一種植物葉脈特異性啟動子及其應用的制作方法

專利名稱：一種植物葉脈特異性啟動子及其應用的制作方法
一種植物葉脈特異性啟動子及其應用
技術領域：
本發明屬于植物基因工程領域，具體說是用分子生物學技術獲得一種新的植物葉 脈特異性啟動子及其在轉基因植物中的應用。
背景技術：
啟動子(promoter)是一段特定的直接與RNA聚合酶及轉錄因子相結合、決定基因 轉錄起始與否的DNA序列。一般來說，結構基因由三部分組成啟動子(promoter)、編碼區 (coding region)及終止子(terminator)。編碼區決定蛋白質的結構，終止子決定mRNA的 長度。啟動子包含核心啟動子區域和調控區域，核心啟動子區域產生基礎水平的轉錄，調控 區域能夠對不同的發育和環境信號作出應答，對基因的表達水平做出相應的調節。真核生物基因的表達與否、以及表達的時空變化，需要啟動子上的順式作用元件 與相應的轉錄因子的協同作用。近年來人們在啟動子方面展開了大量的研究工作，不僅從 不同植物基因組中克隆了大量的啟動子，而且對其結構和功能也有了一定的認識。根據植 物中啟動子啟動轉錄的模式可將其分為三類組成型啟動子、組織或器官特異性啟動子和 誘導型啟動子。組成型啟動了幾乎能在所有細胞、任何發育階段啟動基因轉錄；組織或器官 特異性啟動子調控下的基因轉錄一般只發生在某些特定器官或組織中；誘導型啟動子只有 在誘導因子的作用下才具有起始轉錄的活性。通過對已知的植物啟動子進行分析，發現具 有相同或相似的組織特異性以及具有相近誘導型的啟動子的順式作用元件之間有一定的 保守性，這些元件的種類、數量以及彼此之間的順序與距離都可能影響基因的轉錄與否或 轉錄程度(路靜等，2004)。花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子是目前植物基因工程中使用最多的組成型啟 動子，它具有多種順式作用元件驅使目的基因產生組成型表達。但是由于組成型啟動子驅 動的基因在植物各組織中均有不同程度表達，在植物基因工程的應用中逐漸暴露出一些問 題。例如外源基因在整株植物中表達，產生大量異源蛋白質或代謝產物在植物體內積累，打 破了植物原有的代謝平衡。另外，重復使用同一種啟動子驅動兩個或兩個以上的外源基因 可能引起基因沉默或共抑制現象(Kumpatla等，1998)。因此，迫切需要尋找更為有效的特 異性啟動子代替組成型啟動子，以更好地調控目的基因在轉基因植物中的表達模式。組織或器官特異性啟動子調控下的基因轉錄一般只發生在某些特定器官或組織 中，并往往表現出受發育調節的特性，因此可以用來契合研究目的進行有針對性地、特異、 高效地調控目的基因的表達，這為其在基因工程技術中的應用帶來了廣闊前景。隨著植物 分子生物學研究的不斷發展，目前在擬南芥、水稻、番茄、咖啡、百合等許多植物中已發現這 類組織、器官特異性啟動子，如PyklO啟動子在根中特異表達(Nitz等，2001)、RBCS1啟動子 在葉中特異表達(Marraccini等，2003)、Bp4A啟動子在花粉特異表達(Albani等，2000)、 番茄E8啟動子在成熟果實中特異表達(Sandhu等，2000)、LGCl啟動子在雄配子細胞中表 達(Singh等，2003)、水稻谷蛋白GluB-I基因啟動子在種子中特異表達(Takaiwa等，1986)
葉脈由貫穿在葉肉內的維管組織組成，是葉的輸導和支持結構。它為植物葉片提 供水分和無機鹽、輸出光合產物；又支撐著葉片，使之伸展于空間，保證葉的生理功能順利 進行。維管組織由木質部和韌皮部組成，韌皮部主要運輸植物體內糖等光合產物，因而成為 許多植物病蟲害的侵害目標。有針對性地在植物易受侵害的韌皮部高效表達抗病或抗蟲基 因，可以使轉基因植物具有病蟲害抗性。總之，獲得并有效利用組織或器官特異性啟動子不僅有助于闡明植物形態、發育、 代謝途徑等相關的基礎理論問題，更可以有目的地調節轉基因植物的發育、改善農作物的 品質和產量，勢必將成為農作物性狀改良與新品種培育的強有力工具，具有廣泛的應用價值。

發明內容本發明目的是解決現有技術中，因使用組成型啟動子，使外源基因在整株植物中 表達并產生大量異源蛋白質或代謝產物積累在植物體內，打破了植物原有的代謝平衡，因 有些產物對植物并非必需甚至有毒，因而阻礙了植物的正常生長，甚至導致死亡，以及重復 使用同一種組成型啟動子可能引起基因沉默或共抑制現象等問題；同時也有別于葉片特異 性啟動子的全葉片活性，針對于研究植物維管組織分化和物質運輸機理等需要以及依據例 如許多植物病蟲害的主要侵害目標是葉脈韌皮部、需要進行有針對性的抗病蟲害目的基因 表達等植物基因工程技術研究的需要，提供一種新的植物葉脈特異性啟動子及其在轉基因 植物中的應用。