專利名稱：白血病耐藥細胞膜蛋白及其作為耐藥靶蛋白的用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于白血病耐藥性研究領域，特別是涉及白血病耐藥細胞膜蛋白及其作為 耐藥靶蛋白的用途，該蛋白已知為一種剪切因子(SFPQ)，該剪切因子富含脯氨酸和谷氨酰 胺。
背景技術：
化療是白血病治療的主要手段，然而在化療的過程中，白血病細胞往往對化療藥 物產生耐藥現象，尤其是對一系列結構及作用機制不同的藥物產生交叉耐藥，此稱為多藥 耐藥。這是白血病化療失敗和復發的主要原因，因而預測和治療腫瘤多藥耐藥在白血病的 治療中成為決定成敗的關鍵因素。白血病耐藥的產生是多因素的，隨誘導藥物、細胞種類、分化階段、及細胞所處微 環境的不同而表現出不同的耐藥表型。目前所發現的耐藥機制主要包括膜糖蛋白介導的藥 物外排、細胞凋亡調節的改變、細胞內藥物的激活或滅活改變所引起的代謝耐藥、DNA損傷 修復功能的加強、蛋白激酶C活性增加、膜轉運缺陷、細胞粘附以及通過細胞內藥物靶酶的 水平改變或細胞內酶與藥物的親和力改變而導致的靶耐藥等等。由于臨床耐藥與體外腫瘤 細胞耐藥表型和性質有很大差別，因而上述機制能在臨床中得到證實甚至被應用于臨床腫 瘤細胞耐藥預測和治療的卻很少。目前在白血病耐藥的臨床治療方面主要以抑P-糖蛋白 功能的耐藥逆轉劑為主，但其臨床效果并不理想，至今無一獲得FDA批準上市。事實上白血 病患者耐藥產生并非單一機制，此外，在臨床上患者間的個體差異也為治療帶來了困難。可 見發現更多的白血病耐藥相關的治療靶點以實現多靶點聯合檢測與治療是解決上述問題 的對策。抗體標記技術和流式細胞儀技術在臨床廣泛應用并已成為白血病免疫分型的診 斷中不可或缺的指標。目前，流式細胞術已經能夠同時檢測十幾種細胞表面分子，為建立多 靶點聯合診斷和治療耐藥提供了可能。細胞膜蛋白是抗體標記和流式細胞儀檢測的最佳靶 點，其在細胞表面識別、信號轉導、酶和轉運等方面都扮演著重要的角色。血液腫瘤不同于 實體瘤，其分散性特別適于以細胞膜蛋白作為靶點。由于細胞膜蛋白的天然的疏水性和其低豐度的特點為直接分離鑒定細胞膜蛋白 帶了諸多困難。新近發展的基于抗體和質譜聯合應用的方法為發現和鑒定特定靶蛋白和未 知功能的新的細胞膜蛋白提供了新方法和便利手段。各種來源或功能不同狀態不同的樣 本做前期處理后，經電泳或液相色譜分離，再通過免疫共沉淀技術釣取抗原，而后可供選擇 的質譜方法分析和與數據庫信息比對而精確鑒定目的蛋白，逐漸成為研究新蛋白的成熟模 式。單克隆抗體因其與抗原位點特異性的結合，以及其作為與熒光標記物的載體和與 毒素或放射性物質相偶聯的載體，在腫瘤靶向治療和特異性診斷中具有及其重要的應用價 值，同樣也在腫瘤多要耐藥的診斷與治療中單抗也發揮著同樣重要的價值。由于體內研究腫瘤多藥耐藥涉及醫學倫理等多方面因素，開展體內實驗非常困
3難。因此，大量不同組織來源的腫瘤細胞，經體外藥物選擇性作用而產生的耐藥細胞株已經 成為研究多因素耐藥機制的重要模型。。
發明內容
本發明的目的是提供一種白血病耐藥細胞膜蛋白及其作為耐藥靶蛋白的用途。本發明涉及的細胞膜表面耐藥標志蛋白，經消減免疫法制備單克隆抗體、利用單 抗和免疫共沉淀技術釣取抗原、肽指紋圖譜鑒定及測序、siRNA的干擾實驗表明該抗原(細 胞膜蛋白)是一種已知的蛋白，該蛋白為富含脯氨酸和谷氨酰胺的剪切因子(SFPQ)，具有 本申請所附序列表(SEQ ID No. 1)所示的基因編碼。本發明系首次證明該蛋白表達在血液系細胞膜和腫瘤細胞膜，而且，還首次證明 所述細胞膜表面標志蛋白是設計白血病抗耐藥藥物的靶蛋白，而且還涉及其作為靶蛋白的 用途和用于白血病耐藥性臨床診斷試劑的應用。