一種16型人乳頭瘤病毒L₂E₇基因在大腸桿菌中的優化表達方法

專利名稱：一種16型人乳頭瘤病毒L₂E₇基因在大腸桿菌中的優化表達方法
技術領域：
本發明屬于醫學生物技術領域，具體涉及16型人乳頭瘤病毒L2E7重組蛋白在大腸桿菌原核表達菌株的構建及其表達條件的優化。
背景技術：
人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)是一類具有嚴格宿主范圍和組織特 異性的病毒，主要感染人的皮膚或粘膜上皮細胞，引起感染部位發生病變。根據其生物學行 為可以將其分為高危型和低危型兩大類。低危型人乳頭瘤病毒的感染可引起良性腫瘤或 疣，如扁平疣、尖銳濕疣等；高危型人乳頭瘤病毒和宮頸癌的發生關系密切。大量分子流行 病學和分子生物學研究已經證明，感染高危型人乳頭瘤病毒HPV16，HPV18，HPV31、HPV33， HPV45是宮頸癌發生的主要病因，其中16型HPV在宮頸癌患者中的檢出率達50%。宮頸癌 占婦女因癌癥死亡原因的第二位，全世界每年有50萬新發病例，其中30萬人死于宮頸癌， 我國每年因宮頸癌而死亡的人數大約為5萬人。人乳頭瘤病毒的生物學特性人乳頭瘤病毒(HPV)是直徑為55nm、約有SOOObp 的小DNA病毒，由環狀雙鏈DNA形成的20面體對稱的無包膜病毒，在氯化銫中浮密度為 1. 34g/ml。以HPV16為例其基因組分為3個區E區、L區和非編碼區(UCR)，E區含8個早 期開放閱讀框ORF(El-ES)，分別編碼E1-E8早期蛋白，參與病毒DNA的復制、轉錄、翻譯調控 和轉化等功能；L區含2個晚期開放閱讀框ORF (Li、L2)，編碼主要結構蛋白Ll和次要結構 蛋白L2 ；URR區含有HPV基因組DNA的復制起點和HPV表達所必需的調控元件。高危型HPV的致癌特性主要由E6和E7這兩個編碼的早期蛋白引起的，E6蛋白包 含4個Cys-X-X-Cys的保守序列，這些鋅指結構具有與DNA、RNA結合和介導蛋白一蛋白相 互作用的功能，從而使病毒和宿主細胞發生整合。HPV整合人宿主細胞不僅使病毒的癌蛋白 得到長期穩定的表達，而且因插入造成宿主DNA的重排，相應的基因紊亂，對細胞的惡性轉 化起著重要作用。此外，E6蛋白還與野生型P53基因具有高度的親和性，二者極易結合促 使后者快速降解，從而使正常細胞生長周期失去調控造成細胞無限增殖并向惡性轉化。E7基因表達蛋白是一種只有98個氨基酸的小分子蛋白，其致癌過程主要通過作 用于人體細胞的抑瘤蛋白PRB蛋白來實現。pRB蛋白是一種重要的生長抑制蛋白，在細胞周 期調節中起關鍵作用。主要通過抑制某些轉錄因子(如E2F等)活性達到抑制細胞增殖的 目的。正常情況下，非磷酸化的PRb與E2F轉錄因子形成pRb-E2F復合物，從而抑制E2F對 靶基因的轉錄，抑制細胞增殖。當E7蛋白介入時，通過其結構上的Rb結合位點與非磷酸化 的pRb結合，造成pRb-E2F復合物分離，E2F的轉錄作用得到了釋放，轉錄的基因使細胞由 Gl期進入S期，導致細胞周期無法調控，細胞實現“永生化”。HPV病毒株很難從組織灶中分離得到，迄今為止還沒能建立起體外培養系統來進 行病毒的培養，并且E6、E7蛋白具有轉化活性，完整的病毒顆粒不大可能被發展為疫苗，現 在研制中的HPV疫苗大多屬于基因工程疫苗。這些疫苗根據其功能不同大致可分為兩大類，即預防性疫苗和治療性疫苗。
預防性疫苗研究較多的是病毒樣顆粒(virus like particles，VLPs)，通過誘發 中和抗體來防止病毒的感染或再感染。在天然HPV病毒顆粒形成過程中，衣殼蛋白包裝病 毒DNA形成成熟的病毒顆粒。研究表明，在許多表達體系如哺乳動物細胞、酵母和細菌中， 單獨Ll或Ll和L2共表達后可自行組裝成不含病毒DNA的病毒樣顆粒(VLPs)，這種病毒樣 顆粒與天然病毒顆粒有相似的空間構象、免疫特性和生物學活性。研究表明HPV VLPs能 通過MHC I途徑誘導產生細胞免疫。HPV16型Ll裝配成的VLPs經鼻免疫小鼠后，可在脾 及陰道淋巴組織中發生淋巴細胞增殖。以產生、干擾素的⑶4+T淋巴細胞增為主，髂骨淋 巴細胞中增生的T淋巴細胞具有T細胞殺傷(CTL)活性，說明VLPs可誘導MHC I類限制性 ⑶8+反應。因為VLPs不含病毒核酸，所以無潛在的致癌危險性，作為疫苗安全可靠。Ll和 L2共表達不僅可增加中和抗體的滴度，而且可加強病毒樣顆粒的裝配效率，提高VLPs的產 量，同時還可能增加有關的抗原表位以便獲得較強的局部黏膜免疫和系統的體液免疫和細 胞免疫反應。因此，以Ll和L2為保護性抗原構建的疫苗在預防HPV感染及其相關腫瘤方
