專利名稱：一種廣州管圓線蟲環介導等溫擴增檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別是用于寄生蟲病快速檢測技術中的一種廣州管圓 線蟲環介導等溫擴增檢測方法。
背景技術：
廣州管圓線蟲(Angiostrongylus cantonensis)最早是由我國著名的陳心陶教授 首次在廣州家鼠肺血管內發現并命名的。螺、蛞蝓是主要的中間宿主，人因進食了含有廣州 管圓線蟲幼蟲的生或半生的螺肉而感染廣州管圓線蟲病，又稱嗜酸性粒細胞增多性腦脊髓 膜炎。廣州管圓線蟲幼蟲主要侵犯人體中樞神經系統，表現為腦膜和腦炎、脊髓膜炎和脊髓 炎，可使人致死或致殘。臨床主要癥狀為急劇的頭痛，甚至不能受到任何震動，走路、坐下、 翻身時頭痛都會加劇，伴有惡心嘔吐、頸項強直、活動受限、抽搐等癥狀，重者可導致癱瘓、 死亡。診斷治療及時的情況下，絕大多數病人預后良好。極個別感染蟲體數量多者，病情嚴 重可致死亡，或留有后遺癥。廣州管圓線蟲病廣泛流行于我國臺灣、廣東、浙江、黑龍江等 地，近年來在北京、浙江溫州、福建等地均有爆發流行，嚴重危害人體健康，應引起廣泛的重 視。廣州管圓線蟲感染常用的檢測方法包括病原學檢查和免疫學診斷，病原學檢查主 要是腦脊液中查廣州管圓線蟲蟲體，但概率很小。從我國目前的病例統計看，病原檢出率僅 為4. 8% ；免疫學診斷方法中的抗體檢測特異性不高，不能區分現癥和既往感染，與其他寄 生蟲存在著交叉反應，而抗原的檢測雖然特異性較強，但敏感性不高。為有效控制廣州管圓 線蟲病，需要建立高度敏感、特異和簡便的檢測技術。聚合酶鏈反應(PCR)具有極高的靈敏 度和特異性，并已應用于多種寄生蟲病的診斷，但PCR需要精密儀器的配套使用，無法滿足 基層和現場檢測的需求。Notomi T等在2000年開發了一種新穎的恒溫核酸擴增方法，即環媒恒溫擴增 法(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)，胃 HC iH 禾O ffl Bst (Bacillus stearothermophilus)大片段DNA聚合酶和根據不同靶序列設計的兩對特殊的內引物(FIP 由FlC和F2組成；BIP由BlC和B2組成)、外引物(F3和B3)，特異地識別靶序列上的6個 獨立區域，在等溫條件下進行靶序列高效快速擴增。LAMP技術從2003年開始逐步用于醫學檢測，目前主要是應用于病原微生物的檢 測和傳染性疾病的診斷，應用環介導等溫DNA擴增技術(LAMP)快速檢測廣州管圓線蟲18s rRNA基因目前國內外文獻尚無報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種基于環介導等溫DNA擴增技術(LAMP)檢測廣州管圓線 蟲高靈敏度、高特異性的檢測方法，使其操作簡便、成本低廉，結果易于觀察，適用于廣州管 圓線蟲的現場快速檢測。本發明是根據環介導等溫擴增(LAMP)技術原理，針對廣州管圓線蟲的特異性片段設計4條引物，識別靶序列的6個區域，利用BstDNA酶的鏈置換特性，在等溫條件下生成 大量重復的莖環狀結構；設計擴增廣州管圓線蟲18s rRNA基因的4條特異性引物FIP :5’ -CCTGGTGGTGCCATTCCGTCTCTTTCGGTTCCTGGGGTAG-3，BIP :5’ -GCCCGGACACCGTAAGGATTGCACCACCAACCACCAAAT-3，F3 :5’ -TTGTCGAGGAGCTTCCCG-3’B3 5' -CACCAACTAAGAACGGCCAT-3’提取樣品DNA后，環介導等溫擴增(LAMP)反應體系擴增靶DNA，LAMP檢測體系由 一套設計的引物、10XLAMP反應液、DNA聚合酶、陽性對照、陰性對照和顯色劑組成，并對 LAMP反應條件進行優化，特異性和重復性檢驗證實該方法可靠性強。本發明的廣州管圓線蟲LAMP檢測試劑包括LAMP反應液，與4條LAMP引物共同構 成LAMP檢測體系，25 μ 1 LAMP檢測體系的具體配置為25ul LAMP反應體系的具體配置
