Hmo合成的制作方法

專利名稱：Hmo合成的制作方法
HMO合成本發明涉及穩定地培養于培養基中的適應于制備寡糖的細胞，轉化所述細胞使其包含至少一個編碼參與寡糖合成的酶的核酸序列。例如從Dumon等Q001)已知這種細胞。長時間來已知人母乳，除乳糖外，還包含被稱為人乳寡糖(HMO)的寡糖的復雜混合物。就組成和量而言此人母乳的寡糖部分是獨特的。與其他哺乳動物形成對比，人母乳包含7 12g/L的寡糖濃度，其比在大多數其他哺乳動物中高10 100倍(Boehm和Mahl， 2007，Kunz 等，2000，Newburg 和 Neubauer，1995)。現在，屬于HMO的超過80種化合物已經在結構上被表征。通常，與在人體中發現的其他寡糖不同，HMO的特征在于，在還原末端的乳糖結構部分，和在非還原末端的巖藻糖和/或唾液酸。區分有兩種基本類型1型結構的寡糖具有與GIcNAC進行α 1，4_連接的巖藻糖， 而II型結構的寡糖顯示GIcNAC或葡萄糖的α 1，3位巖藻糖基化；任何一種類型可以包含與半乳糖進行α 1，2-連接的巖藻糖。最重要的寡糖是2'-巖藻糖基乳糖和3-巖藻糖基乳糖。這些結構與上皮細胞表面復合糖的表位、Lewis組織-血型抗原諸如Lewis χ(Lex) (Gal ( β 1-4) [Fuc-(a 1-3) ]GlcNAc ( β 1))密切相關(Newburg，2001)。HMO 與上皮表位的結構同源性解釋了防御細菌性病原體的性質。例如，通過使病原體與HMO而非與人黏膜表面聚糖結合能夠顯著減小致病大腸桿菌(Escherichia coli) (Cravioto 等，1991)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae) (Coppa 等， 2006)、肺炎鏈球菌(Sti^ptococcus pneumoniae) (Andersson 等，1986)或空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni) (Ruiz-Palacios等，2003)的毒力，并且與毒素如大腸桿菌 (E. coli)的熱穩定腸毒素的結合也是如此(Crane等，1994)。除了所提及的在腸道中的局部作用，HMO通過進入全身循環，還能夠在嬰兒中誘發全身作用(tooth等，2001)。HMO對蛋白-碳水化合物相互作用，例如選擇蛋白-白細胞結合的影響能夠調節免疫反應并且減小炎性反應(Bode，2006，Kunz和Rudloff，2006)。為降低新生兒獲得感染的頻率并且，因此，以及嬰兒死亡率，當然非常需要廣泛地給嬰兒提供包括HMO的營養物。這在其中普遍并且廣泛實行母乳喂養的社會中可能是容易實現的。但是一般都不是這樣。存在若干醫學原因，比如可能的傳染性疾病的母嬰傳播，所述原因在特定情況下反對母乳喂養。在很多非洲國家，例如，母乳喂養可能是在嬰兒期期間感染HIV的主要原因。同樣地，文化情況可能導致拒絕母乳喂養，如在主要工業國家像，例如，美國就是這樣。由于HMO在天然源諸如其他哺乳動物的乳汁中只能以低濃度存在，所以從天然源提取寡糖不適于滿足對HMO的需要。寡糖的化學合成是費力的并且需要多個保護和脫保護步驟(Kretzschmar和Stahl, 1998)，因此通常相對昂貴并且具有低的回收率。因此，利用生物技術工程生物體發酵制備寡糖對于大規模的HMO合成是有前途的可選解決方案。在過去的十年中，若干合成HMO的成功嘗試已被發表，所述嘗試使用重組大腸桿菌發酵或使用體外酶轉化。這些嘗試主要集中在合成屬于HMO或與HMO十分相似的巖藻糖基化的化合物。