檢測小管福壽螺體內廣州管圓線蟲的試劑盒及方法

專利名稱：：檢測小管福壽螺體內廣州管圓線蟲的試劑盒及方法
技術領域：
：本發明屬于生物工程領域，尤其一種檢測試劑盒，具體來說是一種基于PCR技術檢測小管福壽螺體內廣州管圓線蟲的試劑盒，及對應的檢測方法。
背景技術：
：廣州管圓線蟲(Angiostrongyluscantonensis)是1933年由我國學者陳心陶在廣東省廣州市黑家鼠(Rattusrattus)和褐家鼠(R.norvegicus)肺部發現并命名的，屬圓線蟲目(Strongylata)、后圓線蟲科(Metastronylidae)、管圓線蟲屬(Angiostrongylus)。主要分布在太平洋、印度洋某些島嶼和東南亞國家。廣州管圓線蟲的發育過程分為幼蟲和成蟲階段，幼蟲分為I期、II期、III期、IV期和V期幼蟲。廣州管圓線蟲成蟲寄生在鼠肺動脈內，雌蟲產卵于血流中，蟲卵隨血流到肺毛細血管，在末梢動脈血管內形成栓塞并發育，成熟后孵出第一期幼蟲，幼蟲穿過毛細血管進入肺泡，在呼吸道沿氣管上行到達咽喉部，再吞入消化道，最后隨糞便排出體外。當第一期幼蟲被軟體動物吞食或主動鉆入其體內而感染發育成第三期幼蟲(感染期幼蟲)。當鼠吞食含感染期幼蟲的軟體動物或飲用了受污染的水后，幼蟲在鼠胃內蛻鞘，并進入腸壁小血管，經肝或淋巴管、胸導管被帶至右心，再經肺部血管至左心，由此到達身體各部器官發育為成蟲并產卵，完成廣州管圓線蟲的一個生活周期。人類多因食用含有第III期活幼蟲的淡水螺肉而感染，也可通過食用轉續宿主如魚、蝦、蛙等或污染的水及蔬菜等而感染，皮膚接觸也有可能導致感染。當有活力的III期幼蟲被人誤食，廣州管圓線蟲在人體內移行，穿過人體消化道壁進入血管，順血流進入腦部，引起中樞神經系統的損害和炎癥反應。廣州管圓線蟲病患者臨床癥狀多數以中樞神經系統損害為主的腦膜腦炎和腦膜炎癥狀，主要表現為急性頭痛、頸項強直、腦膜刺激癥等，嚴重者亦可引起死亡。目前，全球報道病例已超過2800多例。在我國大陸第一例廣州管圓線蟲病例報道于1984年，直到1996年只有3例病例。然而，隨著人類飲食習慣的變化，病例數顯著增加，在過去的十年里，中國大陸發生了9次暴發，臺灣3次，尤其是在我國近期的幾次暴發中，病例數超過300多例。隨著該蟲中間宿主的擴散蔓延及食用螺肉者增多，發病人數呈繼續增長的態勢，且有從南方沿海向北方蔓延的趨勢，其蔓延的速度之快引起人們的重視。廣州管圓線蟲病已經引起了我國衛生部門和世界衛生組織的重視。衛生部在2003年將廣州管圓線蟲病列為我國“新發傳染病”，2005年再一次警告人們警惕包括廣州管圓線蟲在內的嚴重威脅人類健康的食源性寄生蟲病。從生活史可看出，完成生活史周期必須要以鼠作為終宿主及某些螺類作為中間宿主。目前在我國有報道的廣州管圓線蟲中間宿主有小管福壽螺(Pomaceacanaliculate)、褐云瑪瑙螺、皺疤堅螺、短梨巴蝸牛、同型巴蝸牛、中華圓田螺、環棱螺及蛞蝓等。在眾多中間宿主中，小管福壽螺是廣州管圓線蟲的重要中間宿主，其廣州管圓線蟲自然感染率最高(65%)，在溫州地區其自然感染率高至69%。近年來溫州與福州地區以及近期北京市廣州管圓線蟲病的暴發均因食用福壽螺引起。小管福壽螺已成為傳播廣州管圓線蟲的優勢種群之一。小管福壽螺為軟體動物門(Mollusca)，腹足綱(Gastropoda)，前腮亞綱(Prosobranchia)，ifIIliilMg(Caenogastropoda)，中月復g(Mesogastropoda)，Mil超科(Ampullarioidae)，瓶螺科(Ampullariidae)。原產于南美洲亞馬遜河流域，由巴西華僑以高蛋白質食物引進臺灣，1981年引入廣東，在該省作為特種經濟作物廣為養殖，后又被引入到其他省份養殖。