本發明的優點與積極效果在于本發明系首次證明SFPQ可以定位于血液腫瘤細 胞膜表面，本發明所提供的定位于血液腫瘤細胞膜表面的相關蛋白SFPQ具有在敏感血液 腫瘤細胞表面過度表達、在耐藥血液腫瘤細胞表面低表達的特性，是一種新的血液腫瘤耐 藥細胞膜表面標志蛋白。因此，本發明為白血病抗耐藥新藥的設計提供了新的靶點，為白血 病耐藥的診斷提供了新的診斷指標；并以此為依據，用以設計臨床診斷白血病耐藥的新的 標志物和開發直接針對白血病耐藥的新藥。
圖1是單克隆抗體5D12與敏感HL60細胞和耐藥的HL60/ADR細胞總蛋白差異結 合的免疫印跡的照片。圖2是單克隆抗體5D12與敏感HL60細胞和耐藥的HL60/ADR細胞差異結合的流式 細胞儀檢測圖，其中左上第一幅圖表示HL60細胞與PBS緩沖液共孵育后流式細胞儀檢測 圖，右上第二幅圖表示HL60細胞與抗體5D12共孵育后的流式細胞儀檢測圖，左下第三幅圖 表示HL60/ADR細胞與PBS緩沖液共孵育后的流式細胞儀檢測圖，右下第四幅圖表示HL60/ ADR細胞與抗體5D12共孵育后的流式細胞儀檢測圖。圖3是單克隆抗體5D12與敏感HL60細胞和耐藥的HL60/ADR細胞的差異結合的激 光共聚焦顯微鏡照片，其中第一行左起第一幅圖表示以FITC標記的抗體5D12后與HL60 細胞結合的熒光強度圖，第一行左起第二幅圖表示染料CM-Dil標記的HL60細胞膜的熒光 染色示意圖，第一行左起第三幅圖表示染料DAPI標記的HL60細胞的細胞核熒光染色示意 圖，第一行左起第四幅圖表示將前述三幅圖重疊后的熒光強度示意圖，第二行左起第一幅 圖表示以FITC標記的抗體5D12后與HL60/ADR細胞結合的熒光強度圖，第二行左起第二幅 圖表示染料CM-Dil標記的HL60/ADR細胞膜的熒光染色示意圖，第二行左起第三幅圖表示 染料DAPI標記的HL60/ADR細胞的細胞核熒光染色示意圖，第二行左起第四幅圖表示將第 二行前述三幅圖重疊后的熒光強度示意圖。圖4是單克隆抗體5D12特異識別敏感與耐藥HL60細胞膜表面SFPQ分子的免疫 沉淀圖，其中左起第一列為抗體5D12的電泳圖，左起第二列為抗體5D12與HL60細胞總蛋 白進行免疫共沉淀后的電泳圖，左起第三列為抗體5D12與HL60/ADR細胞總蛋白進行免疫共沉淀后的電泳圖。圖5是MS肽指紋圖譜。圖6是經靶向SFPQ的SiRNA干擾后的基因表達的電泳檢測圖，其中，GAPDH用作 內對照。圖7經靶向SFPQ的siRNA干擾后的敏感HL60細胞膜表面SFPQ分子與單抗5DD12 的結合的流式細胞儀分析，其中左上第一幅圖表示經siSFPQ干擾后的HL60細胞與PBS 緩沖液共孵育后流式細胞儀檢測圖，右上第二幅圖表示經siSFPQ干擾后的HL60細胞與抗 體5D12共孵育后的流式細胞儀檢測圖，左下第三幅圖表示經非特異的siRNA引物干擾后 的HL60細胞與PBS緩沖液共孵育后的流式細胞儀檢測圖，右下第四幅圖表示經非特異的 siRNA引物干擾后的HL60細胞與抗體5D12共孵育后的流式細胞儀檢測圖。