專利名稱：干燥轉谷氨酰胺酶組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及轉谷氨酰胺酶組合物，具體地講是凝血因子XIII的穩定的凍干或噴 霧干燥組合物，而且還涉及制備所述組合物的方法、復溶溶液、藥物組合物以及治療方法。
背景技術：
轉谷氨酰胺酶是Ca2+依賴性酶，該酶催化蛋白質中的谷氨酰胺側鏈Y -甲酰胺基 與賴氨酸側鏈ε-氨基之間形成異肽鍵。轉谷氨酰胺酶存在于細胞外和細胞內。轉谷氨酰 胺酶的實例包括因子XIII、表皮轉谷氨酰胺酶、II型轉谷氨酰胺酶(組織型轉谷氨酰胺酶、 肝轉谷氨酰胺酶)和I型轉谷氨酰胺酶(角質形成細胞轉谷氨酰胺酶)。凝血因子XIII (FXIII)是血漿轉谷氨酰胺酶，亦稱為“血纖維連接酶”和“血纖蛋 白穩定因子”，其在血漿中的循環濃度為20微克/ml。該蛋白質在血漿中以由兩個A亞基和 兩個B亞基組成的四聚體(A2B2)存在。每個亞基的分子量約為SOOOODa，整個蛋白質的分 子量約為330000Da。A亞基含有轉谷氨酰胺酶催化部位，而B亞基沒有催化活性，但是卻起 著結構蛋白的作用，保護A亞基不被清除。因子XIII的活化取決于凝血酶和Ca2+。凝血酶在A亞基Arg37的C端側切割，從 而釋放出活化肽(A亞基的殘基1-37)和B亞基，留下活性形式的A2 二聚體。活化的FXIII A2亞基(FXIIIa)是FXIII的催化活性形式。FXIII酶是凝血級聯中被激活的最后一個酶，其作用是使α -血纖蛋白鏈與γ-血 纖蛋白鏈交聯，形成對血纖蛋白溶解的抗性提高的更牢固的凝塊。此外，多種抗纖維蛋白溶 解、促止血和黏附蛋白交聯成凝塊，因此提供牢固的血纖蛋白結構，該結構對纖維蛋白溶酶 和其它蛋白水解酶溶解的機械阻力增強。在許多情況下，市售可得的純或部分純的轉谷氨酰胺酶或因子XIII制品含有添 加的穩定劑，例如人血清白蛋白(HSA)。蛋白質穩定劑的使用尚有疑問，因為當給予患者時， 其降低蛋白質比活，增加蛋白質負荷，并且可能干擾純度評價。還可能使蛋白質制品產生免 疫原性。蛋白質穩定劑的這些缺點使得它們特別不利于穩定非常純的蛋白質(例如重組蛋 白)。另外，當加入例如白蛋白時，蛋白質穩定劑的使用可能會造成被病毒抗原污染。自胎盤或血漿分離FXIII或者新鮮冰凍血漿形式的FXIII多年來一直被用來治療 因子XIII缺陷癥。然而，這些制劑受含有外源蛋白質的缺點以及與之相連的所有問題(例 如不利的免疫原性)所困。目前可采用重組DNA技術來制備轉谷氨酰胺酶和因子XIII。本文所使用的rFXIII 是指重組因子XIII。然而迄今為止，市場上尚無市售的rFXIII產品。用于治療的蛋白質制品中的組合物和活性必須在相對較長的時間內處于穩定。在 溶液中幾乎不能達到這種穩定性，因此，這類產品通常以干燥狀態銷售。適度的冷凍干燥 (凍干)是將這類產品干燥的精選方法之一。然而，即使當采用這種方法時，也難以得到滿 足完整性和持久性需要的穩定制品。例如，轉谷氨酰胺酶或因子XIII溶液的冷凍干燥可能導致活性明顯下降以及純 度損失。例如，冷凍干燥的因子XIII的另一個問題是由因子XIII的降解產物造成的，因子XIII的降解產物即所謂的非蛋白酶水解活化型(FXIIIa。)，亦稱為前激活因子XIII。一般 認為FXIIIa。會出現嚴重的毒性風險，注射FXIIIa。可能引起潛在的不良副作用。因此， 需要使轉谷氨酰胺酶或因子XIII制劑穩定以免形成非蛋白酶水解活化產物。本領域已知各種干燥FXIII組合物。下面公開的是凍干FXIII組合物的公開內 容的實例。W02002/36155披露了可以用ImM EDTA、IOmM甘氨酸、2%蔗糖的水溶液，或者用 20mM組氨酸、3% (重量/體積)蔗糖、2mM甘氨酸和0.01% (重量/體積)聚山梨醇酯(pH 8.0)來制備凍干FXIII組合物。