近十幾年來，張瑩珍等報道福州市區福壽螺的感染率為20.85%(49/235)，林金祥等報導福建長樂福壽螺的感染率為40.0%，羅斌等報告福州市福壽螺感染率為18.82%，李莉莎等報告福建省連江南安兩地福壽螺感染率為16.64%，柳堅等調查了海南定安縣的小管福壽螺顯示感染率為7.1%(10/140)，孫慧冰等報道廣東肇慶市小管福壽螺感染率為10.79%，張志強等報告茂名市福壽螺的感染率為20.14%，鄧卓暉等報道廣東省小管福壽螺平均感染率為5.9%(172/2929)。目前，小管福壽螺的檢測方法，主要是基于顯微鏡的病原學檢測，包括直接沉淀鏡檢法、胃蛋白酶消化法和肺檢法。直接沉淀鏡檢法亦稱勻漿法，是將研磨的小管福壽螺的組織用脫氯水沉淀數次后鏡檢沉淀中幼蟲情況；胃蛋白酶消化法則是將研碎的組織用蛋白酶消化后鏡檢沉淀中的幼蟲情況；肺檢法是在光鏡下觀察肺囊中幼蟲結節的方法。然而，由于福壽螺體積較大而廣州管圓線蟲III期幼蟲(L3)相對較小，這些檢測方法對檢測者知識和技術要求較高，費時費力，且對于感染度較低的福壽螺漏檢率高，同時對于早期感染檢測困難。隨著分子生物學的飛速發展，PCR技術在敏感性和特異性上的優勢，已逐漸被用于寄生蟲病檢測上。但目前，仍沒有針對小管福壽螺體內廣州管圓線蟲的PCR檢測方法。然而在檢測軟體動物時，常常因軟體動物中存在大量PCR抑制物而導致PCR反應失敗，而出現假陰性情況的發生。
發明內容本發明要解決的技術問題在于提供一種檢測小管福壽螺體內廣州管圓線蟲的試劑盒及方法，為現場快速檢測小管福壽螺提供一種新的、更為快速有效的病原體檢測手段。為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現在本發明的一方面，提供一種檢測小管福壽螺體內廣州管圓線蟲的試劑盒，所述的試劑盒中含有=(A)CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)裂解液(含有2%CTAB，20mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)，0·lmol/LTris-Cl(三羥甲基氨基甲烷)，1.4mol/LNaCl(氯化鈉))；(B)巰基乙醇；(C)蛋白酶K(20mg/mL)；(D)苯酚、氯仿和異戊醇的混合液，苯酚氯仿異戊醇(25241)；(E)Tris-EDTA緩沖液，該緩沖液含IOmmol/LTris-Cl和Immol/LEDTA，pH為8.0;(F)2XMasterPCRMix；(G)引物(10μmol/L)，所述引物含有引物1和引物2；引物1(此對序列是已報道的)上游5，-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3，(SEQIDNO1所示序列)下游5，-CCGGTCTGAACTCAGATCATGT_3，(SEQIDNO2所示序列)引物2(自己設計的)上游:5，-GCAAATGCTTTCGCTTTAGG-3，(SEQIDNO3所示序列)下游5，-AATGGCAGGGACGTAATCAG-3，(SEQIDNO4所示序列)。該試劑盒可抽提DNA100次，含有㈧CTAB裂解液50_70ml，(B)巰基乙醇800-1000μ1,(C)20mg/mL的蛋白酶K500-700μ1,(D)苯酚、氯仿和異戊醇的混合液120-200ml,(E)Tris-EDTA緩沖液6_15ml，(F)2XMasterPCRMixF750μ1,(G)IOymol/L的引物60μ1。