專利名稱：一個大豆MADS-box基因及其在花器官改造中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一個大豆MADS-box基因GmMADSl的應用，屬于植物基因工程領域。
背景技術：
人們已經從處于不同進化地位的整個龐大的植物各類群中分離得到了大量的 MADS-box基因，MADS-box基因在花發育中起著重要作用，無論是從營養生長向生殖生長的 轉換；還是在生殖生長的初始階段，花分生組織決定基因啟動花分生組織的發育；以及在 生殖生長后期，花器官原基的發育中都發揮著重要的作用。大豆作為重要的糧油作物，有關其花發育的研究還相對滯后。大豆花多，花器較 小，花粉粘重，花朵開放時翼瓣和龍骨瓣緊緊包住雄蕊和柱頭，花藥和柱頭不外露，異花間 的風媒傳粉等花器特點造成大豆異花傳粉非常難，也使大豆雜種優勢很難利用，如果能定 向改變大豆的花器結構，使之更利于吸引傳粉昆蟲或有利于風媒傳粉，這將大大降低不育 系繁殖或雜交制種的成本，使大豆雜交種應用于大面積生產。Feng(2006)通過對LjCYC2 的遺傳操作，在百脈根中已經實現對花瓣的改造。對大豆這樣的嚴格自花授粉作物而言，或 許可以以基因操作為基礎的分子設計，實現其傳粉方式的改變。因此，弄清花發育的分子機 制，進而為改造花器官提供基礎，具有重要的理論和現實意義。本發明從大豆中克隆了 1個 與在花瓣位置和數目的確定性上發揮了重要的調控作用的基因GmMADSl，提出了利用該基 因進行植物花器官改造的基因工程改良方法。
發明內容
技術問題本發明的目的在于公開大豆MADS-box基因GmMADSl在花器官改造中的基因工程 應用，該基因可作為目的基因導入植物，改變植物的花型，以進行植物品種改良。技術方案本發明所提供的大豆MADS-box基因GmMADSl，其序列為SEQ ID NO. 1。大豆MADS-box基因GmMADSl的基因工程應用，包括1)大豆 MADS-box 基因 GmMADSl 的克隆根據大豆MADS-box基因GmMADSl的全長序列，設計兩端引物上游引物5‘ -GAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3 ‘下游引物5‘ -CAAGGAAGAGGCTAGCTAGG-3 ‘取大豆品種Jackson花和花芽的混合物，提取總RNA，經反轉錄合成cDNA第一鏈 后，進行PCR擴增，PCR程序如下94°C預變性4分鐘，94°C變性30s，55°C復性Imin，72°C延 伸2min，33個循環后，72°C IOmin,將PCR產物進行克隆至pMD18_T載體，測序后獲得具有完 整編碼區的大豆MADS-box基因GmMADSl的cDNA序列SEQ ID NO. 1 ；2)植物表達載體的構建根據大豆MADS-box基因GmMADSl的cDNA序列，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游引物上引入BamHI限制性內切酶位點，下游引物引入SacI限制性內切酶位點 (單下劃線標示的是BamHI的酶切位點；雙下劃線標示的是SacI的酶切位點)上游引物5-AGGATCCGAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3下游引物5-AGAGCTCCAAGGAAGAGGCTAGCTAGG-3以步驟1)中獲得的PCR擴增產物為模板，經PCR擴增后，將GmMADSl的cDNA克隆至中間載體PMD18-T，進一步克隆到雙元表達載體PBI121 ；3)轉基因植株的獲得將步驟2)獲得的表達載體轉入農桿菌菌株LBA4404，進一步轉入植物，對獲得的轉基因植株進行PCR，RT-PCR驗證后進行植物的表型分析，獲得將步驟2)獲得的表達載體 轉入農桿菌菌株LBA4404，進一步轉入煙草，對獲得的轉基因植株進行PCR，RT-PCR驗證后 進行植物的表型分析，獲得的GmMADSl轉基因植株提前開花、矮化，萼片、雄蕊和花瓣的數 目增加，產生了萼片、雄蕊向花瓣的轉變，出現子房狀萼片、開裂的花瓣和彎曲的雄蕊，而且 由于雄蕊彎曲和縮短，導致雄蕊無法觸及雌蕊，而不能正常授粉；此外，GmMADSl轉基因植 株的花藥不能正常開裂，花粉的活力降低，最終導致轉基因植株育性下降甚至完全不育。有益效果GmMADSlmRNA表達分析表明其有可能參與花瓣和雄蕊的發育。進一步的過量表達 GmMADSl的煙草的花器官變化表明GmMADSl在花瓣位置和數目的確定以及雄性器官發育方 面可能發揮了重要的調控作用。本發明公開了該基因進行植物花器官改造的基因工程改良 方法。該方法對培育花器官改變的植物品種特別是大豆品種具有一定的作用，可以通過定 向地改造作物的花器形態，為農作物提高制種效率服務，進而為提高農作物特別是大豆的 產量服務。利用植物表達載體，將本發明的GmMADSl導入植物細胞，可獲得花器官改變的轉 基因細胞系及轉基因植株。使用GmMADSl構建植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強 型啟動子或誘導型啟動子。