本發明提供了一種新的、1107bp的植物葉脈特異性啟動子，該啟動子是由原長 2390bp的啟動子截短后獲得，長2390bp的原啟動子可以驅動報告基因在擬南芥黃化苗、 根、子葉、真葉、花和種莢等器官中表達(TsUChisaka，2004)，但在本發明所述位置截短為 1107bp以后，表現出葉脈特異性活性，因此我們將該截短的啟動子命名為葉脈特異性啟動 子(vein-specific promoter)，簡稱VS啟動子。該啟動子核酸序列選自(a)如序列表1所示的核酸序列；(b)在(a)限定的核酸序列中至少具有85%以上的同源性的核酸序列。作為具體應用的實例，本發明提供了一種VS啟動子的克隆方法，具體操作步驟如 下第一、以擬南芥基因組DNA為模板，用PCR方法擴增VS啟動子；第二、回收PCR擴增產物；第三、將上述第二步回收的擴增產物，與pGEM-T-Easy載體(購自Promega公司) 在連接酶催化下進行連接反應；第四、將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞；第五、通過抗性篩選，獲得該啟動子的陽性TA克隆。本發明同時提供了一種葉脈特異性啟動子的應用，S卩利用獲得的葉脈特異性啟 動子，構建獲得“VS啟動子-目的基因”的融合基因，進行植物轉化，從而獲得基因組中含有 以上所述啟動子核酸序列的、可在葉脈特異性表達目的基因的轉基因植物。其中所述的融 合基因中的目的基因可以是任何針對基礎研究、轉化技術或者農作物性狀改良需要的目的基因。
作為具體應用的實例，本發明提供了一種“VS啟動子-GUS報告基因”融合基因的 構建及其在轉基因植物葉脈中的特異表達。操作過程如下所述應用中的融合基因“VS啟動子-GUS報告基因”的構建方法，包括如下步驟第一、用BamHI/Ncol雙酶切含有VS啟動子的TA克隆質粒，回收VS啟動子片段；第二、用BamHI/Ncol雙酶切pCAMBIA 1301 (購自CAMBIA公司)質粒，回收大的載 體片段(其中含有報告基因GUS的編碼序列)；第三、混合上述第一步得到的VS啟動子片段和第二步得到的pCAMBIA 1301載體 片段，在連接酶催化下進行連接反應，完成在pCAMBIA 1301載體上的“VS啟動子-GUS”融 合基因的構建。其中所設計的擬南芥葉脈特異性表達的VS啟動子的PCR擴增引物如下，其中上游 引物引入了 BamHI酶切位點，下游引物引入了 Nco I酶切位點上游引物5，-ACGGATCCGAACTAGGTCTAGTCACGTGGT-3，下游引物5，-ACCCATGGGCTGTGTCAATTCTCACTTCTT-3，所述應用中的“VS啟動子-GUS報告基因”在轉基因植物葉脈中特異表達，操作過 程如下擬南芥轉化的具體方法，采用農桿菌介導的Floral infiltration (Tague，2001) 方法，獲得的種子經過50mg/L潮霉素抗性篩選，生長正常的抗性植株轉土培養；微型番茄 Micro-Tom轉化的具體方法，采用農桿菌介導的遺傳轉化方法(Meissner，1997)，轉化芽經 過10mg/L潮霉素抗性篩選后誘導生根，隨后將抗性苗移土培養至開花結果；利用組織化學 染色的方法(Blume和Griersonl，1997)，檢測轉基因擬南芥和微型番茄Micro-Tom中⑶S 報告基因表達的葉脈特異性。本發明的優點和積極效果本發明利用有效的葉脈特異性啟動子代替組成型啟動子，可以用于構建在植物葉 脈特異性表達目的基因的融合基因。利用遺傳轉化技術將其轉入植物基因組中，可以實現 對目的基因的定向操作，獲得葉脈特異性表達目的基因的轉基因植物。這種新的葉脈特異 性表達啟動子不僅對于研究植物維管組織分化和物質運輸機制有重要意義，也為植物基因 工程技術的研究和應用提供有重要價值的啟動子和元件。本發明具有廣泛的應用價值，必 將成為農作物性狀改良與新品種培育的強有力工具。

圖1是VS啟動子-GUS轉基因擬南芥植株的PCR鑒定；泳道M :plus2000Marker ； 泳道1 =H2O為模板的PCR的負對照；泳道2 :VS啟動子-GUS質粒為模板的PCR的正對照；泳 道3 用野生型擬南芥的基因組DNA為模板的負對照；泳道4-10 =VS啟動子-GUS轉基因擬 南芥植株的基因組DNA為模板的PCR產物。圖2是VS啟動子-GUS轉基因擬南芥植株的GUS染色結果，其中，圖a 成熟蓮座 葉；b 成熟的葉片；c 主莖；d 發育的種莢。圖3是VS啟動子-GUS轉基因微型番茄Micro-Tom葉片的⑶S染色結果。
