專利名稱：一種廣州管園線蟲病的診斷抗原分子的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種廣州管園線蟲(Angiostrongylus cantonensis)新診斷抗原或其抗原片段，這種抗原或其抗原片段在檢測廣州管園線蟲中的用途、包含它們的試劑盒、包含這種抗原或其抗原片段的疫苗以及這種抗原的分離方法。
背景技術：
廣州管圓線蟲1935年由我國陳心陶教授首先發現，1945年在臺灣發現首例人體廣州管圓線蟲病，我國大陸1984年才發現首例廣州管圓線蟲病，1997年浙江溫州發生了首次廣州管圓線蟲病爆發流行，發病人數達60多例。根據1980-2000年的流行病學調查，我國廣東、廣西、海南、云南、浙江、福建和遼寧等省均發現有本蟲分布。廣州管圓線蟲的終宿主為嚙齒類動物，主要為鼠類；中間宿主主要為軟體動物，約有56種，自然感染率各地從17.2％到88.5％不等。隨著市場經濟的發展，南貨北運普遍，從而造成廣州管圓線蟲感染源的擴散。此外，近年來人們的膳食結構發生了很大改變，一些螺、蝸牛等也成了食物來源，如褐云瑪瑙螺已被大量養殖，暢銷全國各地供人們食用，與之相伴隨的是廣州管圓線蟲病的流行呈上升的趨勢。在世界上，廣州管圓線蟲病也呈不斷擴散的趨勢，已從東南亞傳播到南太平洋、非洲、印度、菲律賓。近來還有報道通過貨船倉里的老鼠等將本病傳播到了澳大利亞、北美洲等地。廣州管圓線蟲病作為一種新發的傳染病已越來越引起人們的關注。
廣州管圓線蟲對人體的損害主要是由于蟲體侵犯中樞神經系統而引起嗜酸性粒細胞增多性腦膜炎、腦膜腦炎或脊神經根炎，部分病例還可侵犯肺臟和眼睛。兒童感染該蟲，如不及時治療，常可致死。在臨床上，本病需與其他原因所致的腦炎或神經系統疾病，如化膿性腦膜炎、結核性腦膜炎、流行性腦膜炎相鑒別。傳統的病原診斷主要靠從患者腦脊液或受累組織和器官中查找到蟲體而確診，其敏感性很低，容易漏診和誤診。絕大多數病例需根據臨床癥狀、實驗室檢查和病史而作出臨床診斷，其中免疫學檢查對診斷具有重要的參考價值。目前國內外雖已有一些學者對廣州管圓線蟲病的免疫學檢查進行了研究探討，但尚缺乏敏感特異、快捷便用的標準化診斷試劑盒。
廣州管圓線蟲抗原與其他寄生蟲抗原存在交叉反應性，單一組分抗原可以提高檢測的特異性。國外學者純化的雌童蟲29kDa、幼蟲204kDa、成蟲31kDa和31.5kDa等抗原均提高了對廣州管圓線蟲檢測的敏感性和特異性。
發明內容
本發明是從不同發育階段的廣州管園線蟲抗原中，經一系列的免疫篩選后所獲得的一個在廣州管園線蟲病診斷中具有高度敏感性和特異性的抗原分子(AC32)。該抗原分子將在廣州管園線蟲病的診斷和流行病學調查中發揮重要作用。
這樣，在第一個方面，本發明提供了為廣州管園線蟲抗原的蛋白質，在變性和還原條件下測定時，其分子量范圍在26-35kDa范圍內。
適合地，所述抗原蛋白質在其氨基端末端上具有以下序列Leu-Phe-Ile-Gln-Ile-Lys-Leu-Leu-Thr-Ala-Gln-Ser-Leu-Thr-Lys；或者與該序列實質上同源的序列。在氨基酸水平上，如果大量重要的氨基酸序列顯示同源性，可以看作蛋白質序列和另一個蛋白質序列實質上同源。隨著優先等級的增加，至少40％，50％，60％，70％，80％90％，95％，甚至99％的氨基酸可以是同源的。