F3、B30. 1 0. 2μΜ
FIP, BIP1. 2 1· 6μΜ
dNTP1. 4 2. 8mM
Mg2+6 16mM
反應緩沖液 IOXThermoPol Reaction Buffer
鏈置換 DNA 聚合酶 BstDNA polymerase8U
舌甘菜堿betaine1. 0 1· 6M
本發明所述廣州管圓線蟲環介導等溫擴增檢測方法，反應條件為63°C恒溫60分
鐘，80°C 5分鐘終止反應。由于LAMP的擴增效率非常高，產生大量的焦磷酸鎂，可直接通過肉眼觀察是否有 白色的焦磷酸鎂沉淀來判斷是否生成焦磷酸離子，出現白色沉淀為陽性結果，未出現白色 沉淀為陰性結果。或者通過SYBR Green I染色劑顏色變化來判斷靶基因是否存在，反應后 的混合液中加入染色劑SYBR Green-Ι,出現綠色的為陽性結果，橙色的是陰性結果。另一種檢測結果的方法是取反應后的混合液2 μ 1，加入0. 5μ 1溴酚藍上樣緩沖 液，在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，電壓為ΙΟΟν，時間為30min，溴化乙錠(EB)染色后在紫外燈 下觀察，出現梯度條帶為陽性結果，如未出現則為陰性結果。本發明在定性檢測時可不需任何特殊設備。該方法與常規檢測方法相比，具有操 作簡便快速、敏感特異、無需特殊儀器、檢測時間比普通PCR短等特點，適合于廣州管圓線 蟲病現場快速檢測。
1、圖1是LAMP檢測廣州管圓線蟲的敏感性試驗，采用SYBR Green I染色方法檢 測。1)是陰性對照，2)陽性對照，3)是IOOpg模板DNA，4)是IOpg模板DNA，5)是Ipg模板 DNA, 6)是 IOOfg 模板 DNA，7)是 IOfg 模板 DNA，8)是 Ifg 模板 DNA，9)是 0. Ifg 模板 DNA， 10)是O.Olfg模板DNA。從結果可看出，LAMP檢測廣州管圓線蟲的最低檢測量是lfg。2、圖2是LAMP檢測廣州管圓線蟲的敏感性試驗，采用電泳方法檢測。1)是DNA 標志物DL2000，2)是陰性對照，3)是陽性對照，4)是IOOpg模板DNA，5)是IOpg模板DNA，
46)是 Ipg 模板 DNA，7)是 IOOfg 模板 DNA，8)是 IOfg 模板 DNA，9)是 Ifg 模板 DNA，10)是 0. Ifg模板DNA，11)是0. Olfg模板DNA。從結果可看出，LAMP檢測廣州管圓線蟲的最低檢 測量是lfg。3、圖3是LAMP檢測廣州管圓線蟲的特異性試驗，采用SYBR Green I染色方法檢 測。1)是陰性對照，2)是廣州管圓線蟲DNA樣本，3)是瘧原蟲DNA樣本，4)是弓形蟲DNA 樣本，5)是血吸蟲DNA樣本，6)是異尖線蟲DNA樣本。從結果可看出，廣州管圓線蟲樣本顯 示為陽性，其他樣本均為陰性，表明與其他寄生蟲無交叉反應。4、圖4是LAMP檢測廣州管圓線蟲的特異性試驗，采用電泳方法檢測。1)是DNA標 志物DL2000，2)是陰性對照，3)是廣州管圓線蟲DNA樣本，4)是瘧原蟲DNA樣本，5)是弓形 蟲DNA樣本，6)是血吸蟲DNA樣本，7)是異尖線蟲DNA樣本。從結果可看出，廣州管圓線蟲 樣本顯示為陽性，其他樣本均為陰性，表明與其他寄生蟲無交叉反應。
