專利名稱：fengycin類脂肽對鐮刀菌抗性作用強弱的測定方法
技術領域：
本發明涉及一種脂肽類抗生素fengycin對鐮刀菌抗性作用強弱的衡量方法；具體說的是一種衡量fengycin類脂肽對產色素鐮刀菌抗性作用強弱的方法
背景技術：
鐮刀菌屬(又稱鏈孢霉屬)是引起植物枯萎病的世界性土傳病害真菌，造成病田大面積減產甚至絕產。所以作為重要的靶標菌，鐮刀菌廣泛應用于篩選農用抗生素及衡量抗生素抗性作用強弱方面。傳統衡量抗生素對真菌的抗性作用強弱的方法有兩種A、將待測真菌制成菌懸液或孢子懸液混于培養基中倒平板，將抗生素溶液加入牛津杯或載于濾紙片上置于含菌培養基上，待培養基長滿菌體后，測量抗生素產生的抑菌圈直徑。直徑越大，說明抗生素的抗性作用越強，此法適用于酵母類真菌(如白色念珠菌)或易產孢霉菌(如青霉菌)。如圖1。 B、將新鮮菌塊接種于培養基中央，菌塊四周放置加有抗生素溶液的牛津杯或載有抗生素的濾紙片，置于培養箱中培養至菌絲長滿平板，測量抗生素產生的抑菌圈直徑，直徑越大，說明抗性作用越強，該法適用于生長速度快的絲狀真菌(如立枯絲核菌)。這兩種方法均可以較準確快速的衡量抗生素抗性強弱，且為科學界最普遍使用的方法。如圖2。然而，實際工作中，多項實驗表明上述兩種方法均不適用于快速、高效并準確地檢測抗生素對鐮刀菌的抗性作用效果。原因有二 其一，鐮刀菌生長緩慢，產生孢子少，一般需要配制專門的產孢培養基搖瓶培養至少一周時間才能夠產生足夠量的孢子，耗時長；再將孢子施用于培養基作下一步的抗性實驗，再培養，觀察現象，方法繁瑣，十分耗力，因此不適用于方法A ；其二，鐮刀菌極其緩慢的生長速度致使其長滿平板所需至少一周時間，有的甚至達到半個月，如此長的作用時間致使一些抗生素已經失去作用效果，表現為菌絲體蔓延過最初抗生素產生的抑菌圈，抑菌圈在長時間培養后逐漸縮小甚至消失(如圖幻，如果此時仍舊采用抑菌圈直徑來衡量抗生素的抑菌力，很明顯已經不可行，所以也不適用于方法 B0雖然某些科研工作者采用改良的方法B(以下稱為方法C)，在培養時間為3天左右時(此時能夠觀察到菌絲體在抗生素周圍生長至弧形如圖4)，通過測量牛津杯或濾紙片外沿至菌體外沿的距離來判斷抑菌力大小，此法雖可行，但產生的誤差較大，準確性不高，且測量時難度大。因此，目前對待生長緩慢且不易產孢子的絲狀真菌的拮抗活性測定上，尚沒有一種高效準確且簡單易行的方法。鐮刀菌的分子孢子子座多數帶有顏色，表現為培養時間足夠長時產生各種顏色， 當!^ngycin類脂肽作用于生物膜時，當達到一定濃度，會引起膜泄露，導致色素溢出，表現出生物活性。直觀現象為抗生素有作用效果的部位周圍會產生明顯的色素圈，該色素圈的顏色明顯深于菌體產生的普通色素
發明內容
為了克服傳統方法帶來的不便及其局限性，針對鐮刀菌的特點，本發明旨在提供一種操作簡單易行，結果快速可靠的衡量fengycin類脂肽抗生素對產色素鐮刀菌抗性強弱的方法為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案為1、目標菌株的初培養選取培養有新鮮的鐮刀菌菌株的PSA平板，用無菌打孔器挖取直徑為6mm-8mm的圓形菌塊，放置于無菌PSA平板中央，于培養對-4他，這段時間是鐮刀菌生長的適應階段。此時菌塊直徑約長至2cm左右；2、加牛津杯或濾紙片將牛津杯放置在菌塊四周，加入配置好的待測fengycin 溶液，或將載有fengycin的濾紙片貼在菌塊周圍(牛津杯或濾紙片距離菌塊外沿約 1. 