圖8經靶向SFPQ的siRNA干擾后的敏感HL60細胞膜表面SFPQ分子與單抗5DD12 的結合的共聚焦顯微鏡照片，其中第一行左起第一幅圖表示以FITC標記的抗體5D12后 與經siSFPQ干擾過的HL60細胞結合的熒光強度圖，第一行左起第二幅圖表示染料CM-Dil 標記的經siSFPQ干擾過的HL60細胞膜的熒光染色示意圖，第一行左起第三幅圖表示染料 DAPI標記的經siSFPQ干擾過的HL60細胞的細胞核熒光染色示意圖，第一行左起第四幅圖 表示將前述三幅圖重疊后的熒光強度示意圖，第二行左起第一幅圖表示以FITC標記的抗 體5D12后與經非特異性siRNA干擾過的HL60細胞結合的熒光強度圖，第二行左起第二幅 圖表示染料CM-Dil標記的經非特異性siRNA干擾過的HL60細胞膜的熒光染色示意圖，第 二行左起第三幅圖表示染料DAPI標記的經非特異性siRNA干擾過的HL60細胞的細胞核熒 光染色示意圖，第二行左起第四幅圖表示將第二行前述三幅圖重疊后的熒光強度示意圖。圖9是經單抗5D12封閉細胞膜表面SFPQ活性后，阿霉素對HL60和HL60/ADR細胞 殺傷情況的分析，其中左側的四個柱形圖表示HL60細胞經不同濃度的抗體5D12處理后， 阿霉素對其生長抑制百分率，黑色表示單獨使用阿霉素處理HL60細胞的對照組；右側的四 個柱形圖表示HL60/ADR細胞經不同濃度的抗體5D12處理后，阿霉素對其生長抑制百分率， 黑色表示單獨使用阿霉素處理HL60/ADR細胞的對照組。圖10是經不同濃度的單抗5D12封閉后，高表達SFPQ的HL60細胞的增殖情況分 析，其中圖中的五個柱形圖分別表示經抗體5D12處理后的細胞相對于未以抗體處理的細 胞的增殖促進百分率。圖11是經不同濃度的單抗5D12封閉后，高表達SFPQ的HL60細胞集落形成能力 的分析，其中左側第一個培養皿為未使用抗體處理過的細胞的正常生長情況(對照組)， 中間第二個培養皿為經過終濃度為5 μ g/ml抗體5D12處理后的HL60細胞的生長情況，右 側第三個培養皿為經過終濃度為8 μ g/ml抗體5D12處理后的HL60細胞的生長情況。
具體實施例方式下面結合實施例，對本發明進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的， 不能以下述實施例來限定本發明的保護范圍。本發明中的脯氨酸及谷氨酰胺富含性剪接因子SFPQ是一種已知蛋白，該蛋白具 有在敏感腫瘤細胞表面過度表達，在耐藥腫瘤細胞表面低表達的特性，是一種新的腫瘤耐 藥細胞膜表面標志蛋白。其分離過程是經消減免疫法制備單克隆抗體、利用單抗和免疫共沉淀技術釣取抗原、肽指紋圖譜鑒定及測序、SiRNA的干擾實驗表明該抗原(細胞膜蛋白) 是一種已知的蛋白，該蛋白為富含脯氨酸和谷氨酰胺的剪切因子(SFPQ)，具有本申請所附 序列表(SEQ IDl)所示的基因編碼。具體的分離過程及細胞試驗如下一.實驗材料1.細胞株人急性髓系白血病細胞系HL60及其多藥耐藥細胞系HL60/ADR為本 實驗室常規培養傳代的細胞。HL60/ADR是本室用阿霉素逐步誘導HL60細胞建立的多藥 耐藥細胞株，具有典型的MRP表型。細胞培養于RPMI1640培養基中，加入10%的胎牛血清 (FBS)，IOmmol/L的!fepes和68. 4mmol/L的谷胺酰胺，于37°C 5% C02飽和濕度的培養箱中 培養。HL60/ADR在培養過程中加入阿霉素0.5mg/L以維持耐藥性，實驗前四天停止加藥。2.實驗動物Balb/c裸鼠(nu/nu)，雌性，5-7周齡，體重16 22g，購自中國生物 制品檢定所動物中心，在SPF級動物合格環境下飼養。3.藥物及試劑(1)阿霉素(Doxorubicin)購自法碼西亞普強公司，用生理鹽水配制成lmg/ml的 母液待用。(2) PRMI1640購于美國GIBCO公司，胎牛血清、FITC兔抗鼠抗體購于中國醫學科學 院血液學研究所科技公司。