具體實施方式實施例1 葉脈特異性的VS啟動子克隆第一、以擬南芥基因組DNA為模板利用PCR方法擴增1107bp的VS啟動子，回收擴 增產物并進行TA克隆。(I)PCR擴增目的片段根據已知的擬南芥VS啟動子區的序列設計特異引物，在上游引物中引入BamHI酶 切位點，在下游引物中引入Nco I酶切位點。上游引物5，-ACGGATCCGAACTAGGTCTAGTCACGTGGT-3‘(引入BamHI 切點)下游引物5，-ACCCATGGGCTGTGTCAATTCTCACTTCTT-3‘(引入Nco I 切點)按常規方法提取擬南芥基因組DNA，以基因組DNA為模板，利用上述引物進行PCR 擴增，制備VS啟動子片段。PCR反應體系 PCR反應程序94 °C 5 分鐘；94"C 30 秒，60°C 1 分 30 秒，30 個循環；72 "C 10 分鐘；4°C 保溫。(2)目的片段的克隆和陽性克隆的鑒定①目的片段的回收通過瓊脂糖凝膠電泳回收目的DNA片段，回收方法采用大連寶生物(TaKaRa)公司 的DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒，具體操作步驟見商品說明書。②連接加入下列反應體系的試劑，16°C反應過夜，實現目的片段與pGEM-T-Easy (購自 Promega公司)載體的連接。
6 ③轉化和陽性克隆的鑒定按常規的CaCl2誘導和轉化方法，制備大腸桿菌DH5 α感受態細胞，用10 μ L連 接產物轉化感受態細胞，然后均勻涂布到含有Amp、X-gal和IPTG的平板上，37°C倒置培養 12-14小時。挑選轉化平板上的白色菌落，按常規方法提取質粒，用BamH I和Nco I雙酶 切，產生3kb的pGEM-T-Easy載體片段和包含VS啟動子的1107bp片段。按前面所述的PCR 引物和擴增條件，以質粒提取物為模板，進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測產生1107bp 的VS啟動子片段，即為含有VS啟動子序列的陽性克隆。④測序驗證經過鑒定的陽性克隆，送交菌穿刺培養物到Sangon(上海生工生物技術有限公 司)進行DNA測序，其核酸序列如序列表1所示。實施例2 利用pCAMBIA1301載體(含有⑶S報告基因)構建“VS啟動子-GUS”融
合基因(1)從大腸桿菌中提取載體pCAMBIA 1301質粒(該菌株可從生物公司或CAMBIA 購買)，用BamH I/Nco I雙酶切后回收大的載體片段(其中包含有GUS報告基因序列)。(2)從實施例1所制備的TA克隆中提取質粒，用BamH I/Nco I雙酶切，通過瓊脂 糖凝膠電泳回收(同實施例Dvs啟動子片段。(3)將上述2個片段在連接酶催化下于16°C連接過夜，完成pCAMBIA 1301載體上 的“VS啟動子-GUS”融合基因構建。連接體系 (4)用連接混合物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，方法同實施例1。(5)挑選轉化平板(Kan抗性)上的白色菌落，按常規方法提取質粒，用BamH I和 BstE II雙酶切質粒DNA產生兩個片段，一個是8728bp的pCAMBIA 1301載體片段，另一個 是3430bp的“VS啟動子-GUS”融合基因。(6)以質粒為模板進行PCR反應，鑒定質粒中的“VS啟動子-GUS”融合基因，擴增 片段的大小是1390bp。所用引物如下上游引物5，-ACGGATCCGAACTAGGTCTAGTCACGTGGT-3，
下游引物5，-TCGCGATCCAGACTGAATGCC-3，(7)經過酶切和PCR鑒定的陽性克隆，送交測序公司測序。(8)從陽性克隆中提取質粒，用常規方法轉化農桿菌LBA4404，獲得工程化農桿 菌，用于植物轉化。實施例3 轉基因擬南芥的制備(1)用實施例2構建的“VS啟動子-GUS”融合基因轉化擬南芥，具體轉化方法采用 農桿菌介導的Floral infiltration (Tague, 2001)方法，獲得的種子經過50mg/L潮霉素抗 性篩選，生長正常的植株轉土培養。(2)轉基因植株的PCR檢測分別剪取轉基因植株和野生型植株的葉片，參考《分 子克隆實驗指南(第三版)》(黃培堂等，2002)方法提取葉片基因組DNA，用如下引物進行 PCR反應，反應體系如同實施例1 :上游引物5，-ACGGATCCGAACTAGGTCTAGTCACGTGGT-3，下游引物5，-TCGCGATCCAGACTGAATGCC-3，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，轉基因植株出現1390bp的“啟動子-GUS”融合基因 條帶，非轉基因植株未出現融合基因條帶，證明目的片段已整合到植物基因組中(見圖1)。(3)轉基因擬南芥葉脈特異性表達GUS報告基因的檢測利用組織化學染色(Blume和Grierson，1997)的方法，檢測在轉基因植物中VS啟 動子驅動下GUS表達的器官特異性和發育特異性。