在第二個方面，一種分離如權利要求1或2所限定之蛋白質的方法，該方法包括(a)從廣州管園線蟲所有的中間宿主和/或終末宿主，(其主要包括軟體動物和鼠類)分離獲得廣州管園線蟲幼蟲和/或成蟲(包括鼠類的腦獲得廣州管園線蟲幼蟲和肺部獲得廣州管園線蟲成蟲)；(b)在清水、生理鹽水或適合的緩沖液中洗滌過的廣州管園線蟲幼蟲或成蟲，其后勻漿或超聲粉碎蟲體；(c)離心除去蟲體細胞碎片，并獲得含有可溶性細胞質蛋白的上清液；(d)對獲得的液體進行分子篩分離洗脫，或對其進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后切膠、電滲；(e)對上述(d)所獲得的組分進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，確認具有26-35kDa范圍內分子量的特定蛋白質的存在；對上述(e)所獲得的蛋白質進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉移至NC膜或PVDF膜上，進行western blotting，鑒定所獲得蛋白的免疫活性。
在第三個方面，本發明提供了一種能用于廣州管園線蟲(病)的檢測和/或診斷方法。該方法包括(a)使如權利要求1或2所限定的蛋白質或抗原片段與待測樣本接觸。
(b)檢測針對廣州管園線蟲的抗體。
特別是，可以利用本發明的蛋白質或其抗原片段、或其抗原片斷組合物檢測IgG抗體和/或IgM抗體。適合地，待測樣本是生物樣品，例如人和動物的血清、腦脊液、尿液、唾液等所有體液樣本。
在第四個方面，本發明提供了用于廣州管園線蟲檢測和/或診斷的如權利要求1或2所限定的蛋白質或其抗原片段的用途。此種檢測是在體外進行的。
本發明的蛋白抗原或抗原組分可作為廣州管園線蟲病檢測和/或診斷試劑盒的一部分，這樣，在第五個方面，一種用于檢測和/或診斷廣州管園線蟲的試劑盒，該試劑盒包含如權利要求1或2所限定的蛋白質或其抗原片段，其試劑盒可以是ELISA試劑盒和/或膠體金試劑盒或其他任何品種的試劑盒。
此外，還可以用本發明的蛋白抗原或其抗原片段誘導廣州管園線蟲的免疫反應。這樣在另一方面，本發明提供了一種能夠利用如權利要求1或2所限定的蛋白質或其抗原片段免疫動物制備單克隆抗體或多克隆抗體，用此單克隆抗體或多克隆抗體組建檢測廣州管園線蟲病患者體內的針對如權利要求1或2所限定的蛋白質或其抗原片段的抗原表位(循環抗原)。
與已有技術相比有如下優點(1)廣州管園線蟲病的研究是目前寄生蟲病研究的一個全新的領域，迄今沒有成型的診斷試劑盒及診斷體系。以往的研究僅僅以該蟲的成蟲粗抗原來檢測感染動物的或人血清抗體。但人作為該蟲的非正常宿主，感染后主要以幼蟲階段寄生于腦部，引起腦和神經系統的一系列癥狀，因此，從幼蟲階段獲得抗原診斷該病更有實際應用價值。本發明選取了成蟲和幼蟲均高峰度表達的AC32，既能用于該病的早期診斷，有可用于其流行病學調查。
(2)成蟲粗抗原成分復雜，與其他寄生蟲抗體陽性血清具有廣泛的交叉陽性反應，特別是與旋毛蟲抗原交叉反應明顯。而Western blotting結果顯示這些反應帶均在30kDa以下和35kDa以上的區域，AC32恰好避開了這些非特異性反應帶，因而用AC32診斷廣州管園線蟲病大大提高了特異性。
圖1.不同發育階段廣州管圓線蟲蛋白的SDS-PAGE分析；圖中1感染前幼蟲，即3期幼蟲；2感染后1周大鼠腦部雌雄蟲；3感染后2周大鼠腦部雌雄蟲；4感染后3周大鼠腦部雌雄蟲；5感染后4周大鼠肺部雄蟲；6感染后4周大鼠肺部雌蟲；7感染后5周大鼠肺部雄蟲；8感染后5周大鼠肺部雌蟲；9感染后6周大鼠肺部雄蟲；10感染后6周大鼠肺部雌蟲；11感染后2個月大鼠肺部雌雄蟲；12感染后5個月大鼠肺部雄蟲；13感染后5個月大鼠肺部雌蟲；14感染后4周大鼠腦部雌雄蟲；15感染后4周大鼠肺部雌蟲；M標準分子量蛋白。
