專利名稱：擬穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列及其克隆方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬擬穴青蟹的基因編碼及其克隆和應用領域，特別是涉及一種擬穴青蟹胰 蛋白酶基因CDNA序列及其克隆方法和應用。
背景技術：
甲殼動物生長發育總是與蛻殼聯系在一起的。蛻殼的整個過程包括蛻去舊甲殼， 個體由于吸水迅速增大，然后新甲殼形成并硬化。因此甲殼動物的個體增長在外形上并不 連續，呈階梯形，每蛻一次殼，上一個臺階。蛻殼周期可分為蛻殼、蛻殼后、蛻殼間和蛻殼前。 對于甲殼動物，根據Drach和Tchemigovtzef的標準可把蛻殼周期進一步劃分為Ε、A、B、 C(C1-C4)、D (Dtl-D4) 5個時相。青蟹的生長也是不連續的，蛻殼是其生長的標志。在青蟹的生命活動中，包括形態的改變、個體的增大、發育與成熟、斷肢的再生、體 表附著物和某些病變的剔除等，都是經過不斷的蛻皮和蛻殼而完成的。蛻皮與蛻殼，既是外 部形態的變化，又是內部錯綜復雜的生理活動。這種生理作用，對生長發育非常重要。影響蛻殼的環境因子較多，如溫度、鹽度、pH值、光照期、生存空間等等，餌料、維生 素C等均可影響蛻殼過程。其中攝食量的大小對于蛻殼的物質準備至關重要。在青蟹人工種苗的繁育過程中，餌料投喂量的控制是一個關鍵的因素。餌料量不 夠會導致種苗生長期延長，不僅影響正常的蛻殼活動，而且容易增加種苗相互間的殘殺率。 餌料量過多則不僅浪費餌料，更不利的是容易敗壞水質，從而制約種苗的成活率。因此，準 確預測投餌量對于青蟹種苗的繁育非常重要，目前采用的方法主要還是人工目測餌料的剩 余量以及經驗推斷。胰蛋白酶是動物消化道中一種主要的堿性蛋白水解酶，屬于絲氨酸蛋白酶家族， 專一性水解賴氨酸與精氨酸羧基形成的肽鍵，其主要功能一是消化蛋白質食物，二是激活 所有胰腺分泌的酶原，可以迅速有力地激活其他蛋白酶原(糜蛋白酶原、羧肽酶原、彈性蛋 白酶原)而行使消化功能。因此胰蛋白酶基因的表達水平與動物的消化水平和攝食能力密 切相關。到目前為止，還未見根據青蟹胰蛋白酶基因的表達水平來預估投餌數量，并預測 青蟹蛻殼周期的相關報道
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種擬穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列及其克 隆方法和應用，該擬穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列能夠預測青蟹種苗繁育過程中的投餌 量以及蛻殼周期，以滿足人們對青蟹生活周期的掌握以及遺傳育種中的選用，減少餌料消 耗量，提高種苗成活率，從而優化育苗過程。本發明的一種擬穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列，如SEQ ID NO=I所示；a.序列特征長度881bp;
類型核酸；鏈型雙鏈；拓撲結構線性；b.分子類型cDNAc.假設否；d.反義否;e.最初來源擬穴青蟹(Scylla paramamosain)。所述的擬穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列長度為881bp，其中開放閱讀框位于25-804位核苷酸(780個核苷酸)；根據重復試驗所獲得的序列與所述的SEQ ID NO. 1中從核苷酸第25-804位的核 苷酸序列具有70%以上的同源性，或者與SEQ ID NO. 1中從核苷酸第25-804位的核苷酸序 列雜交(由于考慮到重復實驗新克隆出的序列與SEQ ID NO. 1的序列會有些許不同)；所述的序列具有如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、其保守性變異多肽、其 活性片段或其活性衍生物(包括金屬取代物，脂肪酸酞化物，高級醇醋化物或烷基胺化物 等)；所述的SEQ ID NO :2氨基酸序列，根據全程cDNA推導出擬穴青蟹胰蛋白酶共259 個氨基酸殘基，分子量為28. 15KDa，等電點pi為4. 49 ；所述的cDNA分子中包含8-100個連續核苷酸；所述的cDNA分子轉化的宿主細胞，它是真核細胞。本發明的一種擬穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列的克隆，包括(1)從擬穴青蟹的肝胰腺提取總RNA ；(2)根據提取得到的RNA，構建cDNA質粒文庫；(3) cDNA文庫的鑒定和測序；(4)根據BLAST對比，獲得如SEQ ID NO 1所示的序列。本發明的一種擬穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列在預測青蟹種苗餌料投喂量及蛻 殼周期中的應用。有益效果本發明提供的擬穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列，能夠預測青蟹種苗繁育過程中 的投餌量以及蛻殼周期，以滿足人們對青蟹生活周期的掌握以及遺傳育種中的選用，減少 餌料消耗量，提高種苗成活率，從而優化育苗過程。
