專利名稱：巴爾通氏體固液雙相斜面培養基及其制備及應用方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物學技術領域的培養基及制備方法，具體是一種巴爾通氏 體固液雙相斜面培養基及其制備及應用方法。
背景技術：
巴爾通體(Bartonella)是一群革蘭氏陰性、氧化酶陰性、營養條件要求苛刻兼性 細胞內寄生的需氧桿菌，巴爾通體已包括19個種及亞種，其中已知7種可致人類疾病，分 別是桿菌樣、漢賽、五日熱、伊麗莎白、格雷范姆、克氏及文氏巴爾通體伯格霍夫亞種巴爾通 體。其中漢塞巴爾通體是致病譜最廣的巴爾通體種，不僅可引起免疫缺陷病人的桿菌性血 管瘤-桿菌性紫癜，還可致人類貓抓病、慢性淋巴結病、心內膜炎、視神經炎等疾病。巴爾通氏體主要感染宿主紅細胞及血管上皮細胞，目前該病原的分離培養方法主 要為血平板培養方法，首次分離通常需3-5周時間方能在血平板表面長出肉眼可見的小菌 落，次代培養生長周期可縮短為3-7天。但是血平板培養方法存在一下幾點不足(1)生長周期較長；(2)大規模培養需要大量平皿，耗費大量人力物力及時間；(3)血平板培養只能收集菌落，而無法對細菌分泌蛋白進行研究。經過對現有技術的檢索發現，2005年Maggi等進行了巴爾通體液體培養基 (BAPGM)研究(JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY，2005，2651-2655)，結果證實該液體培 養基能支持7種不同巴爾通體生長，且細菌生長數度顯著高于普通血平板培養基。但該液 體培養基配方復雜，需要NAD、NADP、各種氨基酸鹽等30余種物質，費用較高，對試劑配置實 驗人員要求也較嚴格。同時在培養基中加入了綿羊血，血細胞裂解釋放的蛋白極大的提高 了巴爾通體分泌蛋白分離工作的難度。因此開發一種操作簡單、配方經濟及方便后續研究 工作開展的培養體系尤為重要。
發明內容
本發明針對現有技術存在的上述不足，提供一種巴爾通氏體固液雙相斜面培養基 及其制備及應用方法，為動物感染模型構建提供充足病原，為其分泌蛋白鑒定等研究奠定
重要基礎。本發明是通過以下技術方案實現的本發明涉及一種巴爾通氏體固液雙相斜面培養基，包括斜面固體培養基及位于其 上層的液體培養基，其中斜面固體培養基與液體培養基的體積比為3 5。所述的斜面固體培養基是指血瓊脂固體斜面培養基，其組分及含量為牛肉浸出 液23. 0-30. 0g/L、淀粉1. 0g/L、氯化鈉5. 0g/L、瓊脂12. 0g/L、占總體積5%的脫纖維綿羊 血、余量為蒸餾水；所述的液體培養基是指酪蛋白胰酶水解大豆液體培養基，其組分及含量為酪蛋 白胰酶水解物17. 0-22. 0g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物3. 0-5. 0g/L、葡萄糖2. 5g/L、氯化鈉5g/L、磷酸二鉀2. 5g/L，余量為蒸餾水。本發明涉及上述巴爾通氏體固液雙相斜面培養基的制備方法，通過依次配置斜面 固體培養基和液體培養基，并依次取3 5的體積份混合后制備得到巴爾通氏體固液雙相
斜面培養基。所述的配置斜面固體培養基是指依次配取牛肉浸出液、淀粉、氯化鈉和瓊脂并加 入蒸餾水后加熱溶解，然后置于121°C環境下滅菌15min，待冷卻至50°C后添加總量為5% 的脫纖維綿羊血，最后倒入滅菌試管傾斜放置制成斜面固體培養基。所述的牛肉浸出液通過以下方式制備得到將切除脂肪、筋腱、肌膜的牛肉，用絞 肉機絞碎或用刀剁碎，按1 2比例加水放入適宜的玻璃容器內，攪拌均勻，置冰箱浸泡 20-24h，取出逐漸加熱煮沸lh，不斷攪拌，紗布過濾后取濾液分裝于瓶內，121°C高壓蒸汽滅 菌30min，待冷后，置冰箱保存備用。所述的液體培養基通過以下方式制備得到依次配取酪蛋白胰酶水解物、大豆木 瓜蛋白酶水解物、葡萄糖、氯化鈉和磷酸二鉀并加入蒸餾水后加熱溶解，然后置于121°C環 境下滅菌15min，制成液體培養基。所述的酪蛋白胰酶水解物為經胰酶水解的全酪蛋白，主要產物為氨基酸及小分 子量多肽，為培養基中的氮源。所述的大豆木瓜蛋白酶水解物為大豆經木瓜蛋白徹底水解，主要產物為細菌生 長的必須氨基酸。所述的依次取3 5的體積份混合是指向3體積份的斜面固體培養基的上表面 加入5體積份的液體培養基，制成固液雙相培養基。