專利名稱：二氫雙環內酯的制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及食品生物技術領域，具體涉及利用米曲霉、黑曲霉制備二氫雙環內酯 的方法，以及二氫雙環內酯在制備香精香料、風味調節劑的用途。
背景技術：
二氫雙環內酯最初從青霉的代謝產物分離得到。該化合物具有抗潰瘍活性， 目 ItT ± 胃 # 力胃· iiffl (Aldridge, David C. et al. Pharmaceutical Compositions. US patent4103023) 0然而采用青霉生產該化合物，發酵液中可能產生非食品成分，具有 一定食品安全風險。AJ Birch等人報道其他曲霉屬可以產生二氫雙環內酯(AJ Birch, Metabolites of Aspergillus indicus :The structure and some aspects of the biosynthesis ofdihydrocanadensolide, Australian Journal of Chemistry,1968， 21 (11) =2775-2784)，但由于使用半合成培養基，引入了一些非食品工業允許添加的成分， 純化難度較大，也不適合用于食品工業。此外，以上文獻均未報道該化合物的醬香風味特性 及風味素用途。
發明內容
本發明提供一種利用米曲霉發酵制備具有醬香風味的化物二氫雙環內酯的方法， 采用天然培養基及食品用菌種，安全性好。本發明所述的二氫雙環內酯及米曲霉發酵制備方法包括如下步驟1.以糧食為原料，經蒸煮、接種0. 03% (w/w)米曲霉或黑曲霉培養，得到大曲；2.將大曲與15 20 % (w/w)食鹽水以1 2. 5-5 (w/w)混合，20 30 °C水解 30-60d，得水解液；3.將水解液離心，去除沉淀，得水解上清液；4.將水解上清液與等體積的乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相，減壓濃縮至干， 得粗提物。5.將粗提物用乙酸乙酯溶解，再與230-400目硅膠G粉混合，裝層析柱，以正己 烷_丙酮混合液進行洗脫，得洗脫液，所述乙酸乙酯的重量為粗提物的1-3倍，硅膠G粉的 重量為粗提物和乙酸乙酯的混合溶液的1-3倍；6.將洗脫液濃縮、蒸餾，得到無色透明粒狀晶體，即為二氫雙環內酯。在步驟(1)中，糧食為大豆、豆粕、小麥、面粉、麩皮中的一種或一種以上。蒸煮的 溫度為100°C 125°c，蒸煮的時間為6min 20min。培養的溫度為28 V 36°C，濕度為 70% 95%，培養時間為40h 72h。在步驟(3)中，離心的轉速為1500rpm 4800rpm，離心時間為10 20min。在步驟⑷中，減壓濃縮的溫度是30 55°C，真空度為0. 08MPa 0. IMPa0在步驟(5)中，以正己烷丙酮=99% 50% 50%進行洗脫。采用二氫雙環內酯用作香精、香料、風味調節劑及制備復合香精香料，可以增強和改善醬油和醬料的風味。本發明與現有技術相比，具有如下優點該方法采用天然食品成分和食品工業中允許使用的微生物生產二氫雙環內酯，無精細化工產品，無二次污染，且反應條件溫和，能 耗低，安全性好。
圖1為具體實施方式
制得的二氫雙環內酯的質譜圖。圖2為具體實施方式
制得的二氫雙環內酯的單晶結構分析圖。圖3為具體實施方式
制得的二氫雙環內酯的13C核磁共振圖譜。圖4為具體實施方式
制得的二氫雙環內酯的1H核磁共振圖譜。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明的具體實施作進一步說明，但本發明的實施和保護范圍 不限于此。實施例1 1.大豆在水中浸泡6h，于121°C加熱lOmin，冷卻后，與面粉以4 l(w/w)，進行混 合，均勻拌入占大豆和面粉重量0.03% (w/w)的米曲霉3. 042孢子，于培養箱中30°C，濕度 為90%的條件下進行48h培養，得到大曲。2.將大曲與濃度為20% (w/w)食鹽水以重量1 2. 5混合，30°C水解30d，得水解液。3.將水解液4800rpm離心lOmin，去除沉淀，得水解上清液。4.將水解上清液以等體積的乙酸乙酯萃取三次，30°C，真空度為0. OSMPa減壓濃 縮至干，得粗提物。5.將粗提物用乙酸乙酯溶解，再與300目硅膠G粉混合，裝層析柱，以正己烷-丙 酮混合液進行梯度洗脫，得洗脫液，所述粗提物與乙酸乙酯的重量比為1 1，粗提物和乙 酸乙酯的混合溶液與硅膠G粉的重量比為1 1，正己烷-丙酮混合液中，正己烷與丙酮的 重量百分比比為50% 50%;將洗脫液靜置揮發溶劑后，得到無色透明粒狀晶體，mp 90 920C，經氣相色譜_質譜聯用、核磁共振、單晶X射線衍射證實為6 β -η- 丁基-3，3a α，6， 6a α -四fi -3a-甲基呋[3，4_b]-呋喃_2，4_ 二酮，如圖1 4分別為二氫雙環內酯的質譜 圖、單晶結構分析圖、13C核磁共振圖譜和1H核磁共振圖譜，其結構式如下
