香石竹ps1基因5`側翼未知序列的克隆方法
【專利摘要】本發明公開了一種香石竹PS1基因5'側翼未知序列的克隆方法，屬于生物工程【技術領域】。該方法根據同源序列設計5條簡并引物及2條特異引物，采用巢式PCR擴增，均能獲得香石竹PS1基因5'側翼未知序列。本發明方法具有操作簡便、操作限制少、克隆的片斷長、針對性強和成本低廉等特點。
【專利說明】香石竹PS1基因5'側翼未知序列的克隆方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程【技術領域】，是一種利用簡并引物和特異引物，通過巢式PCR擴增技術，基于香石竹PSl基因已克隆的部分DNA序列測定其5’側翼未知序列的方法。
【背景技術】
[0002]利用2η配子進行有性多倍化，比無性多倍化具有更高的適應性和雜合性，是一種有效的多倍體育種途徑。我們研究發現香石竹(Dianthus caryophyllus L)多為二倍體，大多數能產生低頻2n配子，紡錘體異常是香石竹2n配子形成的主要原因。在擬南芥研究中PSl基因調控紡綞體的方向，PSl基因突變能產生高頻率2n配子。研究香石竹PSl基因有助于揭示2n配子形成的分子遺傳學機制，而香石竹PSl基因的序列還未被克隆，這影響了香石竹多倍體育種進程。
[0003]擬南芥PSl基因包含7個外顯子和6個內含子，編碼1477個氨基酸，我們通過同源克隆的方法克隆了香石竹PSl基因部分DNA片斷，然而已克隆的部分DNA片斷位于基因的3’端，5’端還有長片斷的的序列未被克隆，且香石竹PSl基因表達量很低，通過5’ Race技術克隆5’端序列有一定難度。因此，通過DNA序列來克隆PSl側翼序列是成為首選，香石竹PSl基因由于序列結構的特點，采用H1-TAILPCR技術未能擴出側翼序列，因此十分有必要探索新的簡單、快速、高效的PSl基因側翼序列的克隆方法。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種操作簡便、成本低廉、高效準確PCR擴增方法，能夠基于已知PSl基因部分DNA序列測定其5’端側翼未知序列。
[0005]本發明的主要內容包括:同源比對PSl基因，根據保守序列，設計簡并引物；根據已克隆的香石竹PSl基因中間片斷，設計特異引物；以香石竹基因組DNA為模板，用簡并引物和特異引物進行二輪PCR (巢式PCR)擴增，并對其擴增片段進行測序，驗證是否是目的片斷。本發明所提供的香石竹PSl基因5’側翼未知序列的克隆方法，具體技術方案如下:
[0006]1.香石竹PSl基因5’側翼未知序列的克隆方法，包括以下步驟:
[0007](一)提取香石竹基因組DNA，采用巢式PCR擴增，以提取的香石竹基因組DNA為模板，分別用Al和B2為引物、A2和B2為引物、A3和B2為引物或A4和B2為引物進行第一輪PCR擴增；
[0008](二)再以首輪Al和B2為引物的PCR擴增產物為模板，用A2和BI為引物進行第二輪PCR擴增；或以用A2和B2為引物的PCR擴增產物為模板，用A3和BI為引物進行第二輪PCR擴增；或以用A3和B2為引物的PCR擴增產物為模板，用A4和BI為引物進行第二輪PCR擴增；或以A4和B2為引物的PCR擴增產物為模板，用A5和BI為引物進行第二輪PCR擴增；將第二輪PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產物回收純化后測序，驗證是否是目的片斷；所述Al引物的喊基序列如SEQ ID NO:1所不,所述A2引物的喊基序列如SEQ ID NO: 2所示，所述A3引物的堿基序列如SEQ ID NO: 3所示，所述A4引物的堿基序列如SEQ ID NO:4所示，所述A5引物的堿基序列如SEQ ID NO:5所示，所述BI引物的堿基序列如SEQ ID NO:6所示，所述B2引物的堿基序列如SEQ ID NO:7所示。
[0009]步驟(一)所述第一輪PCR擴增:反應總體系為25 μ L，其中IOXExTaqBuffer2.5 μ L, 25mM MgCl2L 5 μ L, 2.5mM dNTP2 μ L, 10 μ M Α1、Α2、Α3 或 Α4 引物分別為0.5-2 μ L, 10 μ M Β2 引物 0.5-2μ L，5U/y L Ex Taq0.1_0.2 μ L，基因組 DNAl μ L，余量為無菌水；擴增程序為:
[0010](I)、95°C lmin,
[0011](2)、94°C30s，
[0012](3)>60°C 45s ~lmin,
[0013](4)、72°C 2min30s ~3min,
[0014](5)、從步驟(2)至步驟(4)共進行10個循環，
[0015](6)、94°C 30s,