例如，若干出版物描述了以下各項的合成=Lewis結構乳_N_新巖藻戊糖 (lacto-N-neofucopentaose)、乳-N-新二巖藻己糖(lacto-N-neodifucohexaose)禾口乳-N-新二巖藻辛糖(lacto-N-neodifucooctaose)，以及2'-和3_巖藻糖基乳糖 (fucosyllactose) (Albermann 等，2001，Dumon 等，2006，Dumon 等，2001，Dumon 等，2004， Koizumi等，2000)。在這些情況中，離析物像例如乳糖的酶巖藻糖基化通過巖藻糖基轉移酶 (FucTs)來進行。報道巖藻糖基化的化合物制備的多數出版物就此描述了源自幽門螺桿菌 (Helicobacter pylori)的FucTs的使用。一般，人FucI1s也能夠用于此目的。然而，當在細菌細胞中超表達時，來源于細菌的FucTs —般較少地傾向于產生諸如錯折疊和不溶性的問題。此外，多數公布的用于合成巖藻糖基化的化合物的系統依賴大腸桿菌的內源 ⑶P-巖藻糖庫，所述庫通常用于合成包含巖藻糖的外泌多糖可拉酸(colonic acid) (Grant 等，1970)。在這些情況中，⑶P-巖藻糖的可用性當然是瓶頸，其限制了合成效率。最近，本發明的發明人已經描述了利用Fkp酶的新的整細胞制備方法(Parkot等， 2008)，此專利申請的全部內容通過引用結合于此。Fkp (Coyne等，2005)，來源自脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)，是具有雙重功能的酶，其擁有巖藻糖激酶和L-巖藻糖-I-P-鳥苷酸轉移酶兩種活性。因此，外源供給的巖藻糖首先被磷酸化然后被核苷酸激活從而形成重要的前體分子GDP-巖藻糖。基于Fkp 的L-巖藻糖補救途徑已經被成功地用于合成巖藻糖基化的寡糖(Parkot等，2008)。雖然，在如此的生化合成的水平上，已經發展出重要策略，但是已知的用于體內寡糖合成的方法都具有一定的不足，其抑制，至多，寡糖的大規模制備。在細胞中高速制備寡糖的實際難點一方面是細胞內大量富集制備的寡糖和核苷酸副產品，而另一方面是制備的寡糖的提取。由于細胞內富集，所述合成反應的產物會逐漸形成對合成酶的產物抑制作用。因此在某一點，所述合成變得無效率的慢。此外，所述產物可能達到細胞毒性濃度以驅使細胞裂解或至少代謝受阻。在任何情況中，寡糖的連續細胞內制備是不可能的。此外，能夠預期過量的寡糖累積將最終導致細胞裂解和細胞死亡。此細胞裂解或之后進行的用于從所述細胞提取合成的寡糖的細胞裂解將產生目標寡糖和細胞組分(代謝產物、碎片)的復雜混合物。從此復雜混合物中純化目標寡糖成本昂貴并且因此對于大多數寡糖來說是不經濟的。在這些條件下，生物技術寡糖制備是低效并且難以控制的，尤其因為已知的生物技術寡糖制備使用分批培養來進行，從經濟角度，這種分批培養是很不令人滿意的。考慮到以上，本發明的目標是以這樣的方式改進生物技術制備寡糖的方法以致所述制備變得容易和更可控，并且寡糖的產量總的來說得到提高。根據本發明，此目標和其他目標通過提供最初提到的類型的細胞來實現，此外轉化所述細胞使其包含至少一個編碼糖流出轉運蛋白家族(sugar efflux transporter family)蛋白、其功能同系物或衍生物的核酸序列。本發明的目標因此完全實現。根據本發明，理解寡糖是單糖的短的聚合物，其包含至少2個糖亞基。所述寡糖可以是亞基的支鏈或形成亞基的直鏈。此外，所述寡糖的糖亞基的特征可以是許多化學修飾。 因此，根據本發明的寡糖可以包含一個或多個非糖結構部分。根據本發明，核酸序列描述遺傳密碼，其由核酸聚合物像例如脫氧核糖核酸聚合物或核糖核酸聚合物代表。遺傳密碼因此可以包括包含蛋白形成信息的編碼序列，或非編碼區域，所述非編碼區域包括例如啟動子區域、用于結合調節或輔助化合物的區域、間隔區和影響所述核酸聚合物自身的二級或三級結構和/或參與其加工的結構序列。根據本發明，“轉化...