具體實施例方式以下實施例用來解釋說明本發明，而不是對本發明進行限制，在本發明的精神和 權利要求的保護范圍內，對本發明作出的任何修改和改變，都落入本發明的保護范圍。如無特別指明，實驗所用的引物由上海生工生物技術有限公司合成；BstDNA聚合 酶(大片段購自New England公司；甜菜堿(Betaine)、Mg2+購自SIGMA公司。實施例一、特異性DNA序列查找從美國基因數據庫-GENBANK檢索獲得廣州管圓線蟲18s rRNA基因序列，登錄號 為AY295804. 1，針對該保守靶序列進行LAMP引物設計，該特異性靶序列為1attaagccatgcatgaggagttcagctttaagtgaaactgcgaacggctcattagagcag
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二、引物的設計
LAMP方法中的引物設計是LAMP法實現擴增的關鍵所在，應用PrimerExplorerV3
軟件設計引物。LAMP擴增的靶序列長度控制在300bp以下，LAMP最少需要4條引物，分別 是正向內引物FIP，由F2區段(與靶基因F2c區段完全互補)和Flc區段(同靶基因3’末 端的Flc序列相同)組成；正向外引物F3(與靶基因F3c區段完全互補)；反向內引物BIP， 由B2區段(與靶基因3’末端的B2c區段完全互補)和Blc區段(同靶基因3’末端Blc 序列完全相同)組成；反向外引物B3(與靶基因B3c區段完全互補)。各區段的設計規則 與PCR相同。內引物長度通常超過40個堿基，外引物為20個堿基左右。除了引物的長度、 堿基組成外，需要考慮引物與靶序列的環狀結構等。三、LAMP1、廣州管圓線蟲基因組DNA提取實驗室建立廣州管圓線蟲的動物感染模型。使 用Takara公司的基因組提取試劑盒提取廣州管圓線蟲的基因組DNA，分光光度分析A260/ A280 > 1. 8，為檢測體系提供模板，-80°C冰箱中儲存備用。2、LAMP反應的條件反應體系包括引物FTP、BIP、F3、B3 ；dNTP、Mg2+、鏈置換型DNA聚合酶(BstDNA polymerase)、Betaine、核酸模板，終體積25 μ 1。LAMP反應在60 65°C恒溫條件下進行。 最佳反應條件因引物的效率和模板DNA質量變化而不同，因此通過比較試驗確定最佳反應 時間、反應溫度和試劑濃度。每個反應設立陰性與陽性對照。3、反應的敏感性、特異性分析將廣州管圓線蟲基因組DNA梯度稀釋后進行LAMP檢測，由最低DNA檢出量分析反 應的敏感性，由圖1，圖2可知，LAMP方法的最低檢測量為Ifg ；以廣州管圓線蟲、瘧原蟲、弓形蟲、血吸蟲、異尖線蟲等五種寄生蟲核酸為模板檢 測體系的特異性。LAMP檢測體系的特異性良好，與瘧原蟲、弓形蟲、血吸蟲、異尖線蟲DNA沒 有交叉反應，可以特異性地檢測廣州管圓線蟲，參見圖3，圖4。4、LAMP反應的鑒定分析(1)直接觀察LAMP反應中核酸大量合成時，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應 溶液中的Mg2+結合，產生副產物-焦磷酸鎂白色沉淀。它有極高的特異性，可以用肉眼觀察 或濁度儀檢測反應管中的沉淀濁度判斷擴增與否。
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(2)顯色反應直接向擴增管中加入嵌入劑SYBR Green-I，無擴增反應的管子呈 橙色，有擴增反應的管子將變為綠色。(3)瓊脂糖凝膠電泳取反應后的混合液2μ 1，加入0. 5μ 1溴酚藍上樣緩沖液，在 2%的瓊脂糖凝膠中電泳，電壓為ΙΟΟν，時間為30min。EB染色劑染色后在紫外燈下觀察。 LAMP反應會產生各種片斷長度的莖環結構的擴增產物，因此在電泳圖譜中顯示為從點樣孔 處開始的拖尾條帶現象。5、根據優化結果，確定了最佳的LAMP檢測體系，在實際操作中可以存在一定的浮 動范圍，具體如下F3、B30. 1 ~ 0. 2μΜ