圖1為青蟹胰蛋白酶基因全長擴增圖譜。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。
實施例1擬穴青蟹胰蛋白酶基因的克隆(I)RNA 的分離(RNA isolation)取擬穴青蟹的肝胰腺，加液氮，用研缽研碎，加入盛有Trizol裂解液的1. 5mL EP 管，充分振蕩，抽提總RNA(TRIzol Reagents，TaKaRa)，用甲醛變形膠電泳鑒定總RNA質量， 然后再分光光度計上測定RNA含量；步驟如下1.勻漿處理(Homogenization) 將10_30mg組織加入Iml TRIzol，用電動勻漿器或者一次性研磨杵充分勻漿；2. j^B (Phase Separation)a.勻漿后，室溫放置5min，使樣品充分裂解，再于4°C，12，OOOrpm離心10分鐘，取
上清；b.然后加入200 μ 1氯仿，劇烈振蕩混勻后室溫放置3-5min，使其自然分相；3. RNA 沉淀(RNA Precipitation)a.于4°C 12，OOOrpm離心10-15min，樣品會分成三層黃色的有機相，中間層和無 色的水相，RNA主要在水相中，把水相(通常可吸取550 μ 1)轉移到新管中；b.取上清，加入等體積冰冷的異丙醇，室溫放置10-20min，4°C 12，OOOrpm離心 IOmin,棄上清，RNA沉淀于管底；4. RNA 漂洗(RNA Wash)a. RNA沉淀中加入Iml 75%乙醇(用RNase-free水配制)，溫和振蕩離心管，懸浮 沉淀；b. 40C 5，000-8, OOOrpm離心l-2min，棄上清；短暫快速離心，用移液器小心吸棄上清， 注意不要吸棄沉淀，室溫放置1-2分鐘晾干沉淀；5.溶角軍 RNA(Redissolving the RNA)沉淀中加入50-100 μ 1 RNase-free水，輕彈管壁，以充分溶解RNA，_70°C保存。(2) cDNA 文庫構建1.用 oligotex 試劑盒分離 mRNA。2.雙鏈 cDNA 的合成(Smart cDNA Library Construction kit，Clontech 公司)取0· 5 μ g mRNA,分別加入 1 μ 1 SMARTIV 引物(10 μ M，5 ‘ -AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTGGCCATTACGGCCGGG-3 ‘)和 CDS III 引物(10 μ M，5-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d (HN-3'，N = A、G、C、T ；N^1 = A、G、C)，加水至總體積 5μ 1，72°C變性 2min，冰浴 2min ； 在Superscrip til逆轉錄酶作用下，42°C 2h，合成cDNA第一鏈。取cDNA第一鏈2 μ 1，加 入80 μ 1 去離子水，10 μ 1 IOXAdvantage 2PCR Buffer, 2 μ 1 50XdNTP Mix, 4 μ 1 5' PCR Primer, 2 μ 1 50 X Advantage 2Polymerase Mix，用長距離 PCR 的方法合成 cDNA 第二條鏈。3. cDNA 均一化取4μ 1純化后的cDNA加入4μ 1雜交緩沖液，加水至16μ 1，98°C變性2m in，68°C 雜交5h，加入適量DSN酶及緩沖液處理20m in,加入10 μ 1終止緩沖液完成cDNA均一化。4.均一化文庫構建分別以PCR primerMl和PCR primerM2為引物，對均一化后的cDNA進行兩輪PCR 擴增；取1 μ g純化過的cDNA用SfiI核酸內切酶酶切2h后割膠純化大于500bp的cDNA片段；回收的片段與經過SfiI核酸內切酶處理過的PDNR2L IB文庫載體連接過夜；連接產物直接轉化大腸桿菌感受態細胞，制成原始文庫。(3) cDNA文庫的鑒定及測序分析1.文庫庫容測定及質量鑒定取適量原始文庫用LB液體培養基進行10_3，10_6梯度稀釋，每個梯度設3個平行， 取0. Iml稀釋液于90mm培養皿中涂布，37°C培養過夜，計數培養皿中克隆數目以計算出文 庫庫容；隨機挑選96個單克隆，以M13通用引物PCR擴增，電泳檢測插入片段大小。