本發明涉及上述巴爾通氏體固液雙相斜面培養基的應用方法，通過挑取巴爾通氏 體單菌落，無菌操作放入上述配置的固液雙相斜面培養基中，蓋上棉花塞，然后將試管放入 二氧化碳濃度為5%，濕度為75%的培養箱中37°C培養。與傳統血瓊脂固體平板培養方式作對比，本發明制備得到的巴爾通氏體固液雙相 斜面培養基中達到107CFU/ml約需48小時，其生長數度提高2. 5倍，成本節約500倍(血 平板培養約需5天，達到107CFU需100個平皿)。本發明彌補了目前巴爾通氏體體外培養 方法細菌生長緩慢、費時費力、成本高等缺陷。本發明的意義在于可以為巴爾通氏體提供一 種快速便捷的培養體系，為動物感染模型構建提供充足病原，為其分泌蛋白鑒定等研究奠 定重要基礎。
圖1為實施例固液雙相斜面培養基示意圖。
具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明(選取營養條件需要不同的兩種巴爾通氏 體)，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操 作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1漢塞巴爾通氏體(Bartonella henselae)固液雙相培養基配置及培養(1)血瓊脂固體斜面培養基及血瓊脂平板培養基
牛肉浸出液23. 0g，淀粉1. Og，氯化鈉5. Og，瓊脂12. Og，水1L，加熱至50°C促其溶 解。分裝至合適的三角瓶內，121°C高壓滅菌15min。脫纖維綿羊血制備采集100ml健康綿羊的靜脈血，倒入無菌燒杯中，加入20顆滅 菌玻璃珠，120rpm/min搖蕩lOmin后，棄去玻璃珠，血液4°C保存待用。待培養基冷卻至50°C后添加總量為5%的脫纖維綿羊血，每管3ml倒入滅菌試管 傾斜放置，制成血瓊脂斜面培養基。(2)酪蛋白胰酶水解大豆液體培養基酪蛋白胰酶水解物17g，大豆木瓜蛋白酶水解物3g，葡萄糖2. 5g，氯化鈉5g，磷酸 二鉀2. 5g，加水至1L，45°C加熱至完全溶解，121°C高壓滅菌15min。(3)在試管中已配置好的固體斜面培養基上層加入5ml酪蛋白胰酶水解大豆液體 培養基固液雙相斜面培養基，用棉花塞封口后待用。(4)細菌培養如圖1所示，用接種環挑取單個漢塞巴爾通體菌落放入配置好的固液雙相斜面培 養基的上層液體培養基2中，棉花塞封口，放入二氧化碳濃度為5%，濕度為75%的培養箱 中37°C培養。(5)細菌濃度檢測每隔4小時進行一次細菌計數吸管取出100 iU雙相斜面培養基中的上層液體培 養基，1按照10-1倍比稀釋，然后每個稀釋度取100 u 1接種血液平板培養基中，待菌落形成 后計數。結果顯示培養48小時后菌液濃度為2. 3X 107CFU/ml，而血平板培養平均在98小 時長出肉眼可見的菌落，每塊平皿中含菌落大約為104CFU，因此固液雙相培養基中漢塞巴 爾通體生長速度提高了 2. 5倍，到達107CFU/ml濃度的菌液其成本只為普通血平板培養的 1/100。實施例2桿菌樣巴爾通體(Bartonella bacilliformis)固液雙相培養基配置及
培養(1)血瓊脂固體斜面培養基及血瓊脂平板培養基牛肉浸出液30. 0g，淀粉1. 0g，氯化鈉5. 0g，瓊脂12. 0g，水1000ml加熱促其溶解。 分裝至合適的三角瓶內，121°C高壓滅菌15min。脫纖維綿羊血制備采集100ml健康綿羊的靜脈血，倒入無菌燒杯中，加入20顆滅 菌玻璃珠，120rpm/min搖蕩lOmin后，棄去玻璃珠，血液4°C保存待用。待培養基冷卻至50°C后添加總量為8%的脫纖維綿羊血，每管3ml倒入滅菌試管 傾斜放置，制成血瓊脂斜面培養基。(2)酪蛋白胰酶水解大豆液體培養基酪蛋白胰酶水解物22g，大豆木瓜蛋白酶水解物3g，葡萄糖2. 5g，氯化鈉5g，磷酸 二鉀2. 5g，加水至1L，45°C加熱至完全溶解，121°C高壓滅菌15min。(3)在試管中已配置好的固體斜面培養基上層加入5ml酪蛋白胰酶水解大豆液體 培養基固液雙相斜面培養基，用棉花塞封口后待用。(4)細菌培養如圖1所示，用接種環挑取單個桿菌樣巴爾通體菌落放入配置好的固液雙相斜面 培養基的上層液體培養基2中，棉花塞封口，放入二氧化碳濃度為5%，濕度為75%的培養箱中37°C培養。(5)細菌濃度檢測每隔4小時進行一次細菌計數吸管取出100 iU雙相斜面培養基中的上層液體培 養基，1按照10—1倍比稀釋，然后每個稀釋度取100 u 1接種血液平板培養基中，待菌落形成 后計數。結果顯示培養48小時后菌液濃度為1. 5X 107CFU/ml，而血平板培養平均在138小 時長出肉眼可見的菌落，每塊平皿中含菌落大約為103CFU，因此固液雙相培養基中桿菌樣 巴爾通氏體生長速度提高了 3倍，到達107CFU/ml濃度的菌液其成本只為普通血平板培養 的 1/1000。