US 6204036 (Aventis Behring)涉及穩定的凍干轉谷氨酰 胺酶制劑，所述制劑包含至少一種選自D-氨基酸和L-氨基酸及其鹽、衍生物、類似物和二 聚體、糖和糖醇、表面活性成分和還原劑的添加劑，前提條件是添加劑不是甘氨酸，也不是 精氨酸，其中所述制劑不含蛋白質穩定劑，且其中所述制劑在適用于胃腸外給藥的含水溶 劑中是溶解的，并無任何濁度。然而，上述這些制劑可能受上述高水平非蛋白酶水解活化的因子XIII的缺點所 困，一般認為這有礙于這些制劑的臨床和商業可行性。因此顯而易見的是，非常需要具有低 水平非蛋白酶水解活化產物的穩定的干燥轉谷氨酰胺酶和因子XIII制劑。而且，這類制劑 不需要添加蛋白質穩定劑，例如HSA。發明概述本發明基于出乎意料的發現，即就純度和前激活轉谷氨酰胺酶的形成而言，鹽 (例如一價鹽)對干燥轉谷氨酰胺酶(例如因子XIII)組合物具有明顯的穩定效應或作用。 這種效應是干燥狀態特有的，并且對于生產穩定的商品特別重要。在一個方面，本發明提供干燥轉谷氨酰胺酶組合物，所述組合物可通過將含水組 合物凍干或噴霧干燥而獲得，所述含水組合物包含轉谷氨酰胺酶、鹽和至少一種另外的選 自糖、氨基酸和緩沖液的組分，其中含水組合物中鹽的濃度范圍為5-100mM。在又一個方面，本發明提供制備所述干燥轉谷氨酰胺酶組合物、復溶溶液、藥物組 合物的方法以及治療方法。本發明的其它目的、特征和優勢從下面的發明詳述來看是顯而易見的。然而，應當 了解的是，發明詳述和具體實施例雖然提供本發明的優選實施方案，但只是通過實例給出， 因為從發明詳述來看，本發明的精神和范圍內的各種變動和修改對于本領域技術人員是顯 而易見的。附圖描述
圖1 蔗糖和NaCl水平的評價。25mM NaCl對保存于40°C的樣品的AIE-HPLC純 度的作用的Modde分析。圖2 =NaCl和組氨酸水平的全析因研究。25°C rFXIIIa。數據的Modde分析。圖3 =NaCl和組氨酸水平的全析因研究。AIE-HPLC純度數據的Modde分柝。定義本發明的術語“前激活”或“非蛋白酶水解活化”轉谷氨酰胺酶是指不是蛋白 酶水解激活的轉谷氨酰胺酶，例如當因子XIII在凝血酶(凝血酶具有蛋白水解切割 FXIII的能力)不存在時被激活，便被稱為非蛋白酶水解活化；有關參考文獻可參見例 如 Polgar J.等，Biochem J 1990;267:557-60。 Muszbek L.等，Thrombosis Research 94(1999)271-305。作為FXIII的降解產物的非蛋白酶水解活化因子XIII (FXIII。)不利于FXIII藥物組合物的效力(viability)，因為一般認為這種降解產物會出現嚴重的毒性 風險。本文使用的術語“生物活性”是指在生物中具有活性，例如醫學活性、農業活性或 美容活性。本發明的術語“含水組合物”是指包含液體水分的組合物。這類組合物通常是溶 液或懸浮液。用于本發明內容的術語“含水組合物”是指包含以重量計至少50% (重量/ 重量)的水的制劑。本發明的術語“稀釋劑”是指液體溶液或懸浮液。用于本發明內容的術語“稀釋劑” 是指包含以重量計至少50% (重量/重量)水的溶液或懸浮液。在本發明的情況下，稀釋 劑用于干燥轉谷氨酰胺酶組合物的復溶。所有參考文獻，包括本文引用的出版物、專利申請和專利都通過引用其整體特此 結合，其程度與每個參考文獻單獨而具體指明通過引用結合一樣，并以其整體列舉在本文 中(至法律允許的最大程度)。所有標題和副標題在本文中僅出于方便而使用，不應解釋為以任何方式限制本發 明。本文提供的任何和全部實例或示例性語言(諸如“例如”)的使用，僅僅是為了更 好地說明本發明，并非對本發明的范圍提出限制，除非另有要求。本說明書中的任何語言都 不應解釋為表示任何非要求保護的要素是實施本發明必需的。本文對專利文件的引用和結合只是出于方便，并不反映對這類專利文件的有效 性、專利性和/或可實施性有任何觀點。本發明包括適用法律所允許的隨附權利要求書中所述主題的所有修改和等同內容。