2.測序分析對構建的cDNA文庫進行測序，于BLAST程序中，根據與已知的胰蛋白酶基因(遠海梭子蟹 Portunus pelagicus,凡納濱對蟲下 Penaeus vannamei,中國對蟲下 Fenneropenaeus chinensis等)相比，挑選具有高度同源性的基因，初步認定它是擬穴青蟹胰蛋白酶基因；再將擬穴青蟹胰蛋白酶基因的全長cDNA序列及編碼蛋白用BLAST程序在 Non-redundant GenBank nucleotides禾口Non-redundant GenBank proteins 數據庫進行核 苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發現它與遠海梭子蟹(Portimus pelagicus)的胰蛋白酶基 因在核苷酸水平上具有86%的一致性；與遠海梭子蟹(Portimus pelagicus)的胰蛋白酶 在氨基酸水平上具有88%的一致性，故可以認為SEQ ID NO. 1的序列是擬穴青蟹的胰蛋白 酶基因序列。本發明新的胰蛋白酶基因全長cDNA的長度為881bp，詳細序列見SEQ ID N0. 1，其 中開放閱讀框位于25-804位核苷酸(780個核苷酸)；根據全程cDNA推導出擬穴青蟹胰蛋白酶共259個氨基酸殘基，分子量為 28. 15KDa，等電點(pi)為 4. 49，詳細序列見 SEQ ID N0. 2。實施例2擬穴青蟹胰蛋白酶基因的熒光定量PCR檢測在預測青蟹種苗餌料投喂量及蛻殼周期中的應用(1)總 RNA 提取取各個潘狀幼體時期的青蟹個體，加液氮，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振蕩，抽提總RNA (TRIzol Reagents, TaKaRa)，用甲醛變形膠電泳鑒定總RNA質 量，然后再分光光度計上測定RNA含量；(2)熒光定量PCR實驗按照TaKaRa 公司的 SYBR ExScript TM RT-PCR Kit (Perfect Real Time)的說 明進行，反轉錄的條件為42°C反應15分鐘，95°C反應2分鐘；取提取的擬穴青蟹各個潘狀幼體時期的樣品反轉錄的cDNA，取2μ 1用EASY Dilution(TaKaRa Code :D9160，Shiga, Japan)分別稀釋 IOiUO2UO3UO4,IO5UO6 倍作 為模板制作標準曲線，以 SpTryp-RT-F :5，-GGAATTGTGCAGGCTGTGG-3，和 SpTryp-RT-R 5，-ACGAAGAATCAAAGTAGGGATGGA-3，為引物，取稀釋100倍的模板為對象進行樣品測定；在ABI公司St印OnePlus V2. 0儀器上進行PCR反應，反應條件為95 "C10 秒 融解曲解條件95"C 15 秒60 "C 1 分鐘60"C 每隔 10 秒升 0.3°C反應結束后，將胰蛋白酶基因的Ct值代入標準曲線，換算出各自的起始模板量。 實驗中以ISSrRNA基因作為參比基因。將胰蛋白酶基因的計算所得的模板量除以同一個樣 品中的ISSrRNA基因模板量，即是胰蛋白酶基因的相對表達水平。用胰蛋白酶基因的相對表達水平的結果來代表青蟹該時期的消化能力，可以比較 各個時期投餌量的相對數量，從而預測該時期的投餌量的需求。在青蟹各個潘狀幼體期間，發現胰蛋白酶的表達水平有各自的變動規律，從而可 以通過檢測即時的胰蛋白酶的表達來預測該時期處于蛻殼周期的哪一個階段。SEQUENCE LISTING<110>中國水產科學研究院東海水產研究所<120>擬穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列及其克隆方法和應用<160>4<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>881<212>cDNA<213> 擬穴青蟹(Scylla paramamosain)<400>1gactcgtatc catcctgggc agtcatgaag accctcgtgc tgtgcctgct tgttgccggg 60gccttagccg ccccatcccg caagcccacc ttccgtcggg gactgaacag gattgttggc 120ggtgaggaca cagttcacgg cgaatttcag taccaactta gccttcaaga tacgtcgtac 180agcaatccat ggcacttctg cggtggtacc ctgtacaatg agcactgggg catcactgct 240tgtcactgtc tgcagtatga tgtggataat ccaggaattg