<formula>formula see original document page 4</formula> 6.經感觀鑒評，二氫雙環內酯具有天然的醬香，香氣醇厚。添加到調味品中可增進醬香氣，改善風味。實施例21.固體培養豆粕稍潤水，于110°C加熱20min，冷卻后，與面粉比例為4 1 (w/ w)，進行混合，均勻拌入占豆粕和面粉質量0.05% (w/w)的生產菌種黑曲霉孢子，于培養箱 中36°C，濕度為90%的條件下進行40h培養，45h后得到大曲。2.將大曲與濃度為18% (w/w)食鹽水以1 3混合，20°C水解60d，得水解液。3.將水解液2000rpm離心20min，去除沉淀，得水解上清液。4.將水解上清液以等體積的乙酸乙酯萃取三次，45°C，真空度為0. IMPa減壓濃縮 至干，得粗提物。5.將粗提物用乙酸乙酯溶解，再與250目硅膠G粉混合，裝層析柱，以正己烷-丙 酮混合液進行梯度洗脫，得洗脫液，所述粗提物與乙酸乙酯的重量比為1 1.5，粗提物和 乙酸乙酯的混合溶液與硅膠G粉的重量比為1 2，正己烷-丙酮混合液中，正己烷與丙酮 的重量百分比比為80% 20% ；將洗脫液濃縮，得到無色透明粒狀晶體，即為二氫雙環內酯。6.經感觀鑒評，分離所得的化合物具有天然的醬香，香氣醇厚。添加到調味品中可 改善風味。實施例31.固體培養豆粕潤水，于125°C加熱6min，冷卻后，與炒過且磨后的小麥粉以比 例為1 1混勻，再均勻拌入占豆粕和小麥粉質量0.03% (w/w)生產菌種米曲霉孢子，于培 養箱中28°C，濕度為90%的條件下進行50h培養，50h后得到大曲。2.將大曲與濃度為19% (w/w)食鹽水以1 5混合，25°C水解50d，得水解液。3.將水解液3500rpm離心15min，去除沉淀，得水解上清液。4.將水解上清液以等體積的乙酸乙酯萃取三次，55°C，真空度為0. OSMPa減壓濃 縮至干，得粗提物。5.將粗提物用乙酸乙酯溶解，再與400目硅膠G粉混合，裝層析柱，以正己烷-丙 酮混合液進行梯度洗脫，得洗脫液，所述粗提物與乙酸乙酯的重量比為1 3，粗提物和乙 酸乙酯的混合溶液與硅膠G粉的重量比為1 3，正己烷-丙酮混合液中，正己烷與丙酮的 重量百分比比為98% 2% ；洗脫組分靜置揮發溶劑后，得到無色透明粒狀晶體，經鑒定為 二氫雙環內酯。6.經感觀評價可得，分離所得的二氫雙環內酯醬香醇厚，添加到食品中可改善醬 香風味。
權利要求
二氫雙環內酯的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)以糧食為原料，經蒸煮，接種重量為所述糧食0.03％-0.05％的米曲霉或黑曲霉培養，得到大曲；(2)將大曲與質量濃度為15～20％的食鹽水以重量比1∶2.5-5混合，于20～30℃水解30-60d，得水解液；(3)將水解液離心，去除沉淀，得水解上清液；(4)將水解上清液與等體積的乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相，減壓濃縮至干，得粗提物；(5)將粗提物用乙酸乙酯溶解，再與230-400目硅膠G粉混合，裝層析柱，以正己烷-丙酮混合液進行洗脫，得洗脫液，所述乙酸乙酯的重量為粗提物的1-3倍，硅膠G粉的重量為粗提物和乙酸乙酯的混合溶液的1-3倍；(6)將洗脫液濃縮、蒸餾，得到無色透明粒狀晶體，即為二氫雙環內酯。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述糧食為大豆、豆粕、小麥、 面粉、麩皮中的一種以上。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述蒸煮的溫度為100°C 125°C，蒸煮的時間為6min 20min。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述培養的溫度為28°C 36°C，濕度為70% 95%，培養時間為40h 72h。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中，所述離心的轉速為1500rpm 4800rpm,時間為 10 20min。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)中，所述減壓濃縮的溫度是30 55°C，真空度為 0. 08MPa 0. IMPa。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(5)中，所述正己烷與丙酮的混合液 中，正己烷與丙酮的重量比為99% 50%: 50%。
8.根據權利要求1 7任一項所述的方法，其特征在于步驟(4)中所述萃取的次數為 3次。
9.權利要求1所述的二氫雙環內酯作為香精、香料或風味調節劑的應用。
10.權利要求1所述的二氫雙環內酯在制備復合香精香料中的應用。
全文摘要
本發明公開了二氫雙環內酯的制備方法及其應用。本發明的制備方法以米曲霉為菌種、糧食為原料，經固體發酵、水解、分離、提純得到二氫雙環內酯天然化合物。本發明所制得的二氫雙環內酯風味化合物是雙環的內酯化合物，該化合物具有純正的醬油風味，可作為香精香料用于醬油和醬料的風味強化。
文檔編號A23L1/221GK101831470SQ201010161739
公開日2010年9月15日 申請日期2010年4月26日 優先權日2010年4月26日
發明者任嬌艷, 崔春, 李瑩, 趙海鋒, 趙謀明 申請人:華南理工大學