在本發明的另一方面，提供了一種采用上述的試劑盒檢測小管福壽螺體內廣州管圓線蟲的方法，包括如下步驟1)小管福壽螺肺囊組織粉碎后，取彡lOOmg，加入(A)CTAB裂解液500-700μ1,(B)巰基乙醇8-10μ1以及(C)20mg/mL的蛋白酶K5_7μ1，60°C水浴5_10小時至完全消化；2)加入⑶苯酚、氯仿和異戊醇的混合液500-700μ1，充分混勻，常溫下10，000-16，OOOrpm離心IOmin；3)取上清，加入等體積的(D)苯酚、氯仿和異戊醇的混合液，充分混勻，常溫下10，000-16，OOOrpm離心IOmin；4)重復第3)步；5)取上清，加入2-3倍體積95%或無水乙醇，常溫下11，000-13，OOOrpm離心IOmin；6)棄上清，取沉淀，加入500μ170%或75%乙醇洗滌，常溫下10，000-13，OOOrpm離心5min；7)棄上清，沉淀自然或烘箱中烘干；8)加入(E)Tris-EDTA緩沖液60-150μ1溶解，_20°C保持備用；9)將步驟8)的產物進行PCR反應將雙蒸滅菌水5.9μ1，(F)2XMasterPCRMix7.5μ1,(6)1(^11101/1的引物0.6(^1，步驟8)獲取的DNA樣本1μ1，充分混勻后500-5000rpm簡短離心5_10s，進行PCR反應；10)PCR產物取6μ1進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶，判斷小管福壽螺感染情況。步驟9)中PCR反應的條件為95°C預變性5min后進行94°C變性lmin、56°C退火45s、72°C延伸Imin的35個循環的擴增，72°C延伸7min后保存。本發明的有益效果在于目前的各種PCR衍生技術中，多重PCR技術可同時實現檢測與假陰性控制。本發明在PCR反應體系中除特異性擴增廣州管圓線蟲的引物外，還加入一對特異性擴增小管福壽螺的引物，作為內參，采用該兩對引物(上述引物1和引物2)進行PCR反應可以避免假陰性情況的發生。本發明的創新點旨在建立一種多重PCR方法快速檢測方法應對這種以暴發形式出現的食源性寄生蟲病。為現場快速檢測小管福壽螺提供一種新的、更為有效的病原體檢測手段。本發明方法可檢測廣州管圓線蟲的最低濃度為120pg/μ1。實驗檢測153個小管福壽螺樣本，與肺檢法比較，敏感度達到93.8%，特異度為95.2%。本發明的試劑盒敏感性高、特異性強、重復性好，為基層展開小管福壽螺分子學檢測提供便利，同時檢測方法簡單實用。本發明的檢測小管福壽螺體內廣州管圓線蟲的試劑盒及檢測方法在小管福壽螺流行病學監測以及廣州管圓線蟲病暴發時食用螺檢測中有著重要的作用，擁有廣闊的應用前景。圖1是實施例4中多重PCR的1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖。具體實施例方式以下實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中采用的試劑如下A液CTAB裂解液(2%CTAB，20mmol/LEDTA，0.lmol/LTris-Cl,1.4mol/LNaCl)；B液巰基乙醇；C液蛋白酶K(20mg/mL)；D液苯酚、氯仿和異戊醇的混合液，其中，苯酚氯仿異戊醇為25241；E液Tris-EDTA緩沖液(10mmol/LTris-Cl,Immol/LEDTA,ρΗ8·0)；F液2XMasterPCRMix；G液引物(10μmol/L)，含有引物1和引物2引物1(此對序列是已報道的)上游5，-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3，(SEQIDNO1所示序列)下游5，-CCGGTCTGAACTCAGATCATGT_3，(SEQIDNO2所示序列)引物2(自己設計的)上游5，-GCAAATGCTTTCGCTTTAGG-3，(SEQIDNO3所示序列)下游5，-AATGGCAGGGACGTAATCAG-3，(SEQIDNO4所示序列)。