以使其包含”涉及向細胞中插入至少一個另外的核酸序列的任何方法，其后所述核酸序列作為質粒出現在所述細胞中或被整合到所述細胞的染色體中。已知的轉化方法包括例如化學轉化或電穿孔。通過將至少一個另外的核酸序列的染色體整合，即使在沒有選擇劑的情況下，通常能夠獲得穩定的基因轉移。為了該目的，可以用病毒或噬菌體感染所述細胞。備選地，可以應用使用例如基于病毒或轉座子的系統的同源和非同源重組的其他方式。對于生物技術應用，從細胞輸出較大的寡糖是復雜的問題。這是主要的情況，因為只鑒定出了很少的涉及這種運輸的細胞機制。從細胞輸出寡糖很少發生的原因在于寡糖合成消耗大量的細胞資源。因此這些化合物的損失對于細胞來說通常是不利的。此外，寡糖輸出的大部分已知機制涉及寡糖的化學修飾，例如通過使它們與脂質-結構部分相連(Alaimo等，2006)。從而，寡糖不僅以膜運載，這抑制它們釋放到培養基中，而且與脂質-結構部分化學連接，這降低了它們在水性介質中的溶解度。因此，這樣的機制幾乎不適于在大規模制備寡糖中使用。由Liu和同事首先描述(Liu等，1999a)的大腸桿菌的糖流出轉運蛋白(SET)家族包括蛋白SetA、ktB和ktC。轉運蛋白的同源物(氨基酸同一性> 50% )主要在腸桿菌科(Enterobacteriaceae)中被發現(Liu 等，l9"a)。除葡萄糖和乳糖外，SET輸出蛋白(exporter protein)顯示出對以下物質的底物特異性特定單糖和二糖以及，例如，誘導物分子異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和有毒的糖類似物ο-硝基苯基-β -D-硫代半乳糖苷(ONPG) (Liu等，1999b)。然而生化研究顯示，例如，SetA對較大的或較龐大的分子諸如庚糖或三糖顯示非常低至零轉運活性。由于以上原因，不能預期SET家族的輸出蛋白將絲毫適于轉運寡糖。然而，本發明人已經發現，令人驚奇地，SET輸出蛋白的超表達導致非常有效的寡糖輸出。此外，SET蛋白已經顯示輸出乳糖(所述合成反應的離析物之一)。因此預期，在經修飾的細胞中獲得的寡糖的合成將非常低效并且緩慢地進行，這歸因于離析物持續地從所述細胞中排出。相反，本發明人已經能夠首次顯示，縱使SET輸出蛋白超表達，在經修飾的細胞中獲得的寡糖的合成也具有高的生產率。通常，優選地，所述細胞選自由以下各項組成的組細菌、真菌、動物和植物細胞。 因此特別優選地，所述細胞是大腸桿菌細胞。由此優勢是大腸桿菌細胞提供高的代謝活性和高的繁殖率。此外，大腸桿菌是一種得到最好表征的用于分子生物學和生物技術用途的生物體。本領域中已知的用于轉化和培養細菌的眾多技術尤其適用于大腸桿菌。此外，在市場上可以買到具有多種遺傳背景的大腸桿菌菌株。此外，優選地，所述酶選自包含以下各項的組糖基轉移酶、Leloir類糖基轉移酶、非Leloir糖基轉移酶、唾液酸轉移酶、半乳糖基轉移酶、巖藻糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、N-乙酰葡糖胺轉移酶、N-乙酰半乳糖胺轉移酶。根據一個實施方案，所述酶是巖藻糖基轉移酶。此外，優選地，所述糖流出轉運蛋白是SetA或其衍生物。在此情況中的優勢是，在輸出蛋白的SET家族的經生化表征的成員中，SetA以具有最廣的底物特異性為特征。因此，使用^tA能夠至少潛在地輸出并因此制備最廣泛多樣的寡糖。同樣優選地，進一步轉化所述細胞使其包含至少一個編碼推動或促進寡糖合成所需離析物的輸入的蛋白的核酸序列。因此，有優勢的是，細胞內的離析物濃度增加。在正常條件下，離析物諸如巖藻糖或乳糖的輸入受限于相應輸入蛋白(importer protein)的可用性。然而，在適應于大規模合成寡糖的細胞的情況中，離析物的輸入，其依賴于輸入蛋白的內源水平，可能不足以連續地給所述合成反應提供離析物。可以通過超表達各自的輸入蛋白來解決此問題。