[0016](7)、25°C 2 ~3min，以 0.5°C /s 升至 72°C，
[0017](8)、72°C 2min30s ~3min,
[0018](9)、94°C 30s,
[0019](10)、58°C 45s ~lmin,`[0020](11)>72°C 2min30s ~3min,
[0021 ] (12)、從步驟(9 )至(11)共進行25個循環，
[0022](13)、72。。5min，
[0023](14)、4°C 終止；
[0024]步驟(二)所述第二輪PCR擴增:反應總體系為25 μ L，其中IOXExTaqBuffer2.5 μ L, 25mM MgCl2L 5 μ L, 2.5mM dNTP2 μ L, 10 μ M Α2、Α3、Α4 或 Α5 引物分別為0.5-2 μ L, 10 μ M BI 引物 0.5-2 μ L，5U/μ L Ex Taq0.1-0.2 μ L，模板 DNAl μ L，余量為無菌水；擴增程序為:
[0025](I )、94°C 3min,
[0026](2)、94°C 20s,
[0027](3)、65°C 45s ~lmin,
[0028](4)、72°C 2min30s ~3min,
[0029](5)、94°C 20s,
[0030](6)>68°C 45s ~lmin,
[0031](7)、72°C 2min30s ~3min，
[0032](8)、94°C 20s,
[0033](9)>68°C 45s ~lmin,
[0034](10)、72°C 2min30s ~3min，
[0035](11)、94°C 20s，
[0036](12)、50°C 45s ~lmin,
[0037](13)、72°C 2min30s ~3min，
[0038](14)、從步驟(2)至步驟(13)共進行13個循環，
[0039](15)、72°C 5min，[0040](16)、4°C 終止。
[0041]步驟(二)中第二輪PCR擴增的模板為首輪PCR擴增產物，該模板需稀釋10-100倍。
[0042]本發明與現有技術方法相比，具有如下的優點:
[0043]1、針對性強、操作簡便、高效準確，克服了由于香石竹PSl基因表達量很低且片斷長難以用現有5’ Race技術克隆5’端序列的困難，以及采用以隨機引物擴增的H1-TAILPCR技術擴增特異性不強的缺陷。
[0044]本發明基于同源比對PSl基因，根據保守序列，設計的簡并引物，以及根據已知香石竹PSl基因中間片斷設計的特異引物，針對性強，能有效地擴增出香石竹PSl基因5’側翼未知序列，其操作簡便，使用兩輪PCR就能擴增出香石竹PSl基因的5’側翼未知序列，所獲得的側翼序列較長，可獲得2000-5000bp的長度不等的片段。提高了序列的準確性，采用本發明方法僅需一天便能得到側翼序列，從而節省了大量的人力、時間和財力。
[0045]2.成本低廉。本發明采用簡單的PCR擴增，無需昂貴的儀器和試劑盒。
[0046]序列表中SEQ ID NO:1所示的是Al引物的堿基序列。
[0047]序列表中SEQ ID NO:2所示的是A2引物的堿基序列。
[0048]序列表中SEQ ID NO:3所示的是A3引物的堿基序列。
[0049]序列表中SEQ ID NO:4所示的是A4引物的堿基序列。
[0050]序列表中SEQ ID NO:5所示的是A5引物的堿基序列。
[0051]序列表中SEQ ID NO:6所示的是BI引物的堿基序列。
[0052]序列表中SEQ ID NO:7所示的是B2引物的堿基序列。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0053]圖1:香石竹PSl基因5’側翼未知序列的克隆原理示意圖。
[0054]圖2:第一輪PCR產物凝膠電泳圖。圖中:
[0055]M:Marker ；
[0056]泳道I，2:以Al和B2為引物PCR擴增產物；
[0057]泳道3，4:以A2和B2為引物PCR擴增產物；
[0058]泳道5，6:以A3和B2為引物PCR擴增產物；
[0059]泳道7，8:以A4和B2為引物PCR擴增產物。
[0060]圖3:第二輪PCR產物凝膠電泳圖。圖中:
[0061]M: Marker ;
[0062]泳道1，2:以用Al和B2為引物的PCR擴增產物為模板，以A2和BI為引物PCR擴
增產物；
[0063]泳道3，4:以用A2和B2為引物的PCR擴增產物為模板，以A3和BI為引物PCR擴
增產物；
[0064]泳道5，6:以用A3和B2為引物的PCR擴增產物為模板，以A^PBl為引物PCR擴增產物；
[0065]泳道7，8:以用A4和B2為引物的PCR擴增產物為模板，以A5和BI為引物PCR擴