其中，CTAB、巰基乙醇購自AMRESC0，EDTA,NaCl購自華美生物工程公司，Tris-Cl購自BIOBASICINC.，蛋白酶K購自Sigma公司，2XMasterPCRMix購自上海萊楓生物科技有限公司，苯酚購自所來報生物科技有限公司，氯仿、異戊醇購自上海化學化工公司。實施例1采用試劑盒進行小管福壽螺DNA抽提1)小管福壽螺肺囊組織粉碎后，取50mg左右，加入600μ1A液(CTAB裂解液(2%CTAB，20mmol/LEDTA，0.lmol/LTris-Cl,1.4mol/LNaCl)),9μ1B液(巰基乙醇)，6μ1C液(蛋白酶K(20mg/mL))，60°C消化過夜；2)加入600μ1D液(苯酚氯仿異戊醇(25241))，充分混勻，10，OOOrpm離心IOmin；3)取上清，加入等體積的D液，充分混勻，10,OOOrpm離心IOmin；4)重復第3)步；5)取上清，加入2倍體積無水乙醇，11，OOOrpm離心IOmin；6)棄上清，取沉淀，加入500μ175%乙醇洗滌，11，OOOrpm離心5min；7)棄上清，沉淀自然或烘箱中烘干；8)加入80μ1E液(Tris-EDTA緩沖液)溶解，_20°C保持備用。實施例2采用試劑盒進行已有DNA樣本的檢測1)PCR反應體系準備雙蒸滅菌水5.9μ1，F液(2XMasterPCRMix)7.5μ1，G液(10μmol/L的引物，含有引物1和引物2)0.6μ1，實施例1步驟8)完成后獲取的已有DNA樣本1μ1，充分混勻后500rpm簡短離心5s；2)PCR反應體系如下950C預變性5min940C變性1min560C退火45sI35個循環；72°C延伸1min」720C延伸7min3)PCR產物取6μ1進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶，判斷小管福壽螺感染情況。實施例3采用試劑盒進行小管福壽螺DNA抽提及檢測1)小管福壽螺肺囊組織粉碎后，取IOOmg左右，加入700μ1A液(CTAB裂解液(2%CTAB,20mmol/LEDTA，0.lmol/LTris-Cl,1.4mol/LNaCl)),10μ1B液(巰基乙醇)，7μ1C液(蛋白酶K(20mg/mL))，60°C消化過夜；2)加入700μ1D液(苯酚氯仿異戊醇(25241))，充分混勻，16，OOOrpm離心IOmin；3)取上清，加入等體積的D液，充分混勻，16，OOOrpm離心IOmin；4)重復第3)步；5)取上清，加入3倍體積無水乙醇，13，OOOrpm離心IOmin；6)棄上清，取沉淀，加入500μ175%乙醇洗滌，13，OOOrpm離心5min；7)棄上清，沉淀自然或烘箱中烘干；8)加入150μ1E液(Tris-EDTA緩沖液)溶解，_20°C保持備用。9)將第8)步的產物進行PCR反應；9.1)PCR反應體系準備雙蒸滅菌水5.9μ1，F液(2XMasterPCRMix)7.5μ1,G液(10μmol/L的引物，含有引物1和引物2)0.6μ1，步驟8)獲取的DNA樣本1μ1，充分混勻后5000rpm簡短離心IOs；9.2)PCR反應體系如下95°C預變性5min94°C變性1min56°C退火45sL35個循環；72"C延伸1min」720C延伸7min9.3)PCR產物取6μ1進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶，判斷小管福壽螺感染情況。