在此情況中相關的輸入蛋白主要是單糖或二糖的輸入蛋白諸如乳糖輸入蛋白，例如大腸桿菌半乳糖苷通透酶(LacY)或巖藻糖輸入蛋白，例如大腸桿菌巖藻糖通透酶 (FucP)，但是也可以包括核苷酸和其他離析物的輸入蛋白。尤其優選地，轉化所述細胞使其包含至少一個編碼選自由以下各項組成的組的蛋白的核酸序列乳糖轉運蛋白、巖藻糖轉運蛋白、唾液酸轉運蛋白、半乳糖轉運蛋白、甘露糖轉運蛋白、N-乙酰葡糖胺轉運蛋白、N-乙酰半乳糖胺轉運蛋白、ABC轉運蛋白、核苷酸激活糖的轉運蛋白以及核堿基(NuclecAase)、核苷或核苷酸的轉運蛋白。就此而論，核苷酸激活糖可以是，但不限于⑶P-巖藻糖、CMP-唾液酸、UDP-半乳糖、UDP-葡萄糖、⑶P-甘露糖、UDP-葡糖胺或UDP-半乳糖胺。此外，術語核堿基是指鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。核苷是指鳥苷、胞苷、腺苷、胸苷和尿苷，而核苷酸可以是鳥苷、胞苷、腺苷、胸苷或尿苷的單磷酸、二磷
酸或三磷酸酯。此外，優選地，進一步轉化所述細胞使其包含至少一個核酸序列，所述核酸序列編碼選自由以下各項組成的組的蛋白核苷酸基轉移酶、鳥苷酸轉移酶、尿苷酰基轉移酶 (uridylyltransferase) ,Fkpa-巖藻糖激酶、巖藻糖磷酸鳥苷酸轉移酶、CMP-唾液酸合成酶、半乳糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基轉移酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基轉移酶、甘露糖激酶、甘露糖-1-磷酸鳥苷酸轉移酶、GDP-4-酮-6-脫氧-D-甘露糖還原酶、葡糖胺激酶、葡糖胺-磷酸乙酰轉移酶、N-乙酰-葡糖胺-磷酸尿苷酰基轉移酶、
7UDP-N-乙酰葡糖胺4-差向異構酶、UDP-N-乙酰葡糖胺2-差向異構酶。就此而論，術語核苷酸基轉移酶通常涉及能夠將核苷酸轉移到糖磷酸 (phosphosugar)上的酶，不管它是天然存在的糖還是非天然的糖。由此優勢是，如在通過引用包含于此的Parkot等，2008中所同樣描述的，細胞內核苷酸激活糖像GDP-巖藻糖的庫可以得到補充。因此，使寡糖合成更有效。此外，通常優選地，合成寡糖所涉及和/或需要的所選擇的單糖、二糖或寡糖的細胞分解代謝通路至少部分失活。此處，優勢在于總的合成效率能夠增加的事實。這是因為更少的指定用于寡糖合成的離析物被細胞的內源代謝所消耗的情形。在以下描述的實施方案中，例如，使用乳糖降解缺陷型細胞。這能夠通過使由IacZ 基因編碼的半乳糖苷酶失活來獲得。此遺傳修飾防止細胞內的乳糖裂解為可快速代謝的單糖葡萄糖和半乳糖。因此，作為隨后的糖基化/巖藻糖基化反應的受體分子，乳糖以較高的濃度存在。在備選實施方案中，用于寡糖合成的細胞是，只是或除上述1 α cZ缺陷型外還是， L-巖藻糖降解缺陷型的。這可以通過使fucA基因失活來獲得，所述fucA基因編碼巖藻糖降解通路的關鍵的分解代謝酶巖藻糖(fucul0Se)-l-磷酸醛縮酶(FucA)。當然，還有從酶抑制劑到穩定轉染的RNAi構建體的其他可用技術，可以使用所述技術以使分解代謝通路至少部分失活。在本發明的范圍內，通常優選地，所述寡糖包含至少三個亞基和/或以具有至少大約480g/mol的分子量為特征。所有主要的重要的HMO的分子量在此閾值之上。本發明進一步涉及用于制備寡糖的方法，所述方法包括以下步驟a)提供根據本發明的細胞，b)在允許制備所述寡糖的條件下在培養基中培養所述細胞，c)從所述培養基中提取所述寡糖。在本發明的范圍內，允許的條件被理解為是涉及物理或化學參數包括但不限于溫度、PH、壓力、滲透壓和產物/離析物濃度的條件。在具體的實施方案中，所述允許的條件可以包括30+/-20°C的溫度范圍、7+/-3的 PH范圍。