tgcaggctgt ggctggtgaa 300tacactcttg aggcaaatga cggttccgag caggcagcaa gactggatga gatcatcctc 360catccctact ttgattcttc gttactcgtt aacgacgtcg ccctcattca ctttccgcaa 420acaatggttt atgacgatta cgttaatccc atcggtcttc aagaagaaaa agagcttgta 480ggcgtcgagt gcaccgtcac gggatgggga gctttgtcag agggagggag tgccgccaca 540gtcttgcaga aggttcatgt ccctactgtg tccgatgagg aatgtagaat atcttactac 600ggtattgaag attccatgat ctgtgctgga tatcccgagg gaggaaagga cgcctgccag 660ggtgactctg gtggacctat ggtgtgcaag ggatacctta ccggcatcgt gtcctggggc 720tacggctgtg ctcgccccaa ctacccgggg gtctacacgg aggtggccta ctttgtggat 780tggattattg ccaatgctgt ataaattgta ccattgatat gatcaaaaca tggcacatca 840aattaaatac aatatggtgg tcgaaaaaaa aaaaaaaaaa a881<210>2
<211>259<212>PRT<213> 擬穴青蟹(Scylla paramamosain)<400>2 Met Lys Thr Leu Val Leu Cys Leu Leu Val Ala Gly Ala Leu Ala151015Ala Pro Ser Arg LysPro Thr Phe Arg Arg GlyLeu Asn Arg lie202530Val Gly Gly Glu AspThr Val His Gly Glu PheGln Tyr Gln Leu354045Ser Leu Gln Asp ThrSer Tyr Ser Asn Pro TrpHis Phe Cys Gly505560Gly Thr Leu Tyr AsnGlu His Trp Gly lie ThrAla Cys His Cys657075Leu Gln Tyr Asp ValAsp Asn Pro Gly lie ValGln Ala Val Ala808590Gly Glu Tyr Thr LeuGlu Ala Asn Asp Gly SerGlu Gln Ala Ala95100105Arg Leu Asp Glu lielie Leu His Pro Tyr PheAsp Ser Ser Leu110115120Leu Val Asn Asp ValAla Leu lie His Phe ProGln Thr Met Val125130135Tyr Asp Asp Tyr ValAsn Pro lie Gly Leu GlnGlu Glu Lys Glu140145150Leu Val Gly Val GluCys Thr Val Thr Gly TrpGly Ala Leu Ser155160165Glu Gly Gly Ser AlaAla Thr Val Leu Gln LysVal His Val Pro170175180Thr Val Ser Asp GluGlu Cys Arg lie Ser TyrTyr Gly lie Glu185190195Asp Ser Met lie CysAla Gly Tyr Pro Glu GlyGly Lys Asp Ala200205210Cys Gln Gly Asp SerGly Gly Pro Met Val CysLys Gly Tyr Leu215220225Thr Gly lie Val SerTrp Gly Tyr Gly Cys AlaArg Pro Asn Tyr230235240Pro Gly Val Tyr ThrGlu Val Ala Tyr Phe ValAsp Trp lie lie245250255Ala Asn Ala Val
<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><221>prim_bind<222>(1). . (19)<223>根據cDNA設計的SpTryp-RT上游引物<400>3ggaattgtgc aggctgtgg19<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>prim_bind<222>(1). . (24)<223>根據cDNA設計的SpTryp-RT下游引物<400>4