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用 植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的選擇性標記基因(⑶S基因、螢光素酶基 因等)或具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)。從轉基因植物 的安全性考慮，也可不加任何選擇性標記基因，直接以表型篩選轉化植株。攜帶有本發明GmMADSl的植物表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載 體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，并 將轉化的植物組織培育成植株。被轉化的植物宿主既可以是水稻、小麥、玉米等單子葉植 物，也可以是大豆、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜蓿等雙子葉植物。下面結合附圖及實施例對本發明做進一步說明。
圖IGmMADSl基因的組織表達分析。采用半定量RT-PCR技術進行不同大豆組織GmMADSl的組織表達研究，Actinl基 因的表達為內參圖2 335S =GmMADSl轉基因煙草萼片、花瓣和雄蕊的數目增加。A，D，F表示野生型煙草(WT)的花瓣、雄蕊和萼片均為5枚；B，C，E，G表示野生型煙草的花瓣、雄蕊和萼片均為6枚；D-E中標尺代表Imm圖3 35S =GmMADSl轉基因煙草異常的花器官。(A)WT的花型；(B)35S =GmMADSl轉基因煙草萼片開裂；(C) 35S=GmMADSl轉基因煙 草花瓣開裂；(D) 35S =GmMADSl轉基因煙草萼片轉變為花瓣；(E-G) 35S =GmMADSl轉基因煙 草雄蕊轉變為花瓣。圖4 35S =GmMADSl轉基因煙草的花絲變短卷曲。(A)WT的花型；⑶WT的花絲；(C)WT花絲外表皮掃描電鏡圖片；(D) 35S =GmMADSl 轉基因煙草的花型；(E) 35S =GmMADSl轉基因煙草的花絲；(F) 35S =GmMADSl轉基因煙草的 花絲外表皮掃描電鏡圖片；A. B. D. E中標尺代表1mm，C中標尺代表3 μ m，F中標尺代表 5 μ m。圖535S =GmMADSl轉基因煙草的花藥不開裂、花粉萌發活力下降。(A-B)WT 的花藥；(C-D) 35S =GmMADSl 轉基因煙草的花藥；(E) WT 和 35S =GmMADSl 在顯微鏡下1個視野內花粉數目的平均值(η = 10) ； (F)WT和35S =GmMADSl在顯微鏡下1 個視野內花粉萌發率的平均值(η = 10) ； (A)中標尺代表100 μ m,⑶中標尺代表100 μ m， (C)中標尺代表100 μ m，(D)中標尺代表50 μ m。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明，均為常規方法。實施例1、大豆MADS-box基因GmMADSl的cDNA克隆與鑒定根據GmMADSl的全長序列設計引物，上游引物5‘ -GAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3 ‘下游引物5‘ -CAAGGAAGAGGCTAGCTAGG-3 ‘應用RT-PCR方法，從大豆品種Jackson (公知公用，國家大豆改良中心可購買) 中克隆了 GmM舒暢ADSl基因。取大豆花和花芽的混合物，用研缽研碎，加入盛有裂解液 的1.5mL EP管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內。勻漿后移至1.5mL EP管中，抽提總 RNA(TRIzol Reagents, Invitrogen，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質量，然后在分 光光度計上測定RNA含量。以獲得的總RNA為模板，按照美國Promega公司提供的反轉錄 試劑盒的說明書進行反轉錄，合成cDNA第一鏈。進行PCR擴增反應。PCR程序如下94°C 預變性4分鐘，94°C變性30s，55°C復性lmin，72°C延伸2min，33個循環后，72°C IOminJf 931bp的PCR產物進行克隆至pMD18-T載體，測序后獲得具有完整編碼區的大豆MADS-box 基因 GmMADSl 的 cDNA 序列 SEQ ID NO. 1 ；實施例2、大豆GmMADSl基因在不同組織中的表達特征大豆品種Jackson于正常季節種植于南京農業大學網室中。取大豆六復葉期的 根、莖和葉，大豆盛花期(Rl)取花和花芽的混合物，大豆初莢期(R3)的莢，開花后20天幼 嫩的種子，液氮速凍存于-80°C備用。大豆盛花期取完整的花無菌分割成萼片、花瓣、雄蕊、 雌蕊，液氮速凍存于-80°C備用。總RNA的提取同實施例1。以大豆組成型表達的Actin基因(GenBank accessionNo. V00450)為內部參照，以來自大豆不同組織的總RNA為模板，進行RT-PCR分 析。