一方面，因為上述使用原生物和顯微注射方法的轉化方 法允許選擇從單個細胞再分化植物，它們是獲得具有引入整個細胞的PAMT基因的同質轉 基因植物的優異的轉化手段。作為特定的實例，在辣椒屬植物中，通過土壤桿菌引入目標桿菌和轉化的細胞引 入植物的再生方法在下文中顯示，其僅是實例并且根本沒有限制本發明的基因修飾植物的 生產方法。智利辣椒植物的種子被殺菌，播種在合適的種子萌芽培養基(例如MS培養基，LS 培養基，B5培養基等)上，并且無菌生長。另一方面，培養具有與目標核酸相連接的并且用具有卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因的質粒轉化的啟動子的土壤桿菌，并且用合適的 培養基稀釋而得到土壤桿菌溶液。將發芽后的子葉浸在土壤桿菌溶液中約10分鐘，移植到 用期望的植物激素(例如茁長素如IAA、NAA等，細胞分裂素如激動素，芐基腺嘌呤等)和卡 那霉素和潮霉素抗生素添加的選擇培養基(例如MS培養基，LS培養基，B5培養基等)，并 且在20-30°C下培養。所獲得的卡那霉素和潮霉素抗性愈傷組織和秧苗被移植到根據需要 添加芐基腺嘌呤的再分化(生根)培養基(例如MS培養基，LS培養基，B5培養基等)以便 誘發再分化(生根)，由此獲得秧苗植物。當觀察到數個真葉時，將該秧苗植物移植到土壤 以便環境適應，并且在受控溫室如生物氣候室等中生長。可以從由此獲得的轉化株獲得種 子和果實。根據常規方法從上述轉化株提取基因組DNA，用合適的限制性內切酶使該DNA被 切割，使用引入的目標核酸作為探針進行Southern雜交，由此可以證實存在或不存在轉 化。另外，通過合成引物(所述引物特異性地擴增該目標核酸)并且進行PCR方法，也可以證 實存在或不存在轉化。此外，通過常規方法可以從轉化株或非轉化株中提取RNA，并且通過定量RT-PCR、 Northern雜交等可以檢查目標酶mRNA在表達水平的變化。備選地，可以通過常規方法從轉 化株或非轉化株中提取蛋白質，并且可以通過免疫測定(RIA方法，ELISA方法，FIA方法等) 通過使用該目標酶的抗體檢查目標酶蛋白質在表達水平的變化。如上所述，因為在植物中 大部分的基因重組事件源于非同源重組，由于以該引入的核酸插入的染色體區域的位置效 應，與野生株相比，在全部的轉基因植物中，目標酶的表達不總是下降。因此，如上所述，通 過測量和比較在該目標酶的RNA水平或蛋白水平下的轉化株和非轉化株的表達量，可以證 實與在野生株中相比，在轉基因植物中的該目標酶的更低表達，基于此，可以獲得目標基因 修飾植物。根據該目標核酸的插入方式，以一定比例在統計上包含由通過由此獲得的轉基因 植物(與野生株相比，其顯示出更低的目標酶表達，結果與野生株相比顯示出較高的辣椒 素酯類物質產生能力)的自體受精獲得的種子分化的植物。在從通過再分化代(RO)植物 的自體受精獲得的Rl種子分化的植物中改進的辣椒素酯類物質產生能力的出現比例通常 遵循Mendel法則。例如，當目標核酸雜合插入一個基因位點時，基于改進的辣椒素酯類物 質產生能力，Rl種子被分成3:1。在從該Rl種子分化的Rl植物中，具有改進的辣椒素酯類 物質產生能力的那些被種植并且自體受精而得到R2種子。當在全部種子中保持了改進的 辣椒素酯類物質產生能力時，該Rl植物被確定為對于被引入的核酸的純合子，而當改進的 辣椒素酯類物質產生能力以3:1顯示時，該Rl植物被確定為對于被引入的核酸的雜合子。 由此選擇的基因修飾植物，其是對于被引入的核酸的純合子，作為固定地具有改進的辣椒 素酯類物質產生能力的株非常有用。因為辣椒素酯類物質積聚在果實(果皮，胎座等)中， 通過期望地使用也在組織如葉等中表達的目標酶的表達或活性作為指標，可以在早期階段 獲知辣椒素酯類物質產生能力。沒有特別地限制抑制催化從香草醛到香草胺的氨基轉移反應的酶的活性的基因 修飾，只要它是已知的。例如，可以提及將抗體基因引入該酶，引入顯性-失活突變體基因等。為避免困難如植物等中的H鏈和L鏈的組裝效率，期望抗體基因編碼由基因工程制備的單鏈抗體，如SCFV、SCFV-FC、微抗體、雙特異抗體等。這樣的抗體可以通過如下方式 來制備由通過常規方法由用目標酶蛋白質或其片段免疫的小鼠制備產生抗體的雜交瘤， 通過常規方法由該細胞克隆該抗體基因，并適當地通過連接體DNA連結該片段。