增產物。【具體實施方式】
[0066]以下結合實施例對本發明方法作詳細的說明。下述實施例中使用的實驗方法無特殊說明，均為常規方法。所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0067]實施例1簡并引物和特異引物的設計
[0068](I)擴增PSl基因5’側翼未知序列的簡并引物的設計:通過同源比對PSl基因，根據保守序列，設計5條簡并引物，分別命名為Al、A2、A3、A4和A5，所述Al引物的堿基序列如SEQ ID NO:1所示。所述A2引物的堿基序列如SEQ ID NO: 2所示。所述A3引物的堿基序列如SEQ ID N0:3所示。所述A4引物的堿基序列如SEQ ID N0:4所示。所述A5引物的喊基序列如SEQ ID NO:5所不。
[0069](2)依據香石竹已克隆的PSl基因中間片斷設計了 2條特異引物，分別命名為BI和B2，所述BI引物的堿基序列如SEQ ID NO:6所示。所述B2引物的堿基序列如SEQ IDNO:7所示。
[0070]上述引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。
[0071]實施例2香石竹PSl基因5’側翼未知序列的克隆
[0072](一)采用CTAB法提取香石竹基因組DNA，采用巢式PCR擴增，以提取的香石竹基因組DNA為模板，以Al和B2為引物進行第一輪PCR擴增:反應總體系為25 μ L，其中IOXExTaqBuffer2.5 μ L, 25mM MgCl2L 5 μ L, 2.5mM dNTP2 μ L，10 μ M Al 弓丨物 I μ L，10 μ M B2 引物I μ L，5U/ μ L Ex Taq0.15 μ L，模板 DNAl μ L，余量為無菌水；
[0073]擴增程序為:`[0074](I)、95°C Imin,
[0075](2)、94°C 30s,
[0076](3)、60。。lmin,
[0077](4)、72°C 2min30s,
[0078](5)、從步驟(2)至步驟(4)共進行10個循環，
[0079](6)、94°C 30s,
[0080](7)、25°C 2min,以 0.5°C /s 升至 72°C，
[0081](8)、72°C 2min30s,
[0082](9)、94°C 30s,
[0083](10)、58°C lmin，
[0084](11)、72°C 2min30s,
[0085](12)、從步驟(9 )至(11)共進行25個循環，
[0086](13)、72°C 5min，
[0087](14)、4°C 終止；
[0088]第一輪PCR擴增進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得的片段如圖2中泳道1、2。
[0089](二)再以首輪Al和B2為引物的PCR擴增產物為模板，模板稀釋10倍，用A2和BI為引物進行第二輪PCR擴增；將第二輪PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產物回收純化后測序，所獲得的片斷為包括已知序列在內的目的片斷。獲得的目的片段如圖3中泳道1、2。[0090]所述第二輪PCR擴增:反應總體系為25 μ L，其中10 X Ex TaqBuffer2.5 μ L，25mM MgCl2L 5 μ L, 2.5mM dNTP2yL,10yM A2 引物 I μ L, 10 μ M BI 引物 I μ L, 5U/ μ L ExTaq0.15 μ L，模板DNAl μ L，余量為無菌水；擴增程序為:
[0091](1)、94°C 3min，
[0092](2)、94°C 20s,
[0093](3)、65°C lmin,
[0094](4)、72°C 2min30s,
[0095](5)、94°C 20s,
[0096](6)>68°C lmin,
[0097](7)、72°C 2min30s,
[0098](8)、94°C 20s,
[0099](9)、68°C lmin,
[0100](10)、72°C 2min30s,
[0101](11)、94°C 20s，
[0102](12)、50°C lmin，
[0103](13)、72°C 2min30s，
[0104](14)、從步驟(2)至步驟(13)共進行13個循環，
[0105](15)、72°C 5min，
[0106](16)、4°C 終止。
[0107]實施例3—實施例5
[0108]實施例3—實施例5均為香石竹PSl基因5’側翼未知序列的克隆，除表1中所列操作不同外，其余操作與實施例2相同，不再贅述。詳見表1。