RT-PCR分析表明GmMADSl在包括花、種子和莢等生殖器官表達，在營養器官(根、莖和 葉)不表達，在莖生長點中表達(圖1)，說明該基因在調節該組織細胞增殖上可能也起到一定的作用。進一步我們分析了 GmMADSl在花瓣、雄蕊、心皮和萼片中的表達情況，結果顯示 該基因在四輪花器官中都表達，但花瓣和雄蕊中表達量較大(圖1)，說明該基因最有可能 參與花瓣和雄蕊的發育。實施例3、GmMADSl的基因工程應用根據GmMADSl的cDNA序列，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游引物上引入BamH I限制性內切酶位點，下游引物引入SacI限制性內切酶位點上游引物5-AGGATCCGAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3下游引物5-AGAGCTCCAAGGAAGAGGCTAGCTAGG-3以1)中獲得的PCR擴增產物為模板，經PCR擴增后，將GmMADSl的cDNA克隆至中 間載體PMD18-T，進一步克隆到雙元表達載體pBI121 ；用凍融法將獲得的表達載體轉入農 桿菌菌株LBA4404，通過農桿菌介導法轉化煙草，對獲得的轉基因植株進行表型和細胞學分 析，發現GmMADSl的異位表達促使煙草提前開花、矮化，增加了萼片、雄蕊和花瓣的數目(圖 2)，產生了萼片、雄蕊向花瓣的轉變，出現子房狀萼片、開裂的花瓣和彎曲的雄蕊等(圖3)， 而且由于雄蕊彎曲和縮短，導致雄蕊無法觸及雌蕊(圖4)；此外，GmMADSl轉基因植株的花 藥不能正常開裂，花粉的活力降低，最終導致轉基因植株育性下降甚至完全不育(圖5)。因 此我們認為GmMADSl在花瓣位置和數目的確定以及雄性器官發育方面發揮了重要的調控 作用。利用GmMADSl基因獲得的花器官發生變異的新材料可用于農作物和觀賞園藝植物的 育種應用。
權利要求
大豆MADS-box基因GmMADS1，其序列為SEQ ID NO.1。
2 權利要求1所述大豆MADS-box基因GmMADSl的基因工程應用，包括1)大豆MADS-box基因GmMADSl的克隆根據大豆MADS-box基因GmMADSl的全長序列，設計兩端引物 上游引物5 ‘ -GAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3 ‘下游引物5 ‘ -CAAGGAAGAGGCTA GCTAGG-3 ‘取大豆品種Jackson花和花芽的混合物，提取總RNA，經反轉錄合成cDNA第一鏈后， 進行PCR擴增，PCR程序如下94°C預變性4分鐘，94°C變性30s，55°C復性lmin，72°C延伸 2min, 33個循環后，72°C IOmin,將PCR產物進行克隆至pMD18_T載體，測序后獲得具有完整 編碼區的大豆MADS-box基因GmMADSl的cDNA序列SEQ ID NO. 1 ；2)植物表達載體的構建根據大豆MADS-box基因GmMADSl的cDNA序列，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并 在上游引物上引入BamH I限制性內切酶位點，下游引物引入SacI限制性內切酶位點上游引物5-AGGATCCGAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3下游引物-c^-A GAGCTC CAAGGAA GAGGCTAGCTAGG-3以步驟1)中獲得的PCR擴增產物為模板，經PCR擴增后，將GmMADSl的cDNA克隆至中 間載體PMD18-T，進一步克隆到雙元表達載體pBI121 ；3)轉基因植株的獲得將步驟2)獲得的表達載體轉入農桿菌菌株LBA4404，進一步轉入煙草，對獲得的轉基 因植株進行PCR，RT-PCR驗證后進行植物的表型分析，獲得的GmMADSl轉基因植株提前開 花、矮化，萼片、雄蕊和花瓣的數目增加，產生了萼片、雄蕊向花瓣的轉變，出現子房狀萼片、 開裂的花瓣和彎曲的雄蕊，而且由于雄蕊彎曲和縮短，導致雄蕊無法觸及雌蕊，而不能正常 授粉；此外，GmMADSl轉基因植株的花藥不能正常開裂，花粉的活力降低，最終導致轉基因 植株育性下降甚至完全不育。
全文摘要
本發明公開了一個大豆MADS-box基因及其在花器官改造中的應用及其在花器官改造中的應用，屬于生物技術領域。GmMADS1是定位于細胞核內的轉錄因子，在四輪花器官中都有所表達，但花瓣和雄蕊中表達量較大，過量表達GmMADS1的煙草，增加了萼片、雄蕊和花瓣的數目，產生了萼片、雄蕊向花瓣的轉變，出現了開裂的花瓣和彎曲的雄蕊等，導致雄蕊無法觸及雌蕊，而不能正常授粉以及花藥不能正常開裂，花粉的活力降低。以上結果表明GmMADS1在花瓣位置和數目的確定以及雄性器官發育方面發揮了重要的調控作用。利用GmMADS1基因獲得的花器官發生變異的新材料可用于農作物和觀賞園藝植物的育種應用。
文檔編號C12N15/82GK101805740SQ201010156259
公開日2010年8月18日 申請日期2010年4月23日 優先權日2010年4月23日
發明者喻德躍, 遲英俊, 黃方 申請人:南京農業大學