發明詳述本發明提供轉谷氨酰胺酶組合物，具體地講是穩定的凍干或噴霧干燥的轉谷氨酰 胺酶(例如凝血因子XIII (FXIII))組合物。本發明還提供制備所述干燥轉谷氨酰胺酶組 合物、復溶溶液、藥物組合物的方法及治療方法。本發明提供包含轉谷氨酰胺酶(例如因子XIII)的產品，其具有在整個轉谷氨酰 胺酶產品的制備過程、貯存和使用期間均可接受的純度水平和前激活水平。就前激活水平和總純度而論，提供穩定性改進的本發明的組合物包含干燥轉谷氨 酰胺酶組合物，所述組合物可通過將包含轉谷氨酰胺酶、鹽和至少一種另外選自糖、氨基酸 和緩沖液的組分的含水組合物凍干或噴霧干燥而獲得，其中含水組合物中鹽的濃度范圍為 5-100mM。在一個實施方案中，本發明的干燥組合物包含干燥轉谷氨酰胺酶組合物，所述組 合物可通過將包含轉谷氨酰胺酶、鹽和至少一種另外選自糖、氨基酸和緩沖液的組分的含 水組合物凍干或噴霧干燥而獲得，其中含水組合物中鹽的濃度范圍為5-100mM，前提條件是 組合物不是通過將含有0. 5% NaCl和2. 25%甘氨酸的因子XIII溶液凍干而獲得的干燥因 子XIII組合物。在一個實施方案中，本發明的干燥組合物不含任何蛋白質穩定劑，例如白蛋白。下述實施方案和實施例主要描述和公開了重組FXIII (rFXIII)的組合物，但是本
5發明并不限于這些實施方案和實施例，而是可適用于目前已知的或未來開發的任何轉谷氨 酰胺酶的組合物。組合物的組分本發明的組合物包含轉谷氨酰胺酶。可通過本發明的制劑穩定的轉谷氨酰胺酶的 實例包括但不限于因子XIII、表皮轉谷氨酰胺酶、II型轉谷氨酰胺酶(組織型轉谷氨酰胺 酶、肝轉谷氨酰胺酶)和I型轉谷氨酰胺酶(角質形成細胞轉谷氨酰胺酶)。因子 XIII在一個實施方案中，待凍干或噴霧干燥的含水組合物包含因子XIII化合物。因子 XIII化合物可以是例如天然野生型因子XIII和因子XIII的天然等位變異體。這些FXIII 化合物可以來源于例如人或其它動物源，例如人FXIII、豬FXIII和牛FXIII。人因子XIII 的野生型序列可參見例如EP沈8772和EP 236978。本發明的因子XIII化合物，包括完整 的因子XIII酶原四聚體(A2B2)和因子XIIIa及其亞基，包括A亞基和A2 二聚體。本發明的因子XIII化合物可以是例如保持至少部分野生型因子XIII特有的交聯 活性的因子XIII的生物活性片段、衍生物或變體。這種交聯活性可通過本領域已知方法測 定。在一些實施方案中，因子XIII的生物活性片段、衍生物或變體保持lO^JO^i、 30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^ 100%的野生型因子 XIII 的交聯活性。因子XIII的片段、衍生物和變體包括取代、插入和缺失變體。插入變體包含氨基 端和/或羧基端融合以及單個或多個氨基酸殘基的序列內插入。例如，可將插入殘基引入 野生型因子XIII蛋白的成熟編碼序列內。缺失變體的特征在于從野生型因子XIII蛋白除 去一個或多個氨基酸殘基。一般在編碼蛋白質的DNA的核苷酸中通過位點專一誘變來制備 這些變體，從而產生編碼變體的DNA，之后在重組細胞培養物中表達所述DNA。然而，還可以 通過體外合成制備變體蛋白質片段。雖然引入氨基酸序列變異的位點通常是預先確定的， 但是突變本身不是預先確定的。例如，為了使在指定位點的突變性能最優化，可以在目標密 碼子或目標區進行隨機誘變，并篩選表達蛋白質變體所需活性的最優組合。在具有已知序 列的DNA的預定位點上進行取代突變的技術是眾所周知的，例如M13引物誘變。取代變體是 其中除去至少一個殘基序列并在其位置上插入不同殘基的變體。氨基酸取代通常為單一殘 基的取代；插入一般約為1-10個氨基酸殘基；缺失的范圍可約為1-30個殘基。例如，缺失 或插入可以相鄰的一對進行，即2個殘基的缺失或2個殘基的插入。可以結合取代、缺失、 插入或其任何組合以得到最終的構建體。