[0109]實施例1一實施例5采用巢式PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物片段結果見圖2-圖3、表2。
[0110]表2實施例1一實施例5采用巢式PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物片段
結果
[0111]
【權利要求】
1.香石竹PSl基因5’側翼未知序列的克隆方法，其特征在于: (一)提取香石竹基因組總DNA，采用巢式PCR擴增，以提取的香石竹基因組總DNA為模板，分別用Al和B2為引物、A2和B2為引物、A3和B2為引物或A4和B2為引物進行第一輪PCR擴增； (二)再以首輪Al和B2為引物的PCR擴增產物為模板，以A2和BI為引物進行第二輪PCR擴增；或以用A2和B2為引物的PCR擴增產物為模板，用A3和BI為引物進行第二輪PCR擴增；或以用A3和B2為引物的PCR擴增產物為模板，用A4和BI為引物進行第二輪PCR擴增；或以用A4和B2為引物的PCR擴增產物為模板，用A5和BI為引物進行第二輪PCR擴增；將第二輪PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產物回收純化后測序，驗證是否是目的片斷；所述Al引物的喊基序列如SEQ ID NO:1所不,所述A2引物的喊基序列如SEQID NO:2所示，所述A3引物的堿基序列如SEQ ID NO:3所示，所述A4引物的堿基序列如SEQ ID NO:4所示，所述A5引物的堿基序列如SEQ ID NO:5所示，所述BI引物的堿基序列如SEQ ID NO:6所示，所述B2引物的堿基序列如SEQ ID NO:7所示。
2.根據權利要求1所述的香石竹PSl基因5’側翼未知序列的克隆方法，其特征在于:步驟(一)所述第一輪PCR擴增:反應總體系為25μ L，其中IOXEx TaqBuffer2.5 μ L, 25mMMgCl2L 5 μ L, 2.5mM dNTP2 μ L，10 μ M Al、A2、A3 或 A4 引物分別為 0.5-2 μ L，10 μ M Β2 弓丨物0.5-2 μ L，5U/ μ L Ex Taq0.1-0.2 μ L，基因組DNAl μ L，余量為無菌水;擴增程序為:
(1)、95。。Imin,
(2)、94°C30s,
(3)>60°C45s ~lmin,
(4)、72°C2min30s ~3min， (5)、從步驟(2)至步驟(4)共進行10個循環，
(6)、94°C30s,
(7)、25°C2 ~3min，以 0.5°C /s 升至 72°C，
(8)、72°C2min30s ~3min，
(9)、94°C30s,
(10)、58°C45s ~lmin，
(11)、72°C2min30s ~3min， (12)、從步驟(9)至(11)共進行25個循環，
(13)、72。。5min, (14)、4°C終止； 步驟(二)所述第二輪PCR擴增:反應總體系為25yL，其中IOXEx TaqBuffer2.5 μ L,25mM MgCl2L 5 μ L，2.5mM dNTP2 μ L，10 μ M A2、A3、A4或A5 引物分別為 0.5-2 μ L，10 μ M BI引物0.5-2yL，5U/yL Ex Taq0.1_0.2 μ L，模板DNAl μ L，余量為無菌水；擴增程序為:
(1)、94°C3min,
(2)、94°C20s,
(3)>65°C45s ~lmin,
(4)、72°C2min30s ~3min，
(5)、94°C20 s,(6)>68°C45s ~lmin,(7)、72°C2min30s ~3min，(8)、94°C20s,(9)>68°C45s ~lmin,(10)、72°C2min30s ~3min，(11)、94°C20s,(12)、5(TC45s ~lmin，(13)、72°C2min30s ~3min，(14)、從步驟(2)至步驟(13)共進行13個循環，(15)、72°C5min,(16)、4°C終止.
3.根據權利要求1或2所述的香石竹PSl基因5’側翼未知序列的克隆方法，其特征在于:步驟(二)中第二輪PCR擴增的模板為首輪PCR擴增產物，該模板需稀釋10-100倍。
【文檔編號】C12N15/10GK103756997SQ201410022701
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月18日 優先權日:2014年1月18日
【發明者】周旭紅, 莫錫君, 桂敏, 吳學尉, 盧珍紅, 田敏, 余蓉培, 龍江 申請人:云南云科花卉有限公司, 云南集創園藝科技有限公司