上述方法具有的優勢是寡糖能夠直接從所述培養基中提取，而已知方法需要裂解所述細胞以及隨后從得到的裂解液中提取寡糖。就此而論，優選地，使用連續流式生物反應器來進行步驟b)。優勢在于，使用連續流式生物反應器，能夠容易地提高制備的寡糖量。這是因為所述合成以相對高的水平連續發生的情形。同樣優選地，步驟b)中的培養基包含一種或多種選自由以下各項組成的組的物質支持細胞生長和繁殖的基礎補充劑、選擇劑、基因活性的效應物以及合成寡糖所需要的離析物。支持細胞生長和繁殖的典型補充劑是從現有技術廣為人知的并且在例如 Sambrook和RuSSel，2001中得到描述。這種基礎補充劑解決培養的細胞的一般營養需要，其包含例如蛋白、碳水化合物、脂質和礦物質。同樣地，選擇劑像抗生素是從現有技術例如Sambrook和RuSSel，2001廣為人知的。可以使用這樣的藥劑以便使遺傳修飾的細胞的培養免受競爭性生物體諸如真菌或細菌的持續污染。此外，例如在細菌群落中，可以使用選擇劑以便穩定包含在質粒上的遺傳信肩、ο可以使用基因活性的效應物以在細胞內選擇性地誘導或抑制某些基因或基因的組的活性。這樣的效應物在從簡單的化學化合物諸如異丙基-1-硫代-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)到更復雜的化合物像激素的范圍內。這樣的基因活性的效應物是從現有技術例如從Sambrook和Russel，2001廣為人知。此外，優選地，所述離析物選自由以下各項組成的組阿拉伯糖、蘇糖、赤蘚糖、核糖、核酮糖、木糖、葡萄糖、D-2-脫氧-2-氨基-葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、葡糖胺、果糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、山梨糖、巖藻糖、N-乙酰神經氨酸、糖苷、非天然糖、核堿基、核苷、核苷酸和其任何可能的二聚體或聚合物。通常優選地，所述寡糖包含至少三個亞基和/或以具有至少大約480g/mol的分子量為特征。根據本發明的實施方案，由上述方法制備的寡糖是巖藻糖基乳糖，在此情況中優勢在于巖藻糖基乳糖是存在于HMO中的最主要的化合物中的一種。進一步的優勢從對實施方案和附圖的描述得出。不言而喻地，以上提及的特征和仍要在以下說明的特征不僅能夠用于分別指定的組合，還能夠用于其他組合或其自身，而不離開本發明的范圍。本發明的若干實施方案圖示于附圖中并且在隨后的描述中得到更詳細說明。在附圖中

圖1顯示在根據本發明修飾的革蘭氏陰性細菌細胞中寡糖合成和轉運的綜述示意圖；圖2顯示在細菌培養物的細胞潮濕團塊和上清液中3-巖藻糖基乳糖的測量結果， 其比較不同的基因型；以及圖3顯示在關于不同基因型的細菌培養物中合成的3-巖藻糖基乳糖的量之間的比較。實施例1 在革蘭氏陰性細菌細胞內的寡糖合成和轉運圖1顯示革蘭氏陰性細菌細胞10的截面。根據本發明的革蘭氏陰性細菌細胞10 包括外膜11、質膜12、定位于所述外膜11和所述質膜12之間的周質間隙13、以及被所述質膜12包圍在內的細胞溶膠14。所述外膜包括孔蛋白，通過所述孔蛋白水溶性化合物能夠從培養基16進入周質間隙13并且反之亦然。根據本發明的一個實施方案，所述質膜包括起第一離析物-轉運蛋白17作用的 FucP、起第二離析物轉運蛋白18作用的LacY、和起產物輸出蛋白作用的SetA0此外，起核苷酸基轉移酶20作用的Fkp和起糖基轉移酶21作用的FutAco包含在細胞溶膠14中。根據此實施方案，當將作為第一離析物22的巖藻糖和作為第二離析物23的乳糖提供給培養基16時，他們通過孔蛋白15進入周質間隙13。然后，第一離析物22由第一離析物轉運蛋白17轉運到細胞溶膠14中。在細胞溶膠中，第一離析物22由核苷酸基轉移酶 20修飾，產生核苷酸基化的第一離析物24，即GDP-巖藻糖。