圖2不同發育階段蟲體抗原與廣州管圓線蟲感染大鼠血清的免疫印跡分析；A感染2w大鼠血清；B感染3w大鼠血清；C感染5w大鼠血清；1感染后2周雌雄蟲；2感染后3周雌雄蟲；3感染后4雄蟲；4(感染后4周雌蟲；5感染后5周雄蟲；6感染后5周雌蟲圖3.純化AC32與廣州管園線蟲粗抗原的凝膠電泳；
1切膠純化的AC32抗原；2廣州管園線蟲粗抗原；3標準分子量蛋白圖4純化AC32和廣州管園線蟲粗抗原與感染大鼠血清的免疫印跡；1切膠純化的AC32抗原；2廣州管園線蟲粗抗原；3標準分子量蛋白圖5AC32與不同血清的免疫印跡結果；1健康人；2正常大鼠；3.4廣州管園線蟲感染大鼠；5廣州管園線蟲病人；6旋毛蟲免疫兔；7血吸蟲感染兔；8弓形蟲免疫兔；9囊蟲病人；10裂頭蚴病人。
圖6廣州管園線蟲蟲體粗抗原與不同血清的免疫印跡結果；1廣州管園線蟲感染大鼠；2.正常大鼠；3.健康人；4.弓形蟲免疫兔；5.旋毛蟲免疫兔；6.血吸蟲感染兔；7.廣州管園線蟲病人；8.囊蟲病人；9.裂頭蚴病人。
圖7膠體金方法檢測廣州管園線蟲IgG抗體結果圖。
C質控區；T檢測區具體實施方式
實施例一.不同發育階段廣州管圓線蟲的獲得1.從廣州管圓線蟲病流行區采集褐云瑪瑙螺，去殼、剁碎后，用人工消化液(HCl7ml，胃蛋白酶1.5g，加水至1000ml)室溫消化4～6h，40目篩網過濾，濾液自然沉淀2～3次后，取沉渣在解剖鏡下分離3期幼蟲，并用無菌生理鹽水洗滌3次。
2.取活的3期幼蟲，顯微鏡下計數，用注射器從腹腔接種SD大鼠(每只50條)，分別在接種后第1、2、3、4、5、6周、2月和5月處死大鼠，收集血清并解剖大鼠的腦和肺，在解剖鏡下分離并計數蟲體，所獲蟲體用生理鹽水洗滌3次。
實施例二.不同發育階段廣州管圓線蟲蛋白譜分析聚丙烯酰胺凝膠電泳取上述蟲體，加入蟲體2倍體積的10mmol/L pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)，冰浴下勻漿5min后，等量加入2倍濃度的電泳緩沖液，進行電泳。
結果廣州管圓線蟲3期幼蟲、感染后1～6周、2月和5月的蟲體蛋白經10％的SDS-PAGE后，進行銀染。結果不同蟲齡期的蛋白質譜大致相同；3期幼蟲及感染后1周幼蟲在大分子區段除Mr249 000外，其它條帶不明顯。Mr33 000蛋白條帶在3期幼蟲中缺失，在感染1周的幼蟲蛋白中開始出現，在感染2周后的蟲體蛋白中成為主帶。雌蟲的蛋白條帶較雄蟲多，并在169 000處出現雄蟲所沒有的主帶(見圖1)。
實施例三.不同發育階段廣州管圓線蟲抗原譜分析按實施二方法將上述抗原進行電泳后，電轉移至PVDF膜上，進行免疫印跡(Western bloting)分析。即用感染后不同時期的大鼠和正常大鼠血清與之結合，經洗滌后用HRP標記的羊抗大鼠IgG與之結合，經洗滌后用DAB顯色，不同發育階段的蟲體蛋白經12％的SDS-PAGE后，電轉移至PVDF膜上，分別與感染后1～6周、2月和5月的大鼠血清及正常大鼠血清進行Western bloting。
結果各階段蟲體蛋白與感染大鼠血清在Mr32 000、40 000、50 000、66 000和80 000處出現反應帶，且大多數反應帶隨著感染時間的延長而增強，但這些區帶與感染1周大鼠和健康大鼠血清也出現反應帶。感染2周的大鼠血清與2～3周幼蟲的Mr104 000出現強反應，但與4周～5月蟲體蛋白中的Mr104 000反應較弱；所有蟲體蛋白的Mr104 000與感染5周大鼠血清及健康大鼠血清均未出現明顯反應帶。雌蟲Mr32 000和33 000抗原與感染后2周血清開始出現反應帶，所有蟲體的Mr32 000與感染3周以上的大鼠血清均出現強反應帶，與正常大鼠血清均未見明顯的反應條帶(見圖2)。