實施例4采用試劑盒進行小管福壽螺DNA抽提及檢測1)小管福壽螺肺囊組織粉碎后，取IOOmg左右，加入500μ1A液(CTAB裂解液(2%CTAB，20mmol/LEDTA，0.lmol/LTris-Cl,1.4mol/LNaCl))，8μ1B液(巰基乙醇)，5μ1C液(蛋白酶K(20mg/mL))，60°C消化過夜；2)加入500μ1D液(苯酚氯仿異戊醇(25241))，充分混勻，13，200rpm離心IOmin；3)取上清，加入等體積的D液，充分混勻，13，200rpm離心IOmin；4)重復第3)步；5)取上清，加入2.5倍體積無水乙醇，12，OOOrpm離心IOmin；6)棄上清，取沉淀，加入500μ175%乙醇洗滌，10，OOOrpm離心5min；7)棄上清，沉淀自然或烘箱中烘干；8)加入60μ1E液(Tris-EDTA緩沖液)溶解，_20°C保持備用；9)將第8)步的產物進行PCR反應；9.1)PCR反應體系準備雙蒸滅菌水5.9μ1，F液(2XMasterPCRMix)7.5μ1,G液(10μmol/L的引物，含有引物1和引物2)0.6μ1，步驟8)獲取的DNA樣本1μ1，充分混勻后2000rpm簡短離心8s；9.2)PCR反應體系如下950C預變性5min940C變性1min560C退火45s135個循環；720C延伸1min^72°C延伸7min9.3)PCR產物取6μ1進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶，判斷小管福壽螺感染情況。10)實驗結果陰性、陽性結果判斷見圖1。如圖1所示，1-6是陰性螺樣本，即僅一條大小約為550bp的條帶。550bp條帶為小管福壽螺擴增條帶，表明抽提DNA中僅含小管福壽螺DNA，而無廣州管圓線蟲DNA，說明該螺樣本未感染廣州管圓線蟲，為陰性；7-15、17是陽性螺樣本，即存在一條大小約為550bp和一條大小約為405bp的條帶，其中405bp條帶為廣州管圓線蟲擴增條帶，表明抽提DNA同時含有小管福壽螺和廣州管圓線蟲DNA，說明該螺樣本感染廣州管圓線蟲，為陽性；16是陰性對照，即無擴增條帶，在該情況下表明PCR檢測失敗；M是DNAmarkerII。本發明方法可檢測廣州管圓線蟲的最低濃度為120pg/y1。153只從野外采集的福壽螺，經肺檢法檢測并記錄每只小管福壽螺的感染情況后進行多重PCR檢測，兩種方法的檢測結果如表1所示，與肺檢法比較，本發明檢測方法的敏感度達到93.8%，特異度為95.2%。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權利要求一種檢測小管福壽螺體內廣州管圓線蟲的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中含有(A)CTAB裂解液，該CTAB裂解液含有2％CTAB，20mmol/LEDTA，0.1mol/LTris-Cl和1.4mol/LNaCl；(B)巰基乙醇；(C)20mg/mL的蛋白酶K；(D)苯酚、氯仿和異戊醇的混合液，苯酚∶氯仿∶異戊醇為25∶24∶1；(E)Tris-EDTA緩沖液，該緩沖液含10mmol/LTris-Cl和1mmol/LEDTA，pH為8.0；(F)2×MasterPCRMix；(G)10μmol/L的引物，所述引物含有引物1和引物2，該引物1的序列為上游5’-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3’(SEQIDNO1所示序列)，下游5’-CCGGTCTGAACTCAGATCATGT-3’(SEQIDNO2所示序列)；該引物2的序列為上游5’-GCAAATGCTTTCGCTTTAGG-3’(SEQIDNO3所示序列)，下游5’-AATGGCAGGGACGTAATCAG-3’(SEQIDNO4所示序列)。