第二離析物23由第二離析物輸入蛋白15輸入到細胞溶膠14中。然后糖基轉移酶21催化核苷酸基化的第一離析物，即GDP-巖藻糖和第二離析物， 即乳糖之間的反應，產生寡糖25，3-巖藻糖基乳糖，和⑶P (未顯示)。之后，寡糖25由產物輸出蛋白19(SetA)從細胞溶膠14輸出到周質間隙13中并且能夠經由孔蛋白15離開周質間隙13，并進入培養基16。實施例2 材料和方法2. 1表達質粒的構建和大腸桿菌菌株的開發使用大腸桿菌JM109 (DE3) (Promega ；www. promega. com)作為用于開發大腸桿菌生產菌株的初始宿主菌株。用于克隆步驟的所有寡核苷酸引物列表于表1中。構建質粒 pACYC-1 α cY 和 pACYC-1 α cF-setA 如下使用引物 IacY NcoI 正向 /IacY EcoRI 反向和 setA NdeI 正向 /setA XhoI 反向從大腸桿菌 TOPlO (Invitrogen ；www. invitrogen. com)的基因組DNA擴增基因IacY (相應于GenBank登錄號ACB02461) (GenBank ；www. ncbi. nlm. nih. gov)和 setA (相應于 GenBank 登錄號 YP_025^3) (GenBank)。使 PCR 產物進行使用指定的酶的限制性消化，并與相應消化的表達載體pACY⑶uet-1 (Novagen ；www. merckbiosciences. co. uk)連接。通過限制性消化、瓊脂糖凝膠電泳以及使用引物pACYCduetUPl、DuetDOffN-I-弓丨物、DuetUP2-引物和T7-終止子-引物的測序來檢驗所得的質粒的基因的正確插入(數據未顯示)。所用的質粒pCOLA-fkp-fucP和pET-futAco以前已經被構建(Parkot等，2008)。 為獲得菌株JMOO、JMOl和JM02，通過電穿孔將質粒的不同組合引入大腸桿菌JM109(DE3) (Dower等，1988)。所有的質粒和細菌菌株列表于表2中。2. 2大腸桿菌中巖藻糖-分解代謝的失活為防止外部提供的巖藻糖的降解，使編碼關鍵分解代謝酶L-巖藻糖-1-磷酸醛縮酶的fucA基因從大腸桿菌JM109(DE!3)的染色體中缺失。用于誘變過程的所有寡核苷酸引物列表于表1。為構建fucA缺失型突變體，應用Datsenko和Wanner的方法(Datsenko禾口 Wanner, 2000)，其使用引物fucA-敲除-f和fucA-敲除_r。通過PCR，使用位于染色體插入位點旁側的引物fucA-對照-f和fucA-對照-r來確認fucA的正確缺失，并且通過將所述細菌涂板于M9基本瓊脂(minimal agar)上來證實巖藻糖-陰性表型(Sambrook和 Russell, 2001)，所述M9基本瓊脂補充巖藻糖作為唯一碳源(數據未顯示)。表1此研究中使用的引物
權利要求
1.在培養基中穩定培養的細胞，所述細胞適應于制備寡糖，轉化所述細胞使其包含至少一個編碼參與寡糖合成的酶的核酸序列，其特征在于另外轉化所述細胞使其包含至少一個編碼糖流出轉運蛋白家族的蛋白、其功能同源物或衍生物的核酸序列。
2.根據權利要求1的細胞，其特征在于所述細胞選自由細菌、真菌、動物和植物細胞組成的組。
3.根據權利要求2的細胞，其特征在于所述細胞是大腸桿菌(Escherichiacoli)細胞。
4.根據權利要求1至3中任一項的細胞，其特征在于所述酶選自包括以下各項的組 糖基轉移酶、Leloir型糖基轉移酶、非Leloir糖基轉移酶、巖藻糖基轉移酶、唾液酸轉移酶、半乳糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶、N-乙酰葡糖胺轉移酶、N-乙酰半乳糖胺轉移酶。
5.根據權利要求4的細胞，其特征在于所述酶是巖藻糖基轉移酶。