實施例四.廣州管圓線蟲32kDa抗原的分離純化將上述粗抗原進行12％的聚丙烯酰胺凝膠電泳后，浸入預冷的10mMol/L的KCl溶液，4℃放置10min后，根據標準分子量蛋白準確切取Mr32 000蛋白帶，將含目的蛋白的膠塊裝入孔徑Mr14 000的透析袋，加0.5倍Tris-甘氨酸電泳緩沖液(不含SDS)，于水平電泳槽200v電滲1h，反轉電極電滲1min，袋內滲液經12000×g 4℃離心15min，取上清對pH7.2 10mMol/L PBS透析，袋內液體即為純化的AC32。
實施例五.廣州管圓線蟲32kDa抗原(AC32)的純度及免疫活性鑒純化的AC32按上述條件進行SDS-PAGE，并電轉印到PVDF膜上，進行免疫印跡。其中，感染后不同時期的大鼠和正常大鼠血清的最終稀釋度為1∶200，HRP標記的羊抗大鼠IgG最終稀釋度為1∶10 000。
結果切膠純化的AC32經SDS-PAGE，銀染后在Mr32 000處可見單一條帶，而成蟲抗原出現多條蛋白條帶(圖3)。
AC32和成蟲抗原經SDS-PAGE后轉印至PVDF膜，與廣州管圓線蟲感染大鼠血清進行western blotting，結果AC32僅在Mr32 000處出現單一反應帶，而成蟲抗原與感染大鼠血清出現多條反應條帶(圖4)實施例六.廣州管圓線蟲32kDa抗原(AC32)的交叉反應性測定AC32和成蟲抗原經SDS-PAGE后轉印至PVDF膜，與廣州管圓線蟲感染大鼠血清進行western blotting，結果AC32僅在Mr32 000處出現單一反應帶，而成蟲抗原與感染大鼠血清出現多條反應條帶(圖4)。AC32與廣州管園線蟲感染3w和6w大鼠血清均在Mr32 000處出現單一反應帶，與健康人血清、正常大鼠血清、旋毛蟲免疫兔血清、血吸蟲感染兔血清、弓形蟲免疫兔血清、囊蟲病人血清和裂頭蚴病人血清均未見明顯的反應帶(圖5)。成蟲抗原與感染大鼠血清和廣州管園線蟲病人血清除在Mr32 000處出現反應帶外，在Mr30 000以下和Mr35000以上都出現了一些反應帶；除正常大鼠外，成蟲抗原與健康人血清、旋毛蟲免疫兔血清、血吸蟲感染兔血清、弓形蟲免疫兔血清、囊蟲病人血清和裂頭蚴病人血清在Mr30 000以下和Mr35 000以上的分子質量范圍內也出現了一定的反應帶(圖6)。
實施例七.廣州管圓線蟲32kDa抗原(AC32)的臨床檢測效果評價用pH9.6 0.1Mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋廣州管圓線蟲成蟲抗原和AC32，按預試驗的最佳包被濃度(分別為15μg/ml和5μg/ml)每孔加100μl包被ELISA反應板，用常規ELISA方法進行血清檢測。其中大鼠血清的最終稀釋度為1∶200，人血清的最終稀釋度為1∶100，HRP標記的羊抗大鼠IgG、羊抗人IgG和羊抗兔IgG的最終稀釋度均為1∶10 000。
結果AC32和廣州管圓線蟲成蟲抗原均以各自的最佳濃度包被，以常規ELISA檢測血清中的IgG抗體，結果AC32和成蟲抗原與40份廣州管圓線蟲感染3w大鼠血清和21份感染4-6w大鼠血清全部陽性，一例臨床確診的廣州管圓線蟲病人血清呈強陽性反應。AC32與5例正常大鼠血清和50例獻血員血清未出現假陰性反應，與20例急性血吸蟲病人血清、1例旋毛蟲免疫兔血清、5例華支睪吸蟲病人血清、11例弓形蟲病人血清、6例裂頭蚴病患者血清和3例囊蟲病人血清均未出現交叉陽性反應；而成蟲抗原除華支睪吸蟲病人血清外，與健康人血清和其他寄生蟲抗體陽性患者血清均出現了一定的假陽性或交叉陽性反應。另外，用AC32和成蟲抗原檢測40例嗜酸粒細胞增多患者血清，分別有4例(10％)和7例(17.5％)出現陽性(表1)。