5-2cm)，以無菌水或溶解fengycin的溶劑作為陰性對照；3、抗性測定將經步驟2處理過的平板于15-25°c再培養4-9天，直至菌體長滿平板，在該溫度范圍內鐮刀菌菌絲體會迅速擴散且產生的干擾性色素少，此時可以觀察到有抗性作用的fengycin所在的牛津杯或濾紙片邊緣會產生明顯的色素圈，此時鐮刀菌可能本身也會產生一定色素，但fengycin周圍的色素圈會較正常菌絲所產色素的顏色深，所以色素圈邊緣仍舊很清晰，此時用游標卡尺可輕易測量該色素圈直徑。4、抗性作用強弱的衡量濃度越大，色素圈直徑越大，不同種fengycin在同濃度同載樣量下，色素圈直徑越大，抗性作用越強。如圖5。測定抗生素對鐮刀菌的最小抑菌濃度(MIC)，通過色素圈與濃度的標準曲線來通過色素圈直徑判定抗生素濃度。本發明具有如下優點1、效率高本發明較方法A省去了單獨培養孢子的搖瓶時間(一般需7d)，在5-9d 可以完成測定。2、操作簡單與傳統的方法A相比，不需要配制特殊的產孢培養基，也不需要進行一系列復雜的操作，只需接種菌塊、加抗生素后測量結果即可。3、結果可靠經驗證，色素圈與濃度成直接對應關系，證明了該色素圈的產生是與 fengycin對鐮刀菌的抑菌作用成直接相關的。直接測量色素圈直徑的方法較方法C對抑菌圈直徑的估測更為準確可靠。本發明原則上也可應用于所有作用位點為生物膜的抗生素對與鐮刀菌生長性狀相似的絲狀真菌的抗性作用強弱的衡量上。
圖1為方法A對抗生素的抗真菌作用的衡量方法；圖2方法B對抗生素的抗真菌作用的衡量方法；圖3方法B不適用于鐮刀菌的圖示；圖4方法C對抗生素抗鐮刀菌抗性作用的測量，測量困難且不準確；圖5不同濃度Ciefengycin A作用于棉花枯萎病菌產生的色素圈；圖6C16fengyCin A作用于棉花枯萎病菌產生的色素圈半徑與濾紙片中抗生素質量M的擬合曲線；圖7C16fengyCin A作用于黃瓜枯萎病菌產生的色素圈半徑與濾紙片中抗生素質量M的擬合曲線；圖SCiefengycin A作用于小麥赤霉病菌產生的色素圈半徑與濾紙片中抗生素質量M的擬合曲線；
具體實施例方式本發明是一種衡量fengycin類脂肽對產色素鐮刀菌抗性作用強弱的方法采用色素圈代替抑菌圈作為衡量標準，采用平板抑菌實驗(杯碟法、打孔法或濾紙片法)進行操作，采用溫度分段法培養指示菌。本發明具有如下優點效率高，操作簡單，結果可靠，解決了抗生素對鐮刀菌抗性測量上的難題。IlJ ^ C16fengycin A )(寸豐帛 # 才古,_ 胃(Fusarium oxysporumf. sp. vasinfectum)的最低作用濃度1、目標菌株的初培養選取培養有新鮮的棉花枯萎病菌株的PSA平板，用無菌打孔器挖取直徑為8mm的圓形菌塊，放置于無菌PSA平板中央，于培養48h，此時菌塊直徑約長至2cm左右。2、配制用無菌PBS (pH = 8. 5)半數濃度稀釋的Ciefengycin A溶液(一種脂肽類抗生素，對絲狀真菌抗性作用效果好)2mg/ml至125μ g/ml (濃度分別為2mg/ml、lmg/ml、 500 μ g/m、250 μ g/m、125 μ g/ml)，每張濾紙片上載樣10 μ 1，每個濃度做三個重復，將載有不同濃度CiefengycinA的濾紙片等距貼在棉花枯萎病菌塊周圍(濾紙片距離菌塊外沿約 1. 5cm)，每個平板放置5張濾紙片，以無菌PBS (pH = 8. 5)溶液作為陰性對照。3、第二段培養將載有指示菌(黃瓜枯萎病菌)和Ciefengycin A的平板倒置于17°C培養箱中培養7天，此時菌體已長滿平板，可以觀察到在有抗性作用濃度下的 C16fengycin A所在的濾紙片邊緣產生明顯的色素圈，如圖5，色素圈邊緣很清晰。