6.根據權利要求1至5中任一項的細胞，其特征在于所述糖流出轉運蛋白是ktA或其衍生物。
7.根據權利要求1至6中任一項的細胞，其特征在于進一步轉化所述細胞以使其包含至少一個編碼推動或促進寡糖合成所需離析物的輸入的蛋白的核酸序列。
8.根據權利要求7的細胞，其特征在于轉化所述細胞以使其包含至少一個編碼選自由以下各項組成的組的蛋白的核酸序列乳糖轉運蛋白、巖藻糖轉運蛋白、唾液酸轉運蛋白、 半乳糖轉運蛋白、甘露糖轉運蛋白、N-乙酰葡糖胺轉運蛋白、N-乙酰半乳糖胺轉運蛋白、 ABC-轉運蛋白、核苷酸激活糖的轉運蛋白和核堿基、核苷或核苷酸的轉運蛋白。
9.根據權利要求1至8中任一項的細胞，其特征在于進一步轉化所述細胞以使其包含至少一個編碼選自由以下各項組成的組的蛋白的核酸序列核苷酸基轉移酶、鳥苷酸轉移酶、尿苷酰基轉移酶、Fkp、L-巖藻糖激酶、巖藻糖-1-磷酸鳥苷酸轉移酶、CMP-唾液酸合成酶、半乳糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基轉移酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基轉移酶、甘露糖激酶、甘露糖-1-磷酸鳥苷酸轉移酶、GDP-4-酮-6-脫氧-D-甘露糖還原酶、 葡糖胺激酶、葡糖胺-磷酸乙酰轉移酶、N-乙酰-葡糖胺-磷酸尿苷酰基轉移酶、UDP-N-乙酰葡糖胺4-差向異構酶、UDP-N-乙酰-葡糖胺2-差向異構酶。
10.根據權利要求1至9中任一項的細胞，其特征在于所述細胞包含關于所選的單糖、 二糖或寡糖的分解代謝通路，所述分解代謝通路至少部分失活，所述單糖、二糖或寡糖參與所述寡糖合成和/或為所述寡糖合成所需。
11.根據權利要求1至10中任一項的細胞，其特征在于所述寡糖包含至少三個亞基和 /或以具有至少大約480g/mol的分子量為特征。
12.用于制備寡糖的方法，所述方法包括以下步驟a)提供根據權利要求1至11中任一項的細胞，b)在培養基中在允許制備所述寡糖的條件下培養所述細胞，c)從所述培養基中提取所述寡糖。
13.根據權利要求12的方法，其特征在于使用連續流式生物反應器來進行步驟b)。
14.根據權利要求12或13的方法，其特征在于，在步驟b)中的培養基包含一種或多種選自由以下各項組成的組的物質支持細胞生長和繁殖的基本補充劑、選擇劑、寡糖合成所需的離析物、基因活性的效應物。
15.根據權利要求14的方法，其特征在于所述離析物選自由以下各項組成的組阿拉伯糖、蘇糖、赤蘚糖、核糖、核酮糖、木糖、葡萄糖、D-2-脫氧-2-氨基-葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、葡糖胺、果糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、山梨糖、巖藻糖、N-乙酰神經氨酸、糖苷、非天然糖、核堿基、核苷、核苷酸和其任何可能的二聚體或聚合物。
16.根據權利要求12至15中任一項的方法，其特征在于所述寡糖包含至少三個亞基和 /或以具有至少大約480g/mol的分子量為特征。
17.根據權利要求16的方法，其特征在于所述寡糖是巖藻糖基乳糖。
全文摘要
本發明涉及在培養基中穩定培養的細胞，所述細胞適應于制備寡糖，轉化所述細胞使其包含至少一個編碼參與寡糖合成的酶的核酸序列。此外，轉化所述細胞使其包含至少一個編碼糖流出轉運蛋白家族的蛋白、其功能同源物或衍生物的核酸序列。此外，本發明涉及用于制備寡糖的方法，所述方法涉及以上細胞。
文檔編號C12N15/63GK102459605SQ200980159755
公開日2012年5月16日 申請日期2009年6月8日 優先權日2009年6月8日
發明者埃里克·休夫納, 斯特凡·詹內懷恩, 朱莉婭·帕考特 申請人:詹尼溫生物技術有限責任公司