顯然，將在編碼變體蛋白質的DNA中產生的突變 不必把該序列置于讀框外，且優選將不會產生可形成二級mRNA結構的互補區。經遺傳工程 改造的因子XIII的變體的一個實例是野生型人因子XIII的Val34Leu變體(即其中野生 型人因子XIII氨基酸序列第34位的Val殘基被亮氨酸殘基置換的變體)。本發明的因子XIII可從多種生物材料中提純，包括天然產生因子XIII的細胞的 裂解物、勻漿物或提取物，而且還包括通過遺傳工程修飾以產生因子XIII的細胞，例如用 因子XIII編碼DNA轉化的酵母細胞。提純因子XIII的方法的實例可參見W0/2006/021584。本發明的因子XIII可以通過例如重組DNA技術來制備。制備重組因子XIII的 方法是本領域已知的。參見例如Davie等，EP 268, 772 ；Grundmann等，AU-A-69896/87 ； Bishop 等,Biochemistry 1990,29 :1861-1869 ；Board 等,Thromb.Haemost. 1990,63 235-240 Jagadeeswaran 等，Gene 1990,86 :279-283 ；以及 Broker 等，FEBS Lett. 1989， 248 :105-110o在一個實施方案中，因子XIII A2 二聚體在酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的細胞質中制備，參見美國專利申請順序號07/74U63。收獲細胞后裂解，制 備澄清的裂解液。在中性到略微堿性的PH下，使用衍生化瓊脂糖柱，例如DEAE Fast-Flow Sepharose (Pharmacia)等，通過陰離子交換層析法對裂解液進行分級分離。然后將洗脫 液濃縮，并通過例如用琥珀酸銨緩沖液滲濾調節PH至5. 2-5. 5，從而使因子XIII從柱洗脫 液中沉淀出。然后將沉淀物溶解，并采用常用層析技術(例如凝膠過濾和疏水相互作用層 析法)進一步純化。在本發明的一個實施方案中，因子XIII是重組因子XIII。在本發明的一個實施 方案中，因子XIII是人因子XIII。在本發明的一個實施方案中，因子XIII是重組人因子 XIII。在本發明的一個實施方案中，因子XIII是A亞基的二聚體。在待凍干或噴霧干燥的含水組合物中，因子XIII的濃度可在例如一個大的范 圍內變化，在一個實施方案中范圍為0. 003-100mg/ml，在進一步的實施方案中范圍為 l-30mg/ml，在更進一步的實施方案中范圍為2-15mg/ml。鹽本發明的含水組合物包含鹽或鹽的混合物。鹽用來改進干燥組合物在前激活以及 總純度方面的穩定性。本發明的稀釋劑可包含例如鹽或鹽的混合物。在一些實施方案中，鹽 為一價鹽。例如，可以使用的一價鹽的實例包括但不限于氯化鈉、氯化鉀、乙酸鈉、硫酸鈉、 葡糖酸鈉及其混合物。在一些實施方案中，鹽為二價鹽。在一些實施方案中，鹽為二價鹽， 前提條件是二價鹽不是Ca(II)鹽。例如，所采用的鹽(例如NaCl)的濃度可在一定范圍內變化，在一個實施方案 中，范圍為5-100mM，在進一步的實施方案中，范圍為5-99mM、7-95mM、8-90mM、10-80mM、 15-70mM、25-75mM和20_60mM，在更進一步的實施方案中，范圍為25_50mM。糖和糖醇在本發明的一些實施方案中，待凍干或噴霧干燥的含水組合物包含一種或多種糖 或糖醇。例如，用于干燥組合物復溶的稀釋劑可包含一種或多種糖或糖醇。在本發明的干 燥組合物中，糖或糖醇可用于在冷凍干燥期間通過防止物理/化學失穩效應(例如解折疊) 而使蛋白質穩定。例如，可以使用的糖或糖醇的實例包括但不限于蔗糖、甘露糖、海藻糖、乳 糖、麥牙糖、山梨醇、棉子糖、糊精、環糊精及其衍生物、類似物和混合物。所使用的糖和糖醇的濃度范圍可在例如大的范圍變化，在一個實施方案中的范圍 為0. 1-15% (重量/重量)，在進一步的實施方案中的范圍為0. 