4、抗性作用強弱的衡量用游標卡尺測量不同濃度下色素圈的直徑。發現濃度越大，色素圈直徑越大，在一定濃度以下不產生色素圈，陰性對照不產生色素圈，色素圈直徑d 與C16fengycin A濃度的關系見表1。5、曲線的繪制采用Minitab 15對C16fengycin A的濃度(取三個平行濃度的平均值)和色素圈直徑做擬合曲線，發現不同濃度Ciefengycin A產生的色素圈半徑r的平方(r2)與濾紙片上C16fengyCin A質量M的對數(IgM)呈線性關系，IgM = 0. 007042r2-0. 1412，如圖6，符合抗生素在瓊脂中的濃度梯度擴散規律，公式IgM = ar2+b, 其中M為牛津杯中或濾紙片上抗生素的總量，M = CV，C為抗生素濃度，mg/ml，V為加液量， r為色素圈半徑，mm, a、b為常數，與擴散系數，抗生素擴散時間，培養基厚度及最低抑菌濃度等有關，在該實施例中，a = 0. 007042，b = -0. 1412。6、最低作用濃度(minimum interaction concentration)標準曲線中 r 為 0 時所求得的濃度為fengycin對鐮刀菌的最低作用濃度，該實施例中求得的Ciefengycin A對棉花枯萎病菌的最低作用濃度為72. 24 μ g/ml 0實施例 2 測定 C16fengycin A 對黃瓜枯萎病菌(Fusarium. oxysporumf. sp. cucumerinum)及小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)的最低作用濃度與實施例1不同之處在于,指示菌為黃瓜枯萎病菌(Fusarium. oxysporum f. sp. cucumerinum)或小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)，培養溫度及培養時間初培養為30°C培養48h，加載Ciefengycin A后的第二段培養條件為10°C培養6天。操作方法與實施例1完全相同，最后得到的數據結果分別見表2及表3。采用Minitab 15對C16fengyCin A的濃度和色素圈直徑做擬合曲線，發現不同濃度 C16fengycin A促使黃瓜枯萎病菌及小麥赤霉病菌產生的色素圈半徑r的平方(r2)與濾紙片上Ciefengycin A質量M的對數(IgM)仍舊呈線性關系，如圖7及圖8，其線性公式分別為 IgM = 0. 005934r2+0. 1040 及 IgM = 0. 006863r2-0. 04751，符合抗生素在瓊脂中的濃度梯度擴散規律，并可求出最低作用濃度分別為127. 06μ g/ml和89. 64μ g/ml。實施例3測定新型fengycin家族對棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporum f. sp. vasinfectum)、黃瓜枯萎病菌(Fusarium. oxysporumf. sp. cucumerinum)及小麥赤霉病菌 (Fusarium graminearum)白勺最/[氐作用濃度與實施例1不同之處在于，fengycin抗生素為新型fengycin家族抗生素，與 fengycin A不同之處在于，脂肽環內第六位氨基酸由Abu替代Ala，指示菌為棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum)、黃瓜 古萎病菌(Fusarium. oxysporum f. sp. cucumerinum)或小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)；操作方法與實施例1完全相同，最后得到的色素圈與濃度的對應關系與實施例1