FIP, BIP1. 2 1· 6μΜ
dNTP1. 4 2. 8mM
Mg2+6 16mM
反應緩沖液 IOXThermoPol Reaction Buffer
鏈置換 DNA 聚合酶 BstDNA polymerase8U
舌甘菜堿betaine1. 0 1· 6M
權利要求
一種廣州管圓線蟲環介導等溫擴增檢測方法，其特征在于根據恒溫核酸擴增方法的技術原理，針對廣州管圓線蟲的特異性片段設計4條引物，識別靶序列的6個區域，利用BstDNA酶的鏈置換特性，在等溫條件下生成大量重復的莖環狀結構；設計擴增廣州管圓線蟲18s rRNA基因的4條特異性引物為FIP5’ CCTGGTGGTGCCATTCCGTCTCTTTCGGTTCCTGGGGTAG 3’BIP5’ GCCCGGACACCGTAAGGATTGCACCACCAACCACCAAAT 3’F35’ TTGTCGAGGAGCTTCCCG 3’B35’ CACCAACTAAGAACGGCCAT 3’提取樣品DNA后，環介導等溫擴增(LAMP)反應體系擴增靶DNA，環介導等溫擴增(LAMP)檢測體系由一套設計的引物、10×LAMP反應液、DNA聚合酶、陽性對照、陰性對照和顯色劑組成，并對LAMP反應條件進行優化。
2.根據權利要求1所述的廣州管圓線蟲環介導等溫擴增檢測方法，其特征在于四條 LAMP引物的廣州管圓線蟲LAMP檢測試劑，還包括LAMP反應液，與四條LAMP引物共同構成 LAMP檢測體系，25 μ 1 LAMP檢測體系的具體配置為F3、B30· 1 0· 2μΜFIP, BIP1· 2 1· 6μΜdNTP1· 4 2. 8mMMg2+6 16mM反應緩沖液 IOXThermoPol Reaction Buffer鏈置換 DNA 聚合酶 BstDNA polymerase8U甜菜堿 betaine1. O 1. 6M
3.根據權利要求2所述的廣州管圓線蟲環介導等溫擴增檢測方法，其特征在于所述試 劑的檢測反應條件為63°C恒溫60分鐘，80°C 5分鐘終止反應。
4.根據權利要求3所述的廣州管圓線蟲環介導等溫擴增檢測方法，其特征在于擴增結 果的檢測可以直接觀察反應混合液中是否出現白色沉淀，出現白色沉淀為陽性結果，未出 現白色沉淀為陰性結果。
5.根據權利要求4所述的廣州管圓線蟲環介導等溫擴增檢測方法，其特征在于反應后 的混合液中加入染色劑SYBR Green-Ι,出現綠色的為陽性結果，橙色的是陰性結果。
6.根據權利要求4所述的廣州管圓線蟲環介導等溫擴增檢測方法，其特征在于，另一 種檢測結果的方法是取反應后的混合液2μ 1，加入0. 5μ 1溴酚藍上樣緩沖液，在2%的瓊 脂糖凝膠中電泳，電壓為100伏，時間為30分鐘，溴化乙錠(EB)染色劑染色后在紫外燈下 觀察，出現梯度條帶為陽性結果，如未出現則為陰性結果。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，特別是用于寄生蟲病快速檢測技術中的一種利用環介導等溫擴增技術快速檢測廣州管圓線蟲的方法。該方法包括兩對用于檢測廣州管圓線蟲的環介導等溫擴增引物FIP、BIP、F3與B3，和一種利用上述兩對引物檢測廣州管圓線蟲的LAMP方法，其中包括反應模板的制備、LAMP反應體系、LAMP反應程序和檢測結果判斷。其操作簡便、成本低廉，結果易于觀察，非常適用于廣州管圓線蟲的現場快速檢測。
文檔編號C12Q1/68GK101899521SQ20101024223
公開日2010年12月1日 申請日期2010年7月30日 優先權日2010年7月30日
發明者卓敏敏, 張儀, 樓滌, 童群波, 陸紹紅, 陳睿 申請人:浙江省醫學科學院;中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所