1-8. 5% (重量/重量)， 在更進一步的實施方案中的范圍為0. 5-5. 0% (重量/重量)。氨基酸在本發明的一些實施方案中，待凍干或噴霧干燥的含水組合物包含一種或多種氨 基酸。在本發明的一些實施方案中，用于干燥組合物復溶的稀釋劑可包含一種或多種氨基 酸。例如，可以使用氨基酸以改進凍干或噴霧干燥組合物的穩定性。在一個實施方案中，使 用一種或多種氨基酸來降低組合物貯存期間轉谷氨酰胺酶(例如FXIII)聚集體的形成。可 以使用的氨基酸的實例包括但不限于甘氨酸、組氨酸、精氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、 賴氨酸、丙氨酸、異亮氨酸和半胱氨酸(Gly、HiS、Arg、Glu、Met、Thr、LyS、Ala、Ile和Cys)及其鹽、衍生物、類似物、二聚體、寡聚體和混合物。合適的衍生物和類似物是眾所周知的。合適的衍生物包括但不限于羧基的酯、 硫酯和酰胺；氨基的酰化衍生物，包括氨基甲酸酯衍生物；及側鏈官能團的酯、酰胺和酯。 合適的類似物包括例如鳥氨酸(賴氨酸的類似物)、高絲氨酸和α-氨基丁酸。生理上可 接受的鹽也是本領域眾所周知的，可參見例如Remington’ s Pharmaceutical Science Drug Receptors and Receptor Theory,(第十八版.)，Mack Publishing Co. , Easton Pa. (1990)。使用的氨基酸的濃度可在例如0.01-10% (重量/重量)的范圍或在0. 1-3% (重 量/重量)的范圍變化。緩沖液在本發明的一些實施方案中，待凍干或噴霧干燥的含水組合物和/或用于干燥組 合物復溶的稀釋劑包含緩沖液。緩沖液是包含某一物質的溶液，當向該溶液中加入少量酸 或堿時，所述物質能夠防止溶液的PH發生明顯變化，從而在很大程度上保持溶液的原酸度 或堿度。緩沖液通常包含弱酸或弱堿及其鹽。含水組合物的pH的范圍可為2-10，特別介于7和8之間。上述氨基酸或pH范圍 為2-10的緩沖液可用來促進緩沖效果。例如可以使用的緩沖液的實例包括但不限于乙酸 鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、甘氨酰甘氨酸緩沖液、組氨酸緩沖液、甘氨酸緩 沖液、賴氨酸緩沖液、精氨酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液(含有例如磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉或 磷酸三鈉)、TRIS [三(羥甲基)氨基甲烷]緩沖液、N-二(羥乙基)甘氨酸緩沖液、N-三 (羥甲基)甲基甘氨酸緩沖液、蘋果酸鹽緩沖液、琥珀酸鹽緩沖液、馬來酸鹽緩沖液、富馬酸 鹽緩沖液、酒石酸鹽緩沖液、天冬氨酸鹽緩沖液及其混合物。在一些實施方案中，使用檸檬 酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液、磷酸鈉緩沖液、琥珀酸鹽緩沖液和TRIS緩沖液。在一個實施方 案中，使用組氨酸。所使用的緩沖液的濃度可為例如0_50mM的范圍，或0_25mM的范圍。其它組分還可將一種或多種其它組分摻入待凍干或噴霧干燥的含水組合物和/或用于 復溶干燥組合物的稀釋劑中。這類另外的成分包括但不限于非離子型表面活性劑、還原 劑、螯合劑、抗氧化劑、防腐劑、潤濕劑、乳化劑、填充劑、張力調節劑(tonicity modifier/ tonicity-adjusting agents)、油性溶媒、蛋白質(例如人血清白蛋白、明膠或其它蛋白 質)和兩性離子物質(例如甜菜堿、牛磺酸或氨基酸例如精氨酸、甘氨酸、賴氨酸或組氨 酸)。當然，這類另外的成分不應對本發明的含水組合物或干燥組合物的總體穩定性產生 不利景i響。