權利要求
一種巴爾通氏體固液雙相斜面培養基，包括斜面固體培養基及位于其上層的液體培養基，其特征在于斜面固體培養基與液體培養基的體積比為3∶5；所述的斜面固體培養基是指血瓊脂固體斜面培養基，其組分及含量為牛肉浸出液23.0-30.0g/L、淀粉1.0g/L、氯化鈉5.0g/L、瓊脂12.0g/L、總體積5％的脫纖維綿羊血，余量為蒸餾水；所述的液體培養基是指酪蛋白胰酶水解大豆液體培養基，其組分及含量為酪蛋白胰酶水解物17.0-22.0g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物3.0-5.0g/L、葡萄糖2.5g/L、氯化鈉5g/L、磷酸二鉀2.5g/L，余量為蒸餾水。
2.一種根據權利要求1所述的巴爾通氏體固液雙相斜面培養基的制備方法，其特征在 于，通過依次配置斜面固體培養基和液體培養基，并依次取3 5的體積份混合后制備得到 巴爾通氏體固液雙相斜面培養基。
3.根據權利要求2所述的巴爾通氏體固液雙相斜面培養基的制備方法，其特征是，所 述的配置斜面固體培養基是指依次配取牛肉浸出液、淀粉、氯化鈉和瓊脂并加入蒸餾水后 加熱溶解，然后置于121°C環境下滅菌15min，待冷卻至50°C后添加總量為5%的脫纖維綿 羊血，最后倒入滅菌試管傾斜放置制成斜面固體培養基。
4.根據權利要求3所述的巴爾通氏體固液雙相斜面培養基的制備方法，其特征是，所 述的牛肉浸出液通過以下方式制備得到將切除脂肪、筋腱、肌膜的牛肉，用絞肉機絞碎或 用刀剁碎，按1 2比例加水放入適宜的玻璃容器內，攪拌均勻，置冰箱浸泡20-24h，取出逐 漸加熱煮沸lh，不斷攪拌，紗布過濾后取濾液分裝于瓶內，121°C高壓蒸汽滅菌30min，待冷 后，置冰箱保存備用。
5.根據權利要求2所述的巴爾通氏體固液雙相斜面培養基的制備方法，其特征是， 所述的液體培養基通過以下方式制備得到依次配取酪蛋白胰酶水解物、大豆木瓜蛋白酶 水解物、葡萄糖、氯化鈉和磷酸二鉀并加入蒸餾水后加熱溶解，然后置于121°C環境下滅菌 15min，制成液體培養基。
6.根據權利要求5所述的巴爾通氏體固液雙相斜面培養基的制備方法，其特征是，所 述的酪蛋白胰酶水解物為經胰酶水解的全酪蛋白，主要產物為氨基酸及小分子量多肽，為 培養基中的氮源。
7.根據權利要求5所述的巴爾通氏體固液雙相斜面培養基的制備方法，其特征是，所 述的大豆木瓜蛋白酶水解物為大豆經木瓜蛋白徹底水解，主要產物為細菌生長的必須氨基酸。
8.根據權利要求5所述的巴爾通氏體固液雙相斜面培養基的制備方法，其特征是，所 述的依次取3 5的體積份混合是指向3體積份的斜面固體培養基的上表面加入5體積 份的液體培養基，制成固液雙相培養基。
9.一種根據權利要求5所述的巴爾通氏體固液雙相斜面培養基的應用方法，其特征在 于，將所述培養基至于二氧化碳濃度為5%、濕度為75%以及溫度37°C的環境下進行細菌 培養。
全文摘要
一種生物學技術領域的巴爾通氏體固液雙相斜面培養基及其制備和應用方法，包括由牛肉浸出液、淀粉、氯化鈉、瓊脂、脫纖維綿羊血和蒸餾水組成的斜面固體培養基以及酪蛋白胰酶水解物、大豆木瓜蛋白酶水解物、葡萄糖、氯化鈉、磷酸二鉀和蒸餾水組成的液體培養基。本發明制備得到的巴爾通氏體固液雙相斜面培養基中達到107CFU/ml約需48小時，其生長數度提高2.5倍，成本節約500倍(血平板培養約需5天，達到107CFU需100個平皿)，彌補了目前巴爾通氏體體外培養方法細菌生長緩慢、費時費力、成本高等缺陷。
文檔編號C12R1/01GK101838626SQ20101016929
公開日2010年9月22日 申請日期2010年5月12日 優先權日2010年5月12日
發明者華修國, 崔立, 朱建國, 楊志彪, 楊筱薇, 袁聰俐 申請人:上海交通大學