(3)Protein A agarose, CM-Dil, Trizol RNA 提取試劑盒、M-MLV 逆轉錄試劑盒以 及脂質體lipofectamin2000為Invotrogen公司產品。(4) CCK8試劑購于日本Do j indo公司。(5) SiRNA引物由上海吉瑪生物技術公司合成。(6)甲基纖維素M0512購自Sigma公司。4.主要儀器C02 孵箱 NapcoMlO 型(美國 Napco 公司)倒置顯微鏡CK40型(日本Olympus公司)無菌操作臺(蘇靜集團安泰公司)Biofuge fresco臺式低溫離心機(德國Heraeus公司)低溫冰箱 _86°C ULT-freezer (Thermo forma 公司)Gene Amp PCR system 2400 型擴增儀(美國 Pekin Elmer 公司)DYY8B型穩壓穩流電泳儀(北京市六一儀器廠)凝膠成像系統Alpha Ease FC (美國 Alpha Innotech 公司)HZQ-Q振蕩器(哈爾濱東聯電子開發有限公司)MALDI-T0F/T0F MS 質譜分析儀(ABI 公司)流式細胞儀儀(FACSCalibur)激光共聚焦顯微鏡(Leica)二.差異抗體的制備和篩選以敏感白血病細胞HL60細胞(5X IO6)為耐受原，環磷酰胺(100mg/kg)于每次腹 腔注射耐受原后第24小時、48小時等量腹腔注射兩次以誘導BALB/c小鼠免疫耐受。10天 后以耐藥白血病細胞HL60/ADR(5X106)作為免疫原免疫小鼠。經三次基礎免疫和一次加 強免疫后，取脾細胞與骨髓瘤SP2/0細胞進行融合。實驗采用活細胞間接標記交叉篩選法HL60和HL60/ADR預先接種于96孔板，按75 μ 1/孔雜交瘤培養上清分別加入兩種靶細胞， 4°C孵育1小時，棄上清液，加入羊抗鼠IgG-FITC (20 μ 1/孔)4V反應30分鐘。以PBS洗三 次，棄上清每孔細胞稀釋至400 μ 1，上機檢測細胞分泌的上清與HL60和HL60/ADR兩種靶細 胞的結合百分率。將檢測出的有差異的陽性克隆繼續進行亞克隆篩選與培養。選擇抗體效 價高，形態良好并能穩定分泌有差異的抗體的雜交瘤株建株。建株標準如下上清液與兩種 靶細胞結合百分率之比大于2. 5倍以上的瘤株；或單株靶細胞結合率> 30%且兩種靶細胞 結合率之差> 20%的瘤株。雜交瘤體內誘生法大量產生腹水，經蛋白G-s印harose柱純化 后的單克隆抗體5D12備后續實驗用。純化后的單克隆抗體5D12作為一抗，以FITC標記的兔抗鼠抗體作為二抗標記細 胞，具體方法同篩選時所進行的活細胞間接標記法。以5D12和FITC 二抗分別標記敏感的 HL60細胞和耐藥的HL60/ADR細胞，標記好的細胞進行流式細胞儀的檢測和激光共聚焦顯 微鏡觀測。提取兩種細胞總蛋白，以純化的單抗5D12作為一抗，HRP標記的兔抗鼠抗體作 為二抗，經DAB顯色，觀察抗體與抗原結合的特異性和差異性。結果如附圖1所示，單克隆抗體5D12與HL60和HL60/ADR細胞的總蛋白結合有 差異；如附圖2和附圖3所示，單克隆抗體5D12與HL60和HL60/ADR細胞膜均可結合，且結 合性有差異，且附圖1，附圖2和附圖3均顯示該單抗與敏感的HL60結合高而與HL60/ADR