在這方面，可參照 Remington :The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版，1995。非離子型表g活+ 牛齊Il在本發明的一些實施方案中，待凍干或噴霧干燥的含水組合物和/或用于復溶干 燥組合物的稀釋劑包含非離子型表面活性劑。離子型表面活性劑是通過屏蔽蛋白質的臨界 面(例如包裹、固體(solids))而起作用的表面活性劑，可以使用離子型表面活性劑例如改 進凍干或噴霧干燥組合物的穩定性。例如，可以使用的非離子型表面活性劑的實例包括但 不限于吐溫80、吐溫20、PEG、鯨蠟醇、PVP、PVA、羊毛脂醇、失水山梨醇單油酸酯、泊洛沙姆和聚氧乙烯烷基醚。在一個實施方案中，使用吐溫20。例如，所使用的非離子型表面活性劑的濃度可為0.00001-5% (重量/重量)的范 圍，或0.0002%和0. (重量/重量)的范圍。還原布丨在本發明的一些實施方案中，待凍干或噴霧干燥的含水組合物和/或用于復溶干 燥組合物的稀釋劑包含還原劑。使用還原劑(例如抗氧化劑)以除去可破壞蛋白質穩定的 自由基。可以使用的還原劑的實例包括但不限于半胱氨酸、N-乙酰基-半胱氨酸、硫代甘 油、硫化鈉、生育酚和谷胱甘肽。螯合劑在本發明的一些實施方案中，待凍干或噴霧干燥的含水組合物和/或用于復溶干 燥組合物的稀釋劑包含螯合劑。螯合劑用于除去制劑中的金屬(鐵、銅)，并且通常有助于 保護蛋白質免受金屬催化的反應。例如，可以使用的螯合劑的實例包括但不限于EDTA的 鹽、檸檬酸和天冬氨酸及其混合物。在本發明的一個實施方案中，螯合劑的濃度為0. lmg/ml 到5mg/ml。在本發明的一個實施方案中，螯合劑的濃度為0. lmg/ml到ang/ml。在本發明 進一步的實施方案中，螯合劑的濃度為ang/ml到5mg/ml。抗氧化劑在本發明的一些實施方案中，待凍干或噴霧干燥的含水組合物和/或用于復溶干 燥組合物的稀釋劑包含抗氧化劑。在一個實施方案中，含水組合物包含甲硫氨酸(或另一 種含硫氨基酸或氨基酸類似物)，當轉谷氨酰胺酶(例如FXIII)是包含至少一個易于氧化 成其亞砜形式的甲硫氨酸殘基的多肽時，抑制甲硫氨酸殘基的這類氧化。術語“抑制氧化” 是指氧化類物質(甲硫氨酸)隨時間的積累最小化。甲硫氨酸氧化的抑制導致多肽更多地 保持其適當的分子形式。例如，可以使用甲硫氨酸的任何立體異構體(L、D或DL異構體) 或其組合。待添加的量應為足以抑制甲硫氨酸殘基氧化的量，使得甲硫氨酸的亞砜形式的 量是管理機構可接受的。這通常意味著組合物含有約10% -約30%以內的甲硫氨酸亞砜 形式。這一般可通過例如按致使加入的甲硫氨酸與甲硫氨酸殘基的摩爾比為約1 ι-約 1000 1、例如10 1-約100 1的范圍的量加入甲硫氨酸來實現。防腐劑在本發明的一些實施方案中，待凍干或噴霧干燥的含水組合物和/或用于復溶干 燥組合物的稀釋劑包含防腐劑。可按管理機構對多劑量容器內容物的要求加入防腐劑。防 腐劑被用作抗微生物劑，以免在從小瓶中抽取多劑量時受微生物污染。例如，可使用的防腐 劑的實例包括但不限于苯酚、鄰甲酚、間甲酚、對甲酚、氯甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基 苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、2-苯氧乙醇、2-苯基乙醇、苯甲醇、三 氯叔丁醇、硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪唑烷脲、氯己定(chlorohexidine)、脫氫醋酸鈉、 芐索氯銨、氯苯甘醚(3-對氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)及其混合物。例如，防腐劑的濃度為 0. lmg/ml到20mg/ml。在本發明的一個實施方案中，防腐劑的濃度為0. lmg/ml到5mg/ml。 在本發明進一步的實施方案中，防腐劑的濃度為5mg/ml到10mg/ml。在本發明另一個實施 方案中，防腐劑的濃度為10mg/ml到20mg/ml。本領域的技術人員能夠使用下述方法，僅用常規實驗方法便能分析本發明的干燥 組合物或含水組合物中一種或多種添加組分對穩定性、前激活和純度的作用。
