專利名稱：用于在富含二氧化碳的空氣供應下在液體培養基中生產胸膜炎肺炎放線桿菌毒素apxi或 ...的制作方法
用于在富含二氧化碳的空氣供應下在液體培養基中生產胸膜炎肺炎放線桿菌毒素APXI或APCI I I的過程本發明涉及通過在液體培養基中培養胸膜炎肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)生產 RTX-毒素 ApxI 或 ApxIII 的方法。豬胸膜肺炎，豬中的主要呼吸性疾病，在全世界傳播，并且由于過急性死亡、急性病豬的治療和慢性感染動物銷售中的延遲，引起養豬業的重大經濟損失。病原體是胸膜炎肺炎放線桿菌。它主要通過動物間的直接接觸傳染，并且所得到的感染產生從過急性到慢性不等的臨床過程。該疾病主要是呼吸道感染，具有高熱、嚴重呼吸性窘迫、咳嗽和厭食的臨床體征。該疾病的發作是快速的，并且發病率和死亡率很高。控制胸膜炎肺炎放線桿菌 (從現在開始也稱為“APP”)感染的方法之一是通過疫苗接種程序。菌苗在過去已用于此類程序中，但因其嚴重副作用而眾所周知。現今基于APP毒素的亞單位疫苗是常用的。APP產生所謂的RTX-毒素(RTX代表重復子毒素(r印eat-in-toxin))。正是這些 RTX-毒素的存在高度促成這種細菌的致病性特征。RTX-毒素已在過去得到廣泛綜述，并且在文獻中得到描述。如通常已知的，并非所有APP血清型都產生所有RTX-毒素。例如，血清型1、5、9和11產生ApxI和ΑρχΙΙ。血清型2、3、4、6和8產生ApxII和ApxIII。血清型 10僅產生ApxI，并且血清型7和12僅產生ApxII。針對APP的目前商購可得疫苗基于毒素 ApxI、ApxII和ApxIII。最近以來已發現所有APP血清型都產生第4種RTX毒素，目前稱為 ApxIV (參見 EP 0 875 574)。目前已知如何通過在液體培養基中培養胸膜炎肺炎放線桿菌來生產RTX-毒素 ApxI或ΑρχΙΙΙ。特別地，EP 0 453 OM已描述了生產ApxI的方法(參見“Example 2”， 1 2 "Purification andcharacterisation of hemolysin",子·( 胃“Methods，，)禾口 ΑρχΙΙΙ (參見“實施例4，，,段落2“Purification and characterisationof App macrophage toxin (Mat)”，子段落“Methods”)。應當指出ApxI習慣被稱為“HLY”，而ΑρχΙΙΙ通常被稱為 “Mat”(參見 Frey 等人在〃 J Gen Microbiol. 1993 Aug; 139 (8) :1723-8"中)。培養基必須支持APP細菌的生長。通常已知如何構成支持細菌生長的培養基。標準培養基最初由fegle，Ham及其他人在20世紀50年代和60年代開發。他們發現滿足生長的基本需要的培養基應包括無機鹽、氮源(例如以含氮化合物的形式，例如肽或蛋白質)、碳源和維生素。培養基有利地進行緩沖以阻止其變得太酸或太堿。在這個基本配方內，許多不同構成是可獲得的。例如，可以選擇動物衍生的組分以提供氨基酸，但也可以選擇化學成分限定的氨基酸。對于其他化合物，眾多變化也是可能的。事實上，構成支持細菌生長的培養基是相對簡單的。然而，生長和/或代謝產物生產的最佳化可以花費一定的開發時間， 特別是當不含血清或其他動物衍生的組分的培養基是優選的時。然而，用于改善發酵培養基性能的策略是本領域通常已知的，并且在文獻中得到充分描述(參見例如由Kennedy 禾口 Krouse 在 Journal ofIndustrial Microbiology & Biotechnology (1999)23，456-475 中的綜述文章)。此類最佳化構成發酵實驗室內的常規實驗部分。在APP培養的情況下， NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)固有地構成培養基的部分，因為APP是NAD依賴性的。如果沒有NAD，那么培養基將不支持胸膜炎肺炎放線桿菌細菌生長，并且因此不能被視為在