結合低ο三.脯氨酸及谷氨酰胺富含性剪接因子SFPQ的確認1.免疫共沉淀，SDS-PAGE 分離靶蛋白用含 ImM PMSF 的 RIPA buffer (50mM Tris-HCl (pH 7. 4), 1 % ΝΡ-40,0. 25%脫氧膽酸鈉，150mM 氯化鈉，ImM EDTA)裂解 HL60 和 HL60/ADR細胞，提取總蛋白使其濃度在800 μ g/ml左右。用同種型IgG對照抗體和10 μ 1 50%proteinA agarose懸于4°C輕搖1小時預清除；離心取上清，加入10 μ g單抗OT12，4°C 輕搖過夜，再加入10 μ 1 50% protein A agarose，于4°C孵育2小時。該免疫沉淀復合物 以冰PBS洗四遍，離心收集上清，進行SDS-PAGE電泳分離和考馬斯亮藍染色。切割敏感細 胞和耐藥細胞差異顯著的電泳條帶用于質譜分析。2. MALDI-TOF MS分析取上述膠塊加30 μ 1雙蒸水洗兩次，10分鐘每次，加50mM NH4HCO3/乙腈以1 1配制溶液30μ 1，37°C脫色20分鐘，吸干。重復該步驟直至藍色退 去。加乙腈30 μ 1脫水至膠粒完全變白，真空抽干5分鐘；將1 μ g/μ 1的胰蛋白酶儲存液 以25mM NH4HC03稀釋100倍，每EP管加8 μ 1，置37°C消化過夜。將提取肽段溶于等體積 基質工作液，點樣于不銹鋼板上，空氣干燥后用三氟乙酸于板上脫鹽，用4700PrOteOmiCS Analyzer分析，采用正離子模式采集和處理分子量范圍在700-4000Da數據。所有蛋白用肽 質量圖譜和MS鑒定。4000series explorer 3· 0軟件采集峰，用GPS Explorer 3. 5軟件分 析得到的峰信息。樣品的肽指紋圖譜與SwissProt 56. 6數據庫進行比對。檢索按如下分 類標準允許一個錯配切割，匹配肽段超過4個，洗澡比S/N大于10，質量檢測精度母液小 于 1. ODa03.抗SFPQ-siRNA干擾分析設計三對靶向SFPQ和對照組的siRNA引物，根據 預實驗結果，選取特異性干擾SFPQ的siRNA引物5’ -GACGACAGGAAGAAUUAAGTT-3，(sense strand)和對照組引物 siRNA 5，-UUCUCCGAAC ⑶⑶ CACGUTT-3，(sense strand)。用脂質體 lipofectamin2000按照試劑盒轉染說明書轉染敏感HL60和HL60/ADR細胞，每種細胞都已非特異性干擾引物作為對照。以RNA提取試劑盒提取經基因干擾操作的細胞，M-MLV逆轉 錄試劑盒進行RT-PCR驗證。經干擾的細胞，再次以5D12為一抗，按照“一.差異抗體的制 備和篩選”中的方法進行熒光間接標記，以流式細胞儀和激光共聚焦顯微鏡的檢測。圖4所示的單克隆抗體5D12經免疫共沉淀釣取其抗原以及表1和圖5所示的經 肽指紋圖譜鑒定的結果是單克隆抗體5D12的抗原為SFPQ。如圖6所示的利用特異性引 物抑制高表達SFPQ的敏感HL60細胞后，再利用激光共聚焦顯微鏡和流式細胞儀檢測細胞 膜表面SFPQ蛋白表達水平，激光共聚焦顯微鏡的檢測結果見圖8，流式細胞儀的檢測結果 見圖7，顯示其細胞膜上熒光強度和與單抗5D12結合率均下降。上述結果證明質譜的檢測 結果是正確的，細胞膜蛋白SFPQ確實為單抗5D12的抗原，且在敏感和耐藥的HL60細胞膜 上表達有差異性。 表1 :MALDI-T0F質譜結果分析四.脯氨酸及谷氨酰胺富含性剪接因子SFPQ與腫瘤細胞敏感性的關系1.細胞毒實驗首先測定HL60和HL60/ADR細胞在24小時對阿霉素的IC5tl的劑 量。HL60和HL60/ADR細胞以2X 104/100ml/孔預先接種于96孔培養板中。實驗組每孔中 加入5012，使其終濃度至3 48/1111，5 48/1111 and 8 μ g/ml，每組三個復孔。一小時后，向每 孔中加入IC5tl劑量的阿霉素，于37°C孵育1小時。