權利要求
1.一種蛋白質，該蛋白是一種廣州管園線蟲(Angiostrongylus cantonensis)抗原，這種抗原在變性或還原條件下測定時，其具有26-35kDa范圍的分子量。
2.如權利1所要求的蛋白質，該蛋白質在其氨基端末端上具有以下序列Leu-Phe-Ile-Gln-Ile-Lys-Leu-Leu-Thr-Ala-Gln-Ser-Leu-Thr-Lys；或者與該序列實質上同源的序列。
3.一種分離如權利要求1或2所限定之蛋白質或其抗原片段的方法，該方法包括(a)從廣州管園線蟲所有的中間宿主和/或終末宿主，(其主要包括軟體動物和鼠類)分離獲得廣州管園線蟲幼蟲和/或成蟲(包括鼠類的腦獲得廣州管園線蟲幼蟲和肺部獲得廣州管園線蟲成蟲)；(b)在清水、生理鹽水或適合的緩沖液中洗滌過的廣州管園線蟲幼蟲或成蟲，其后勻漿或超聲粉碎蟲體；(c)離心除去蟲體細胞碎片，并獲得含有可溶性細胞質蛋白的上清液；(d)對獲得的液體進行分子篩分離洗脫，或對其進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后切膠、電滲；(e)對上述(d)所獲得的組分進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，確認具有26-35kDa范圍內分子量的特定蛋白質的存在；(f)對上述(e)所獲得的蛋白質進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉移至NC膜或PVDF膜上，進行western blotting，鑒定所獲得蛋白的免疫活性。
4.一種檢測和/或診斷廣州管園線蟲的方法，該方法包括(a)使如權利要求1或2所限定的蛋白質或其抗原片段與待測樣本接觸。(b)檢測針對廣州管園線蟲的抗體。
5.如權利要求4所要求的方法，其中所說的樣本包括血清、腦脊液、尿液、唾液等所有體液樣本。
6.用于廣州管園線蟲檢測和/或診斷的如權利要求1或2所限定的蛋白質或其抗原片段的用途，其檢測是在體外進行的。
7.一種用于檢測和/或診斷廣州管園線蟲的試劑盒，該試劑盒包含如權利要求1或2所限定的蛋白質或其抗原片段，其試劑盒可以是ELISA試劑盒和/或膠體金試劑盒或其他任何品種的試劑盒。
8.一種能夠在患者體內存在并引起免疫反應的組合物，該組合物包含如權利要求1或2所限定的蛋白質或抗原片段。
9.如權利要求8所限定的抗原組合物，用于免疫動物獲得針對如權利要求1或2所限定的蛋白質或抗原片段中的任何表位的單克隆抗體或多克隆抗體。
10.如權利要求9所限定的針對如權利要求1或2所限定的蛋白質或抗原片段中的任何表位的單克隆抗體或多克隆抗體，用于構建檢測和/或診斷試劑盒，用于檢測廣州管園線蟲病患者體內的如權利要求1或2所限定的蛋白質或抗原片段中的循環抗原。
全文摘要
本發明是運用廣州管園線蟲早期感染動物血清篩選不同發育階段所獲得的具有早期診斷潛能的優勢抗原分子32kDa(AC32)，經免疫印跡和ELISA證實，該抗原分子在診斷廣州管園線蟲病的早期診斷和流行病學調查中具有良好的效果，它不僅有高度的敏感性，也因該抗原與其他寄生蟲很少有交叉抗原反應性而表現出高度的特異性。無論是從天然抗原中純化的AC32還是以基因工程技術獲得的重組AC32必將成為廣州管園線蟲病診斷的良好抗原分子。
文檔編號C07K1/26GK1840543SQ20051003380
公開日2006年10月4日 申請日期2005年3月31日 優先權日2005年3月31日
發明者陳曉光, 李華 申請人:陳曉光, 李華