3本申請和附加權利要求含義中用于支持APP生長的液體培養基。用于支持細菌生長的液體培養基，或構成此類培養基的組分，可從各個公司商購得到，例如Sigma Aldrich、Quest International、OxoicU Becton Dickinson、Pharmacia、VGD Inc、Mediatech、Invitrogen、 Marcor> IrvinScientific 等。盡管現有技術提供了通過培養APP生產RTX-毒素ApxI和ApxIII的方法，但需要改善生產得率。迄今為止，改善生產得率的嘗試主要針對APP培養靜止期中的毒素生產率， 因為已知最大限度RTX-毒素生產在高細胞密度時發生，因此在指數生長期結束時發生(參見例如Microbial Pathogenesis 37 Q004)四_3；3)。這些嘗試未導致總體生產得率的顯著改善。然而，令人驚訝的是，申請人發現當空氣在胸膜炎肺炎放線桿菌的所述RTX-毒素的生產期過程中(因此在APP細菌的生長和/或靜止期過程中)經過培養基時，其中所述空氣具有超過正常大氣水平的二氧化碳含量，RTX-毒素生產得到顯著增加。事實上，一般已知在平板上在細菌菌落培養過程中使用增加的二氧化碳水平(參見例如US 6，019，984:實施例〃 Bacterial Strains and GrowthConditions〃)。然而，這涉及細菌菌落的培養，所述細菌隨后用于接種發酵罐。在這個階段時，僅發生細菌其自身的生長，不發生RTX毒素的生產(至少不以顯著水平)。一旦將APP細菌置于液體培養基中以朝向適合于RTX毒素生產的高細胞密度生長，現有技術就教導免除增加的二氧化碳水平。這當然與上文提及的現有技術教導一致在發酵罐中的最大限度Apx生產僅在高細胞密度下發生，因此在指數生長期結束時發生。在這個階段時，細胞生長已結束并且完全不再變動(Plays no roll)，并且因此二氧化碳先前被視為不是重要的。此外，APP細菌其自身在形成RTX-毒素時生產二氧化碳。因此，有目的的將二氧化碳加入培養基中被認為甚至抑制毒素生產。這些事實解釋了為何二氧化碳從未被認為是關于RTX-毒素生產得率的刺激因子。然而，為何二氧化碳的確刺激ApxI和ApxIII生產的原因仍不明了，特別是因為二氧化碳似乎對RTX-毒素ApxII 的生產水平沒有正面作用。應當指出存在使得空氣能夠經過培養基的許多技術。常用概念是經由使空氣以氣泡的形式在某處漏出到培養基內(即在培養基表面下)的裝置使空氣通過。此類裝置可能具有一個單噴嘴或多個噴嘴，依賴于是否希望建立培養基中的(近)平衡狀態，并且如果希望，那么這個平衡應多快確定。在任何情況下，使空氣經過培養基與使用空氣的頂部空間且僅僅主要依賴于擴散形成對比。已發現此類技術提供不充足的結果。在本發明背景下的 “空氣”意指包含通常存在于大氣空氣中的一種或多種氣態組分的氣態介質，所述氣態組分例如氧、氮、二氧化碳、氦、氖、氬、氙、氡等。“關于二氧化碳的正常大氣水平”是空氣總體積的 0，04% 體積 CO2，，。在一個實施方案中，空氣在胸膜炎肺炎放線桿菌細菌的指數生長期過程中通過。 與現有技術中已描述的形成對比，指數生長期看起來是RTX-毒素總體生產期的部分的時期(緊接靜止期)。令人驚訝的是，申請人發現在指數生長期過程中使二氧化碳通過提供非常顯著刺激的RTX-毒素生產，從而使得即使在這個時期結束時，發酵罐中也存在經濟上相關量的毒素。因此，這個實施方案提供了在指數生長期結束時或在靜止期早期結束發酵的選項。重要優點是它可以節省大量生產時間以及可以減少最終產物中的脂多糖量。在另一個實施方案中，其中培養基進行緩沖(即加入當酸或堿加入溶液中時使溶液酸度中的改變降到最低的物質)，通過使用碳酸氫鹽進行緩沖(即含有HCO3-離子的鹽)。通過使用碳酸氫鹽緩沖液，看起來可以非常有效地抵消過量二氧化碳的固有PH降低效應。 很明顯，使用此類緩沖液，例如碳酸氫鈉或另一種堿金屬碳酸氫鹽緩沖液，將幾乎立即達到培養基中的(近)平衡狀態。在另外一個實施方案中，經由恒流使空氣經過培養基。事實上，可以設計使氣體經過培養基的許多不同方法。具有極高二氧化碳含量(高達例如90%)的脈動流是其中之一。然而，我們發現用恒流可以獲得非常良好的結果。用此類恒流，可以在空氣中使用中等二氧化碳水平。這提供了緩沖液將能夠更好地在任何時候使PH維持在平衡值周圍的有利作用。應當指出恒流不一定意指總體二氧化碳添加在時間中的某些點時不中斷。例如，在培養過程中流的短暫中斷不排除在中斷前和后，流是恒定的。在一個實施方案中，空氣在胸膜炎肺炎放線桿菌細菌的指數生長期過程中連續通過，即在指數生長期過程中，流不中斷。在一個實施方案中，二氧化碳含量可高達10% ν/ν。