干燥組合物-粉末在凍干或噴霧干燥后，本發明的組合物為干燥形式。例如，本發明的干燥組合物可 以為固體、粉末或粒狀物。在一個實施方案中，本發明的干燥組合物為粉末。在貯存期間，該 干燥組合物中殘留水分的水平對干燥轉谷氨酰胺酶(例如FXIII)的穩定性十分重要。在 本發明的一個實施方案中，干燥組合物含有3%以下的殘留水分。在進一步的實施方案中， 干燥組合物含有以下的殘留水分。干燥技術和復溶本發明的含水組合物的凍干和噴霧干燥可以采用本領域技術人員熟知的凍干和 噴霧干燥方法進行有關凍干法參見例如Williams和Polli (1984)，J. Parenteral Sci. Technol. 38 :48_59。有關噴霧干燥法參見例如Masters，載于 Spray-Drying Handbook (第 5 版；Longman Scientific and Technical,Essex,U. K. , 1991),第 491-676 頁；Broadhead等 (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18 :1169-1206 ；以及 Mumenthaler 等(1994) Pharm. Res. 11 12-20。還可采用其它干燥技術，例如風干,參見Carpenter和Crowe (1988)，Cryobiology 25 :459-470 ；以及 Roser (1991) Biopharm. 4 :47_53。至于本發明，當提及凍干和噴霧干燥時，還包括可以采用的其它干燥技術。例如， 本發明的表述“待凍干或噴霧干燥的含水組合物”也包括“待用其它干燥技術干燥的含水組 合物”。在一個實施方案中，本發明的干燥組合物通過凍干獲得。凍干方法通常包括下列 步驟冷凍步驟、初步干燥步驟和再次干燥步驟。在冷凍步驟中，使含水組合物冷卻。選擇 這類冷凍步驟的溫度和持續時間，使得組合物中的所有組分完全凍結。例如，合適的冷凍溫 度約為-40°C。在初步干燥步驟中，在低溫下真空升華除去冷凍期間結的冰。例如，用于升 華的內腔壓力可為例如約40mTorr-400mTorr，溫度可為例如_30°C至_5°C之間。在初步干 燥后，未能通過升華除去的任何殘留量的液體都通過再次干燥(即解吸)除去。在再次干 燥期間，溫度接近或大于環境溫度。在本發明的一個實施方案中，在凍干期間的冷凍步驟中引入退火處理 (annealing)(加熱步驟)。這種加熱使得溫度在制劑的冷凍點以下。這種退火(加熱步 驟)可進一步使本發明的干燥組合物穩定。復溶在需要時，例如當給予患者轉谷氨酰胺酶(例如FXIII)時，本發明的干燥組合物 可用稀釋劑復溶。復溶一般在25°C左右的溫度下進行，以確保完全水合，但是需要時可采用 其它溫度。復溶所需時間將取決于例如稀釋劑的類型以及轉谷氨酰胺酶和其它組分的量。在本發明的一個實施方案中，稀釋劑是蒸餾水。例如，使用蒸餾水可具有優勢，因 為不需要制備單獨定制的稀釋劑。在本發明的一個實施方案中，稀釋劑是乙醇。在本發明的一個實施方案中，稀釋劑例如可包含一種或多種組分，例如鹽、糖、氨 基酸、緩沖液、非離子型表面活性劑、還原劑、螯合劑、抗氧化劑、防腐劑、潤濕劑、乳化劑、填 充劑、張力調節劑、油性溶媒、蛋白質(例如人血清白蛋白、明膠或其它蛋白質)和兩性離子 物質。稀釋劑包括的組分和這些組分的量取決于通過這些組分要達到的理想效果。稀釋劑 的實例包括但不限于注射用抑菌水(BWFI)、pH緩沖溶液(例如磷酸緩沖鹽溶液)、無菌鹽溶液和葡萄糖溶液。