在轉基因植物各個器官、組織或細胞中 的藍色為報告基因GUS的組織化學染色，代表著VS啟動子在這些部位具有表達活性。染色 時間為5小時左右，將材料的染色結果掃描成圖片后保存。染色結果如圖2 光周期16h光/8h暗條件下，在“VS啟動子-GUS”轉基因擬南芥 的成熟葉葉脈中都有很強的GUS活性，而在葉肉、主莖、花以及種莢中則沒有GUS表達(圖 2)。結果證明VS啟動子可以驅動GUS報告基因在轉基因擬南芥的葉脈中特異性表達；說 明該啟動子在轉基因植物中具有很好的葉脈特異性，可以驅動目的基因在轉基因植物的葉 脈中進行特異表達。實施例4 轉基因微型番茄Micro-Tom的制備(1)用實施例2構建的“VS啟動子-GUS”融合基因轉化微型番茄Micro-Tom，具體 轉化方法采用農桿菌介導的遺傳轉化方法(Meissner，1997)，轉化芽經過10mg/L潮霉素抗 性篩選后誘導生根，將生根較好的植株移土培養至開花結實，從而獲得轉基因番茄植株；(2)轉基因植株的PCR檢測葉片基因組DNA的提取、所用引物以及反應體系同實 施例3。(3)轉基因微型番茄葉脈特異表達⑶S報告基因的檢測利用組織化學染色(Blume和Grierson，1997)的方法，檢測在轉基因微型番茄中 VS啟動子驅動下GUS表達的器官特異性和發育特異性(同實施例3)。染色結果如圖3 光周期16h光/8h暗條件下，在“VS啟動子-GUS”轉基因微型番 茄的葉脈中都有很強的GUS活性，而在葉肉和其他器官中沒有GUS活性(圖3)。該實驗結果 也進一步證明了 VS啟動子在轉基因植物中具有很好的葉脈特異性，可以驅動目的基因在 轉基因植物的葉脈中進行特異表達。該啟動子在研究植物維管組織分化和物質運輸機理、 以及利用基因工程技術進行農作物性狀改良與新品種培育，例如依據許多植物病蟲害的主要侵害目標是葉脈韌皮部而進行有針對性的抗病蟲害目的基因表達等植物基因工程技術 的研究和應用中具有重要價值。參考文獻黃培堂，等譯.《分子克隆實驗指南》(第三版)，北京科學出版社，2002路靜，趙華燕，何奕昆等.高等植物啟動子及其應用研究進展.自然科學進展， 2004，8 (14) 856 862Albani DL, Robert S， Donaldson PA, et al.Characterization of a pollen-specific gene family fromBrassica napus which is activated during early microspore development. Plant Mol. Biol.，2000，15(4) :605 622Blume B，Grierson D. Expression of ACC oxidase promoter-gus fusions in tomato and nicotianaplumbaginifolia regulated by developmental and environmental stimuli. Plant Journal，1997，12 :731 746Fehr WR, Caviness CE, Burmood DT, Pennington JS. Stage of development descriptions forsoybeans, Glycine max (L.)Merri11. Crop Sci.1971，11 :929 931Kumpatla SP,Chandrasekharan MB，Lyer LM,et al. Genome intruder scanning and modulationsystems and transgene silencing. Trends in Plant Science，1998， 3(3) 97 104Marraccini P，Courjault C，Caillet V.，et al. Rubisco small subunit of Coffea arabica :cDNA sequence, gene cloning and promoter analysis in transgenic tobacco plants Plant· Plant· Physiol· Biochem·，2003，41 :17 2Meissner R，Jacobson Y，Melamed S，et al. A new model system for tomato genetics.Plant Journal,1997，12 1465 1472Nitz I，Berkefeld H，Puzio PS, et al. PyklO, a seedling and root specific gene and promoter fromArabidopsis thaiiana· Plant Sci，2001，161 :337 346Sandhu JS,Krasnyanski SFiDomier LL,et al. Oral immunization of mice with transgenic tomatofruit expressing respiratory syncytial virus-F protein induces a systemic immune response. Transgenic Res.