在這個實施方案中，空氣中二氧化碳的最大限度體積含量是10%。超過這個水平，可能緩沖液將不能以高速度在所有時間提供平衡。這可能負面影響RTX-毒素生產得率。在一個優選實施方案中，二氧化碳含量是5% ν/ν。用這個二氧化碳含量已達到良好結果，并且從經濟觀點來看，這是二氧化碳優選量，因為此類混合物以極低價格商購可得。在其中RTX-毒素是ApxI的一個實施方案中，培養基含有硼葡萄糖酸鈣。事實上， 通常已知ApxI操縱子的轉錄活性通過將鈣加入生長培養基中得到增強(參見=Microbiol Pathogenesis 37(2004)29-33)。當使用硼葡萄糖酸(2，3-二羥基 _3-[2_ 羥基 _5_(羥甲基)-1，3，2_二氧硼戊烷(di0Xab0r0lan)-4-基]丙酸)絡合鈣離子時，已發現幾個優點。首先，看起來可以預防或至少顯著減少在下游加工中一般遇到的鈣鹽沉淀問題，特別是趨于變得淤塞的濾器。其次，看起來當與使用其他絡合劑例如EDTA的現有技術方法比較時，可以以顯著增加的水平生產ΑρχΙ。很明顯，通過使用這種特定絡合劑，從而使得培養基含有絡合硼葡萄糖酸鈣(即，2，3- 二羥基-3-[2-羥基-5-(羥甲基)-1，3，2- 二氧硼戊烷_4_基] 丙酸鈣)也稱為D-葡萄糖酸，具有硼酸的環狀4，5-酯，鈣鹽2 1)，可以預防鈣離子與其他陰離子的大量沉淀，與此同時鈣離子仍可用于增強胸膜炎肺炎放線桿菌的ApxI操縱子的轉錄活性。盡管不是本發明所需的，但培養基可以不含動物衍生的組分。許多現有技術方法的缺點是它們依賴于含有動物衍生組分的培養基例如Columbia肉湯的使用。現有技術中提及的其他動物衍生的組分是例如Columbia Broth Modified或Brain Heart hfusion肉湯。如通常已知的，動物組分的使用具有某些嚴重缺陷。首先，化學組成在生產批次之間可以相當大地不同。此外，動物起源的補充劑可能被傳染物質污染。主要擔心是在人或動物中引起TSE的朊病毒的存在。可以僅僅選擇不含動物組分的培養基(通常被稱為“ACF”培養基)。以這個含義的“動物組分”意指像這樣存在于動物中(例如，血液或蛋白質)或衍生自此類組分的任何組分(例如衍生自血液的經修飾的血清，或衍生自蛋白質的氨基酸)。然而，申請人發現當與含有動物衍生的組分的培養基比較時，即使當鈣濃度處于足夠水平時， 使用此類ACF培養基，ApxI生產效率低得多。不受理論束縛，伴隨血清的使用，關于鈣鹽沉淀的問題不是如此嚴重(由于形成鈣離子的可溶性絡合物的試劑的存在)。在任何情況下， 當硼葡萄糖酸用于絡合鈣離子時，可以獲得顯著的ApxI得率增加，令人驚訝地導致甚至高于可用常規含血清培養基獲得的得率。
材料與方法細菌菌株和培養基使用生產ApxI的胸膜炎肺炎放線桿菌菌株，血清型10，下文稱為APP 10，和生產ApxII和ApxIII，即血清型2的菌株，下文稱為APP 2，執行研究。在所有情況下，使用 Columbia Blood Agar BASE (BAB)平板(可從 Becton，Dickinson USA 獲得)重建這些菌株的工作種子。所使用的液體培養基是Columbia肉湯(可從Becton，Dickinson USA 獲得)或不含動物組分的培養基(稱為“ACF”)。后面一種培養基含有K2HP04(14.6g/l) 和NaH2PO4(3. 6g/l)的混合物作為緩沖液，以及NaNO3(0. 2g/l)、50%葡萄糖溶液(IOml)、 酵母提取物15g/l (可從Becton Dickinson獲得)、微量元素(例如，如Handbook of Microbiological Media，第 3 版，Ronald Atlas, CRC Press, 2004 中提及的 2. 5ml 溶液 SL-10)和IOmM氨基酸溶液(含有所有20種氨基酸，除色氨酸外)。測試的可替代不含動物組分的培養基(稱為“ACF-alt”)含有半胱氨酸.HCl (0. lg/1),NaNO3 (0. 5g/l)，KC1 (0. lg/ 1)、微量元素(如上)、50%葡萄糖溶液(IOml)和IOmM氨基酸溶液(如上)、HEPES緩沖液 (6g/l ；例如可從Sigma Aldrich獲得)和酵母提取物(10g/l)。這些培養基用于預培養和發酵中。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(0. 