相一致。實施例4 一劑量法(標準曲線法)對發酵液中與fengycin類脂肽同質抗生素的效價測定指示菌的兩段培養操作方法與實施例1相同。采用一劑量法(標準曲線法)，參見參考文獻(馬緒榮等，2001，藥品微生物學檢驗手冊)，將傳統的抑菌圈改為本專利所述色素圈，通過發酵液作用于鐮刀菌產生的色素圈直徑，通過標準曲線可以求得發酵液中與fengycin類脂肽同質抗生素的總濃度，并轉換成發酵液所含效價。表1不同濃度C16 fengycin A導致棉花枯萎病菌產生的色素圈
權利要求
1.一種fengycin類脂肽對鐮刀菌抗性作用強弱的測定方法，其特征在于采用平板抑菌實驗進行操作，通過比較fengycin類脂肽作用于鐮刀菌而產生的色素圈直徑的方法來衡量抗生素抗性強弱。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于所述平板抑菌實驗為杯碟法、打孔法或濾紙片法。
3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于所用指示菌為產色素鐮刀菌。
4.按照權利要求1所述的方法，其特征在于具體操作過程1)目標菌株的初培養將帶有新鮮的鐮刀菌菌株的6mm-8mm的圓形菌塊，放置于無菌 PSA平板中央，于培養對-4他，這段時間是鐮刀菌生長的適應階段；2)加牛津杯或濾紙片將牛津杯放置在菌塊四周，加入配置好的待測fengycin溶液； 或將載有fengycin的濾紙片貼在菌塊周圍；或于菌塊周圍打孔，于孔內放入fengycin溶液；孔、牛津杯或濾紙片距離菌塊外沿約1. 5-2cm,以無菌水或溶解fengycin的溶劑作為陰性對照；3)抗性測定將經步驟2處理過的平板于15-25°C再培養4-9天，直至菌體長滿平板， 在該溫度范圍內鐮刀菌菌絲體會迅速擴散且產生的干擾性色素少，此時可以觀察到有抗性作用的fengycin所在的孔、牛津杯或濾紙片邊緣會產生明顯的色素圈，此時鐮刀菌可能本身也會產生一定色素，但fengycin周圍的色素圈會較正常菌絲所產色素的顏色深，所以色素圈邊緣仍舊很清晰，此時用游標卡尺可輕易測量該色素圈直徑；抗性作用強弱的衡量濃度越大，色素圈直徑越大，不同種fengycin在同濃度同載樣量下，色素圈直徑越大，抗性作用越強。
5.按照權利要求1或4所述的方法，其特征在于所述抗生素為fengycin類脂肽，或其他作用于生物膜，能夠引起膜破裂導致指示菌色素釋放的抗生素。
6.按照權利要求4所述的方法，其特征在于所述fengycin溶液的濃度為IOyg/ ml-2mg/ml，溶劑為水或PBS緩沖液。
全文摘要
本發明涉及一種脂肽類抗生素fengycin對鐮刀菌抗性作用的衡量方法。具體說的是一種衡量fengycin類脂肽對產色素鐮刀菌抗性作用強弱的方法采用色素圈代替抑菌圈作為衡量標準，采用平板抑菌實驗(杯碟法、打孔法或濾紙片法)進行操作，采用溫度分段法培養指示菌。本發明具有如下優點效率高，操作簡單，結果可靠，解決了抗生素對鐮刀菌抗性測量上的難題。
文檔編號C12Q1/18GK102199654SQ20101013325
公開日2011年9月28日 申請日期2010年3月26日 優先權日2010年3月26日
發明者王書錦, 胡江春, 陳麗麗 申請人:中國科學院沈陽應用生態研究所