acgaagaatc aaagtaggga tgga 2權利要求
一種擬穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列，如SEQ ID NO1所示a.序列特征長度881bp；類型核酸；鏈型雙鏈；拓撲結構線性；b.分子類型cDNAc.假設否；d.反義否；e.最初來源擬穴青蟹(Scylla paramamosain)。
2.根據權利要求1所述的一種擬穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列，其特征在于所述的 擬穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列長度為881bp，其中開放閱讀框位于25-804位核苷酸。
3.根據權利要求1所述的一種擬穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列，其特征在于根據 重復試驗所獲得的序列與所述的SEQ ID NO. 1中從核苷酸第25-804位的核苷酸序列具有 70%以上的同源性，或者與SEQ ID NO. 1中從核苷酸第25-804位的核苷酸序列雜交。
4.根據權利要求1所述的一種擬穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列，其特征在于所述的 序列具有如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、其保守性變異多肽、其活性片段、其金 屬取代物，其脂肪酸酞化物，其高級醇醋化物或其烷基胺化物。
5.根據權利要求4所述的一種擬穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列，其特征在于所述的 SEQID NO 2氨基酸序列，根據全程cDNA推導出擬穴青蟹胰蛋白酶共259個氨基酸殘基，分 子量為28. 15KDa，等電點pi為4. 49。
6.根據權利要求1所述的一種擬穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列，其特征在于所述的 cDNA分子中包含8-100個連續核苷酸。
7.根據權利要求1所述的一種擬穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列，其特征在于所述的 cDNA分子轉化的宿主細胞為真核細胞。
8.一種擬穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列的克隆，包括(1)從擬穴青蟹的肝胰腺提取總RNA；(2)根據提取得到的RNA，構建cDNA質粒文庫；(3)cDNA文庫的鑒定和測序；(4)根據BLAST對比，獲得如SEQID NO 1所示的序列。
9.一種擬穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列在預測青蟹種苗餌料投喂量的應用。
10.一種擬穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列在預測青蟹蛻殼周期中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種擬穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列及其克隆方法和應用，擬穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列具有如SEQ ID NO1所示的序列，其克隆包括從擬穴青蟹的肝胰腺提取總RNA；構建cDNA質粒文庫；cDNA質粒文庫鑒定和測序分析；根據BLAST對比，獲得SEQ ID NO1所示的序列。本發明提供的擬穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列能夠預測青蟹種苗繁育過程中的投餌量以及蛻殼周期，以滿足人們對青蟹生活周期的掌握以及遺傳育種中的選用，減少餌料消耗量，提高種苗成活率，從而優化育苗過程。
文檔編號C12N15/57GK101838659SQ20101010213
公開日2010年9月22日 申請日期2010年1月28日 優先權日2010年1月28日
發明者喬振國, 張丹, 張鳳英, 皮妍, 石彥紅, 蔣科技, 鄭俊斌, 陶啟長, 馬凌波, 馬春艷 申請人:中國水產科學研究院東海水產研究所