阿霉素對照組只加IC5tl劑量的阿霉素， 陰性對照組不加抗體，不加阿霉素，以PBS等體積補齊培養基。37°C孵育24小時后，每孔中 加入10 μ 1 CCK8，與450nm處檢測其吸光度。阿霉素的抑制百分率(IP)按如下公式計算 IP =(陰性對照組_實驗組或阿霉素組)/陰性對照組X 100%，結果見圖9。2.細胞增殖實驗選取高表達SFPQ的HL60細胞，觀察5D12對細胞增殖和集落形 成能力的的影響。取6000個細胞/IOOml/孔，接種于96孔培養板中過夜培養。將不同濃度 的單抗5D12加入各孔中，使其終濃度分別為1 μ g/ml，3 μ g/ml，5 μ g/ml，8 μ g/m和12 μ g/ ml，每個濃度三個復孔。對照組加入等體積的PBS溶液。細胞在37°C培養96小時后，向每孔中加入10μ1 CCK8溶液，于酶標儀450nm測定其吸光度。促進增殖百分率按如下公式計 算促增殖率=(實驗組-對照組)/對照組，結果見圖10。3.單抗5D12對細胞集落形成能力的影響按如下方法首先將高表達SFPQ的HL60 細胞與5D12預先孵育1小時，然后將孵育過的細胞按照1000個/平皿接種于裝有半固體 培養基的35mm培養皿中。配制半固體培養基為含有終濃度為0. 9%的甲基纖維素的1640 培養基。16-20天后，各平皿以NBT染色活細胞，經掃描儀掃描便可觀察集落形成情況，結果 見圖11。結果如附圖10所示，以單抗5D12封閉SFPQ活性后，在細胞膜高表達SFPQ的 HL60細胞，阿霉素對細胞的抑制百分率隨抗體劑量的增加而降低；而在細胞膜低表達SFPQ 的HL60/ADR細胞，這種趨勢則不明顯，以上結果說明SFPQ與細胞對阿霉素的敏感性有關。 附圖10，附圖11表明，單抗5D12封閉細胞表面SFPQ功能后，可促進細胞增殖。以上結果表 明，SFPQ通過抑制細胞增殖而維持腫瘤細胞對阿霉素的敏感性。在耐藥的腫瘤細胞HL60/ ADR中，由于細胞膜表面低表達SFPQ，細胞增殖加快而對阿霉素耐藥。
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權利要求
一種白血病耐藥細胞膜蛋白，其特征在于具有SEQ ID No.1所示的基因編碼。
2.根據權利要求1所述的白血病耐藥細胞膜蛋白，其特征在于用于設計白血病抗耐藥 藥物的靶蛋白。
3.根據權利要求2所述的白血病耐藥細胞膜蛋白，其特征在于針對靶蛋白設計出的藥物。
4.根據權利要求1所述的白血病耐藥細胞膜蛋白，其特征在于用于白血病耐藥性臨床 診斷試劑的應用。
全文摘要
本發明提供一種白血病耐藥細胞膜蛋白及其作為耐藥靶蛋白的用途。該白血病耐藥細胞膜蛋白，經消減免疫法制備單克隆抗體、利用單抗和免疫共沉淀技術釣取抗原、肽指紋圖譜鑒定及測序、siRNA的干擾實驗表明該抗原(細胞膜蛋白)是一種富含脯氨酸和谷氨酰胺的剪切因子(SFPQ)。本發明系首次證明SFPQ可以定位于血液腫瘤細胞膜表面，具有在敏感血液腫瘤細胞表面過度表達、在耐藥血液腫瘤細胞表面低表達的特性，是一種新的血液腫瘤耐藥細胞膜表面標志蛋白。該標志蛋白為白血病抗耐藥新藥的設計提供了新的靶點，為白血病耐藥的診斷提供了新的診斷指標；并可用以設計臨床診斷白血病耐藥的新的標志物和開發直接針對白血病耐藥的新藥。
文檔編號C12Q1/02GK101891813SQ20101014450
公開日2010年11月24日 申請日期2010年4月12日 優先權日2010年4月12日
發明者任思楣, 佘鳴, 彭洪薇, 李崴, 楊純正, 楊銘, 熊冬生, 王金宏, 紀慶, 邵曉楓, 顏次慧 申請人:中國醫學科學院血液學研究所