顯性-失活突變體是指由于引入突變到目標酶中而活性降低的突變體。在顯 性-失活突變體中，通過野生株中的目標內源酶與該底物香草醛競爭性相互作用，可以間 接地抑制該酶的功能。通過將突變引入編碼該靶基因的核酸，可以產生顯性-失活突變體。 該突變的實例包括氨基酸突變，其引起由功能位點提供的功能的降低(例如刪除，取代或 添加一個或多個氨基酸)。通過PCR或使用已知的試劑盒的本身已知的方法，可以產生顯 性-失活突變體。作為引入編碼抗體基因的DNA和顯性-失活突變體到目標植物中而得到轉基因植 物的方法，優選地使用類似于上述用于引入含與目標酶的mRNA的核苷酸序列互補的或基 本上互補的核苷酸序列或其一部分的核酸的方法的方法。因此，通過測量和比較轉化株和非轉化株之間的該目標酶的活性，可以證實與野 生株中相比，在所獲得的基因修飾植物中該目標酶的更低的活性，基于此，可以獲得目標基 因修飾植物。例如，當目標酶是PAMT時，從胎座、花等中提取蛋白質，將香草醛添加到提取 物并且培養混合物一段給定時間，通過HPLC等量化所得的香草胺，由此可以檢查該酶活 性。如上述所獲得的基因修飾植物，其與野生株相比顯示了催化從香草醛到香草胺的 氨基轉移反應的酶的降低的表達或活性，與野生株相比，顯示出提高的辣椒素酯類物質產 生能力。“提高的產生能力”可以是與天生具有產生辣椒素酯類物質的能力的野生株相比， 進一步提高的辣椒素酯類物質產生能力，或者由天生不能產生辣椒素酯類物質的植物所新 獲得的產生能力。本發明還提供辣椒素酯類物質的生產方法，包括從本發明的基因修飾植物回收辣 椒素酯類物質。作為回收辣椒素酯類物質的方法，可以使用任何已知的方法，例如，可以無 限制地使用上述專利文件 1CJP-A-11-246478)、JP-A-2002-226445, JP-A-2004-018428、 W02005/122787 和 / 或 2006/043601 中所述的方法。
實施例實施例1 產生pAMT基因表達-抑制性轉化的智利辣椒
在反義方向，將用從CH-19 Sweet提取的cDNA通過RT-PCR擴增的pAMT基因插入Ti-質 粒載體pIG121-Hm的⑶S區域中(圖2)。該質粒被引入根癌土壤桿菌EHAlOl株并且用于 轉化智利辣椒。辣椒品種‘朝天椒’的種子表面用以下殺菌70%乙醇1分鐘，1次氯酸鈉15分 鐘，用無菌水漂洗3次，在MS培養基中播種。切取10天后發芽的子葉并且移植到含IOmg/ 1芐基腺嘌呤(BA)的MS培養基。在25°C下進行16小時晝長培養M小時，并且將該子葉 浸漬于在含50mg/l卡那霉素和50mg/l潮霉素的YEP培養基中培養M小時的土壤桿菌懸 浮液10分鐘。為除去殘余的土壤桿菌懸浮液，該葉子被置于消毒濾紙上，然后再一次移植 到含10mg/l芐基腺嘌呤(BA)的MS培養基。在暗處共培養3天后，將葉子移植到含IOmg/ 1BA，50mg/l卡那霉素和300mg/L羧芐西林的MS培養基(選擇培養基)，并且在25°C下進行
1216小時晝長培養。為抑制土壤桿菌的生長，該選擇培養基每10天-2周用新的培養基更換。 從選擇開始起1-2月再分化的幼苗被移植到含50mg/l卡那霉素和300mg/l羧芐西林的MS 培養基(生根培養基)來誘發生根。16株的生根植物被移植到土壤，并且在人工氣候室中 生長。從選擇的個體的葉子提取DNA，使用在載體中擴增NPTII基因的引物進行基因組PCR 分析。該PCR產物被用于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并且用溴化乙錠染色。結果，發現該選擇 的個體具有引入其中的NPTII基因(圖3)。實施例2:測量轉化的智利辣椒的辣椒素酯和辣椒素含量
在沒有引入基因的情況下從16株的轉化的智利辣椒和辣椒品種‘朝天椒’中采取果 實，通過常規方法測定辣椒素酯和辣椒素含量。結果，相比于對照辣椒品種‘朝天椒’，發現3 個轉化的智利辣椒果實(TG-3、8和14)含更大量的辣椒素酯。相比于其它株，TG-3和TG-8 具有更低的辣椒素含量(圖4(a)和4(b))。_仿丨丨3捕仆備禾丨嫩·鐘DAMT胃剛·㈱·汰分析