復溶溶液中蛋白質濃度為至少5mg/ml，例如約10mg/ml-約400mg/ml、約20mg/ ml-約200mg/ml或約30mg/ml_約150mg/ml。如果從皮下遞送復溶溶液，則復溶溶液中的 高蛋白質濃度被視為是特別有益的。然而，對于其它給藥途徑，例如靜脈內給藥，在復溶溶 液中可能需要較低的蛋白質濃度(例如復溶溶液中的蛋白質約5-50mg/ml或約10_40mg/ ml)。在某些實施方案中，復溶溶液中的蛋白質濃度比預干燥制劑中的顯著較高。例如，復 溶溶液中的蛋白質濃度可以是預干燥含水組合物的約2-40倍、3-10倍和/或3-6倍(例如 至少3倍或至少4倍)。在本發明的一個實施方案中，例如包含因子XIII的干燥轉谷氨酰胺酶組合物貯 存3年以上是穩定的，且復溶溶液使用6周以上是穩定的。在本發明的一個實施方案中，例 如包含因子XIII的干燥轉谷氨酰胺酶組合物貯存2年以上是穩定的，且復溶溶液使用4周 以上是穩定的。在本發明的一個實施方案中，例如包含因子XIII的干燥轉谷氨酰胺酶組合 物貯存1年以上是穩定的，且復溶溶液使用2周以上是穩定的。在本發明的一個實施方案 中，不超過的復溶因子XIII組合物是非蛋白酶水解活化因子XIII。在本發明的一個實 施方案中，不超過0.5%的復溶因子XIII組合物是非蛋白酶水解活化因子XIII。示例件變化方案表1和表2是本發明的示例性變化的非限制性表。表1 示例性變化的非限制性列表
1權利要求
1.一種干燥轉谷氨酰胺酶組合物，所述組合物可通過將含水組合物凍干或噴霧干燥獲 得，所述含水組合物包含轉谷氨酰胺酶、鹽和至少一種選自糖、氨基酸和緩沖液的另外的組 分，其中含水組合物中的鹽濃度為5-100mM。
2.權利要求1的組合物，其中因子XIII化合物是人因子XIII。
3.權利要求1或2的組合物，其中所述鹽是一價鹽。
4.權利要求3的組合物，其中所述一價鹽是氯化鈉鹽。
5.權利要求1-4中任一項的組合物，其中含水組合物中所述鹽的濃度為10-75mM。
6.權利要求1-5中任一項的組合物，其中所述組合物為粉末形式。
7.一種制備權利要求1-6中任一項的干燥組合物的方法，所述方法包括將包含轉谷氨 酰胺酶、鹽和至少一種選自糖、氨基酸和緩沖液的另外的組分的含水組合物干燥，其中含水 組合物中的鹽濃度為5-1 OOmM。
8.權利要求7的方法，其中所述方法用于生產因子XIII組合物，所述組合物在復溶后 包含不超過的非蛋白酶水解活化的因子XIII。
9.包含轉谷氨酰胺酶的復溶溶液，其中所述溶液通過將權利要求1-6項中任一項的干 燥組合物用稀釋劑復溶制得。
10.權利要求9的溶液，其中不超過的所述因子XIII化合物是非蛋白酶水解活化 的因子XIII。
11.一種藥物組合物，其包含權利要求10-11中任一項的溶液或權利要求1-6中任一項 的干燥組合物。
12.—種以干燥形式貯存使轉谷氨酰胺酶組合物穩定的方法，使得非蛋白酶水解活化 的轉谷氨酰胺酶的水平占在復溶后立即測得的轉谷氨酰胺酶總含量的1 %以下，其中所述 穩定效果的實現在于將包含轉谷氨酰胺酶、鹽和至少一種選自糖、氨基酸和緩沖液的另外 的組分的含水組合物干燥，其中含水組合物中的鹽濃度為5-100mM。
13.權利要求12的方法，其中所述轉谷氨酰胺酶組合物是一種因子XIII組合物。
全文摘要
本發明涉及干燥轉谷氨酰胺酶組合物，所述組合物可通過將包含轉谷氨酰胺酶、鹽和至少一種另外的選自糖、氨基酸和緩沖液的組分的含水組合物凍干或噴霧干燥而獲得，其中含水組合物中鹽的濃度范圍為5-100mM。在進一步的方面，本發明涉及制備所述干燥轉谷氨酰胺酶組合物的方法、復溶溶液、藥物組合物以及治療方法。
文檔編號C12N9/10GK102065844SQ200980124151
公開日2011年5月18日 申請日期2009年4月20日 優先權日2008年4月21日
發明者G·K·克里斯琴森, M·布拉德, T·法爾克 申請人:諾沃-諾迪斯克保健股份有限公司