01% )用于預培養和發酵中。所有培養基通過0.22 μ m過濾進行滅菌。在用于發酵之前，培養基在85°C下加熱1分鐘。預培養APP菌株的工作種子在Columbia BAB平板上鋪展開，并且在約M小時過程中在 37°C下進行溫育。挑選幾個菌落以接種包含75mlC0lumbia肉湯的500mL瓶。使瓶在約6 小時過程中在37°C下在攪動下溫育，以形成預培養物。用這些預培養物，執行幾種發酵。在SIXF0RS發酵罐中的培養在含有約400mL培養基的SIXF0RS發酵槽(Infors AG，瑞士 )中，加入約20mL預培養物作為接種物。培養溫度是37°C，pH = 7. 2士0. 1 (通過加入4N氫氧化鈉或4N乙酸)， 并且充氣(aereation)是以50% p02。發酵器培養在約M小時后停止在Biostat發酵罐中的培養在含有10L培養基的Biostat C發酵器(B. Braun Biotech，德國)中，加入500mL APP預培養物作為接種物。應用與SIXF0RS發酵罐中相同的設置。然而，對于空氣/(X)2 95/5 ν/ν氣體混合物，通過維持lvvm(=氣體體積/培養基體積/分鐘)恒氣流，增加二氧化碳水平。這導致具有約5% pC02的充氣設置。發酵器培養在指數期結束時停止，在約8. 5小時后。在中試工廠規模下的培養中試工廠實驗在1001可分批滅菌發酵罐中執行。攪拌器軸配備3個六葉片 Rushton渦輪推進器。使發酵罐充滿75升培養基，并且用3升預培養物進行接種。溫度維持在37°C下，通過自動pH控制器使用20% (W/V)Na0H和8N乙酸使pH維持在7.3下。標準培養在CO2頂部空間超壓(500mbar)下執行，并且推進器以250rpm恒速旋轉。氧壓力不受控制。對于噴射(X)2培養實驗，培養基用NaHCO3補充至IOmM的終濃度，并且用富含0. 014vvm CO2的0. 25vvm空氣恒定氣流充氣。這導致約5 %的pC02。在APP 10菌株的情況下，培養基補充有25mMCaCl2，并且充氣是以50% p02。
分析在每次實驗結束時，從發酵罐中無菌取出細菌細胞培養物樣品，以測定在648nm 下的光密度，以及Apxl、ApxII和/或ApxIII水平(ELISA ；單位/ml)和任選地LPS水平 (LAL測定法；單位*105/ml)。結果用菌株APP 2在中試工廠規模下執行第一次實驗，以研究經過培養基的二氧化碳的作用(“噴射”CO2實驗)。所使用的培養基是Columbia肉湯。結果在表1中描述。給出 2次實驗(exp 1和exp 2)的結果。表 權利要求
1.通過在支持細菌生長的液體培養基中培養胸膜炎肺炎放線桿菌細菌來生產RTX-毒素ApxI或ApxIII的方法，其特征在于空氣在所述RTX-毒素的生產期過程中經過所述培養基，其中所述空氣具有超過正常大氣水平的二氧化碳含量。
2.根據權利要求1的方法，其特征在于所述空氣在所述胸膜炎肺炎放線桿菌的指數生長期過程中通過。
3.根據前述權利要求中任一項的方法，其中對所述培養基進行緩沖，其特征在于所述培養基通過使用碳酸氫鹽進行緩沖。
4.根據前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述空氣經由恒流經過所述培養基。
5.根據權利要求4的方法，其特征在于所述空氣在所述胸膜炎肺炎放線桿菌細菌的指數生長期過程中連續通過。
6.根據前述權利要求中任一項的方法，其特征在于所述二氧化碳含量不超過10%ν/Vo
7.根據權利要求6的方法，其特征在于所述二氧化碳含量是5%ν/ν。
8.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述RTX-毒素是ΑρχΙ，其特征在于所述培養基含有硼葡萄糖酸鈣。
全文摘要
本發明涉及通過在支持細菌生長的液體培養基中培養胸膜炎肺炎放線桿菌細菌來生產RTX-毒素ApxI或ApxIII的方法，其特征在于空氣經過培養基，其中所述空氣具有超過正常大氣水平的二氧化碳含量，以增加在RTX-毒素生產期過程中的RTX-毒素生產。
文檔編號C12P21/02GK102171362SQ200980138626
公開日2011年8月31日 申請日期2009年11月25日 優先權日2008年11月27日
發明者C·T·G·斯米茨, S-J·斯萊格曼 申請人:英特威國際有限公司