2.如權利要求1所述的檢測小管福壽螺體內廣州管圓線蟲的試劑盒，其特征在于，該試劑盒可抽提DNA100次，含有(A)CTAB裂解液50_70ml，(B)巰基乙醇800-1000u1，(C)20mg/mL的蛋白酶K500-700u1,(D)苯酚、氯仿和異戊醇的混合液120_200ml，(E)Tris-EDTA緩沖液6-15ml，(F)2XMasterPCRMixF750u1，(G)10iimol/L的引物60ii1。3.—種檢測小管福壽螺體內廣州管圓線蟲的方法，包含如下步驟1)小管福壽螺肺囊組織粉碎后，取<100mg，加入如權利要求1所述的(A)CTAB裂解液500-700u1,(B)巰基乙醇8-10iil以及(C)20mg/mL的蛋白酶K5-7yl，60°C水浴5-10小時至完全消化；2)加入如權利要求1所述的(D)苯酚、氯仿和異戊醇的混合液500-700iU，充分混勻，常溫下10，000-16,OOOrpm離心lOmin；3)取上清，加入等體積的如權利要求1所述的(D)苯酚、氯仿和異戊醇的混合液，充分混勻，常溫下10，000-16，OOOrpm離心lOmin；4)重復第3)步；5)取上清，加入2-3倍體積95%或無水乙醇，常溫下11，000-13，OOOrpm離心lOmin；6)棄上清，取沉淀，加入500ill70%或75%乙醇洗滌，常溫下10，000-13，OOOrpm離心5min；7)棄上清，沉淀自然或烘箱中烘干；8)加入如權利要求1所述的(E)Tris-EDTA緩沖液60-150u1溶解，_20°C保持備用；9)將步驟8)的產物進行PCR反應將雙蒸滅菌水5.9iU，如權利要求1所述的(F)2XMasterPCRMix7.5yl，如權利要求1所述的(G)10iimol/L的引物0.60yl，步驟8)獲取的DNA樣本1ii1，充分混勻后500-5000rpm簡短離心5_10s，進行PCR反應；10)PCR產物取6iU進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶，判斷小管福壽螺感染情況。4.如權利要求3所述的檢測小管福壽螺體內廣州管圓線蟲的方法，其特征在于，步驟9)中PCR反應的條件為95°C預變性5min后進行94°C變性lmin、56°C退火45s、72°C延伸lmin的35個循環的擴增，72°C延伸7min后保存。全文摘要本發明公開了一種檢測小管福壽螺體內廣州管圓線蟲的試劑盒，該試劑盒中含有(A)CTAB裂解液(2％CTAB，20mmol/LEDTA，0.1mol/LTris-Cl，1.4mol/LNaCl)；(B)巰基乙醇；(C)蛋白酶K(20mg/mL)；(D)苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)；(E)Tris-EDTA緩沖液(10mmol/LTris-Cl，1mmol/LEDTA，pH8.0)；(F)2×MasterPCRMix；(G)引物(10μmol/L)。此外，本發明還公開了檢測小管福壽螺體內廣州管圓線蟲的方法。本發明的試劑盒敏感性高、特異性強、重復性好，檢測方法簡單實用，為基層展開小管福壽螺分子學檢測提供便利，同時為廣州管圓線蟲病暴發后食用螺的檢測提供有效手段。文檔編號C12Q1/68GK101824474SQ201010137439公開日2010年9月8日申請日期2010年3月31日優先權日2010年3月31日發明者劉和香,危芙蓉,呂山,周曉農,張儀,胡玲申請人:中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所