，2000，9 :127 135Singh M，Bhalla PL，Xu H，et al. Isolation and characterization of a flowering plant male gameticcell-specific promoter. FEBS Lett.，2003，542 :47 52Tague BW· Germ-line transformation of Arabidopsis lasiocarpa. Transgenic Research，2001，10 259 267Takaiwa F，Kikuchi S，Oono K. The struchure of rice storage protein glutelin precursor deduced fromcDNA. FEBS Lett.，1986，206 :33 35Tsuchisaka A，Theologis A. Unique and overlapping expression patterns among the Arabidopsisl-Amino-Cyclopropane-I-Carboxylate Synthase gene family members. Plant Physiol. 2004，136 2982 3000
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權利要求
一種植物葉脈特異性啟動子，其核酸序列選自(a)如序列表1所示的核酸序列；(b)在(a)限定的核酸序列中至少具有85％以上的同源性的核酸序列。
2.根據權利要求1所述的啟動子，其特征在于，所設計的VS啟動子的PCR擴增引物如 下，其中上游引物中引入了 BamHI酶切位點，下游引物中引入了 Nco I酶切位點上游引物5’ -ACGGATCCGAACTAGGTCTAGTCACGTGGT-3‘ 下游引物5，-ACCCATGGGCTGTGTCAATTCTCACTTCTT-3’。
3.根據權利要求1所述的啟動子，其特征在于，從擬南芥基因組DNA中克隆獲得VS啟 動子，具體操作步驟如下(1)以擬南芥基因組DNA為模板，用PCR方法擴增VS啟動子；(2)回收PCR擴增產物；(3)將上述(2)步回收的擴增產物，與pGEM-T-Easy載體在連接酶催化下進行連接反應；(4)將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞；(5)通過抗性篩選，獲得該啟動子的陽性TA克隆。
4.一種權利要求1所述的植物葉脈特異性啟動子的應用，其特征在于，利用該啟動子 構建獲得“VS啟動子-目的基因”的融合基因，將其轉化植物，從而獲得基因組中含有權利 要求1所述啟動子核酸序列的、可在葉脈特異性表達相應目的基因的轉基因植物。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，利用該啟動子構建獲得“VS啟動子-GUS” 融合基因，在轉基因擬南芥中驅動GUS報告基因在葉脈中特異性表達；在轉基因微型番茄 Micro-Tom中，該啟動子也能驅動⑶S報告基因在葉脈中特異性表達。
全文摘要
一種植物葉脈特異性啟動子及其應用。該啟動子核酸序列如序列表1所示，它可以驅動目的基因在植物葉脈中特異性表達。本發明克隆了VS啟動子序列，并通過檢測“VS啟動子-GUS”融合基因在轉基因擬南芥各個器官中的表達水平，證明VS啟動子在擬南芥中具有獨特的葉脈特異性活性；同時，以“VS啟動子-GUS”融合基因轉化微型番茄Micro-Tom，進一步證實“VS啟動子-GUS”融合基因也只在轉基因番茄的葉脈中特異性表達。應用本發明的啟動子，構建獲得“啟動子-待表達目的基因”的融合基因，進行植物轉化可獲得在葉脈特異性表達目的基因的轉基因植物。該啟動子不僅可以用于研究植物維管組織分化和物質運輸機理等，更在植物基因工程技術的研究和應用中具有重要價值。
文檔編號C12N15/113GK101880666SQ20101015611
公開日2010年11月10日 申請日期2010年4月27日 優先權日2010年4月27日
發明者李姝 , 王寧寧, 金鳳 申請人:南開大學