從具有較高的辣椒素酯含量的株的果實中提取RNA，并且進行內源性pAMT基因的轉錄 量的RT-PCR分析。結果，發現具有高辣椒素酯含量的株顯示出pAMT基因的抑制的轉錄和 表達。另一方面，在其中盡管已經引入該基因但辣椒素酯含量不高的株中，內源性PAMT基 因的轉錄和表達未被抑制(圖幻。由以上結果，已經發現通過抑制PAMT基因的表達，植物 可以被改變以人工地合成辣椒素酯。_仿丨丨4捕仆備禾丨嫩·鐘DAMT側斤
從CH-19 Hot分離的全長pAMT基因被插入大腸桿菌表達載體(pColdl載體，Takara Bio Inc.)的多克隆位點。所獲得的載體用 Chaperon Competent CellBL21 (Takara Bio Inc.)轉化并且在37°C下在含20mg/l氯霉素，50mg/l氨芐青霉素，10 μ 1/1四環素和Ig/ 1 L-阿糖的LB培養基(500ml)中振蕩培養10小時。當培養基顯示0. 6的0D600時，添加 ImM IPTG并在15°C下振蕩培養該混合物M小時。生長的大腸桿菌通過離心回收，并且使用QIAexpress Ni-NTA Fast Start Kit (QIAGEN)進行蛋白質提取和Histag提純。通過SDS-PAGE證實提純的蛋白質。將該蛋白質 注入兔以產生多克隆抗體。使用所產生的多克隆抗體，通過Img SDS-PAGE電泳從該果實中提取的該蛋白質并 且通過蛋白質印跡分析。結果，顯示辣椒素酯累積的TG-3和TG-8顯示出顯著降低的pAMT 蛋白質量。此外，在TG-14中，pAMT蛋白質量低于CH-19 Hot (圖6)。從上文中，已經表明生物合成類辣椒素的智利辣椒的pAMT基因的表達的抑制使 得能夠產生顯示出辣椒素酯類物質生物合成的數量增加的植物。產業實用性
根據本發明，從通常不能產生辣椒素酯類物質或能產生小量辣椒素酯類物質的植物能 夠大量產生辣椒素酯類物質。本發明是有用的，因為它可以大量且低成本地提供辣椒素酯 類物質，其被期望可適用于不同的領域，如藥物、健康食品等。本申請基于在日本申請的專利申請No. 2008-163884(申請日2008年6月23日)， 其內容全文包含在此。
權利要求
1.一種能產生辣椒素酯類物質的基因修飾植物，其相比于野生株來說顯示出催化從 香草醛到香草胺的氨基轉移反應的酶的降低的表達或活性。
2.根據權利要求1的植物，其中上述的酶是PAMT基因產物。
3.根據權利要求1或2的植物，其中上述的酶的降低的表達或活性是由以下引起的 該酶基因的破壞或突變，該基因的轉錄產物的分解或翻譯抑制，或該酶對香草醛的作用的 抑制。
4.根據權利要求1至3中任一項的植物，其中該野生株具有類辣椒素生物合成系統。
5.根據權利要求4的植物，其中該野生株是屬于辣椒屬的植物。
6.一種生產能產生辣椒素酯類物質的基因修飾植物的方法，包括進行基因修飾以降 低在具有類辣椒素生物合成系統的植物中催化從香草醛到香草胺的氨基轉移反應的酶的 表達或活性。
7.根據權利要求6的方法，其中該基因修飾選自編碼針對上述的酶基因的反義RNA、 iRNA、核酶或顯性-失活突變體的DNA的引入，通過敲除方法或誘變劑處理的基因破壞和編 碼對該酶的抗體的基因的引入。
8.根據權利要求6或7的方法，其中上述的酶是pAMT基因產物。
9.根據權利要求6至8中任一項的方法，其中具有類辣椒素生物合成系統的植物屬于 辣椒屬。
10.一種生產辣椒素酯類物質的方法，其包括從根據權利要求1至5中任一項的植物 的果實回收辣椒素酯類物質。
全文摘要
本發明提供了生物合成數量增加的辣椒素酯類物質的基因修飾植物，產生該基因修飾植物的方法和由該基因修飾植物的辣椒素酯類物質的生產方法。更具體地，本發明提供了能產生辣椒素酯類物質的基因修飾植物，其與野生株相比，顯示了催化從香草醛到香草胺的氨基轉移反應的酶的降低的表達或活性，和類似物。作為抑制酶的表達或活性的方法，可以提及編碼針對該靶基因的反義RNA、iRNA、核酶或顯性-失活突變體的DNA的引入，通過敲除方法或誘變劑處理的基因破壞，編碼對該酶的抗體的基因的引入等。
文檔編號C12P7/62GK102065680SQ20098012380
公開日2011年5月18日 申請日期2009年6月19日 優先權日2008年6月23日
發明者三輪哲也, 木坂廣明, 杉山立志, 郎亞琴 申請人:味之素株式會社