面發揮著重要作用[1°]。病毒樣顆粒可通過大規模制備和純化來實現其商業化，目前由Merck、 GlaxoSmithKline和NIH生產的以VLPs為抗原的HPV預防性疫苗已經通過美FDA批準上 市。治療性疫苗通常以HPV的早期蛋白(E6、E7)作為靶抗原，旨在誘導特異性的細胞 免疫反應，用于宮頸癌的免疫治療。高危型HPV E6和E7蛋白，在宮頸癌及其癌前病變中可 以持續表達，而正常組織中不存在，所以這兩種蛋白可作為誘導腫瘤特異性CTL反應的理 想靶抗原。然而野生型的E6、E7蛋白免疫原性較弱，具有潛在的致癌性，并且不易被降解而 不利于抗原的遞呈。隨著HPV抗原表位結構研究的深入，在高危型HPV的E6和E7蛋白中， 已經發現多個能激發CTL的抗原表位[11]，HLA-I類分子限制的HPV-16E7蛋白中氨基酸序列 11 20(E7n_20)和86 93(E7關)。HPV16E7衍生的多肽與HLA-I類分子有高度親和性， 可以保護小鼠抵抗HPV16轉化的同系腫瘤細胞的致死性攻擊。HPV16陽性的宮頸癌患者體 外周血淋巴細胞經HPV16 E7n_2(1刺激后，所產生的CTL可以識別和攻擊腫瘤細胞[12]。目前，借助基因工程技術，對E6、E7蛋白進行修改或融合其他蛋白，去掉其癌蛋白 的致癌性，增加T細胞識別的特異性抗原表位以提高其免疫效果，已經研制出多種肽類疫 苗，有些已經進入I期或II期臨床試驗，其中基于E786_93表位的脂多化多肽疫苗在復發性 宮頸癌的治療中取得了很好的效果。近年來，隨著基因工程的發展，又出現了嵌合型VLP(cVLPs)，該類疫苗是原先VLP 疫苗的基礎上，在L1/L2蛋白的C末端插入一個異源蛋白，如HPV E6/E7等。嵌合型病毒樣 顆粒是同時含有HPV16L1、L2和E7部分表位或Li、L2和E6部分表位的VLP。嵌合型VLP 包含了更多的抗原表位，在刺激體液免疫的同時激活細胞免疫。研究表明[13]將未成熟的 樹突細胞(DC)與嵌合的HPV16 L1/L2-E7 VLPs共孵48小時，誘導了 CD80、CD83分子的明 顯上調和白介素2的分泌，聚焦顯微鏡下見到結合嵌合VLPs的細胞周圍被樹突細胞占滿。 而且，與HPV16 L1/L2-E7 VLPs共孵的DC誘導了 HLA-0201限制性的針對該蛋白的CTL反 應。該實驗說明嵌合HPV16-VLPS激活了未成熟DC的成熟，繼而誘導內源性的針對特定抗原表位的CTL反應，肯定了嵌合VLPs作為疫苗的高度免疫和有效性。Wakabashi MT等人同 時將晚期結構蛋白和E7蛋白的部分表位嵌合在一起刺激機體，不僅能激發體液免疫還能 激活細胞免疫，在誘發高滴度的中和抗體的同時，還可以誘導針對E7蛋白的CD8+CTL反應， 從而保護HPV轉化腫瘤的攻擊[14]。因此，cVLPs不但可用于制備預防性疫苗，而且可用于 制備治療性疫苗，具極大的應用前景。L2蛋白是HPV的次要結構蛋白，可以誘發產生中和抗體。早期蛋白E7在宮頸癌 細胞中能持續表達，可以作為理想的靶抗原來誘發特異性的T細胞免疫。因而，運用HPV16 L2E7重組融合蛋白進行免疫能起到預防和治療的雙重效果。
通過基因工程的手段，根據HPV16 L2E7重組融合蛋白的特性，結合成本、產量和純 化路線確定運用大腸桿菌原核表達系統來大量制備含有HPV晚期結構蛋白和早期轉化蛋 白部分結構域的HPV16 L2E7蛋白抗原，從而為HPV疫苗的研制埋下了堅實的基礎。由于HPV16 L2E7蛋白在原核表達系統中存在著質粒易丟失的現象，蛋白產量低，妨 礙了 HPV16 L2E7疫苗的開發和商品化。本發明通過構建并提供一株HPV16L2E7蛋白高效表 達菌株，并對其表達條件進行優化，來有效地解決上述問題。目前對宮頸癌的治療基本以手術和放療為主，給病人帶來很大的痛苦。預防HPV 相關癌癥的最有效的方法是研制特異性的疫苗，誘導機體產生中和抗體，激發保護性免疫 反應，達到有效預防與癌癥相關的HPV傳播的目的，降低宮頸癌的發生率。因此，研制高效、 安全、廉價的疫苗將有著巨大的經濟效益和社會效益。

發明內容
本發明的目的是構建一個HPV16 L2E7蛋白的高效表達菌株，提供一種HPV16L2E7蛋 白的優化表達方案。通過篩選得到具有高表達量的表達菌株，然后對所篩選的高表達菌株 的表達條件進行優化，為HPV16 L2E7在以后的大規模生產發酵提供一些依據。本發明的一個內容是通過基因克隆技術把HPV16 L2E7基因插入了 pET32a表達載 體，獲得一株高表達HPV16 L2E7蛋白的表達菌株。本發明公開了一種HPV16 L2E7蛋白在大腸桿菌原核表達菌株的構建及其表達條件 的優化方法，通過聚合酶鏈式反應擴增得到HPV16 L2E7目的基因，然后將擴增產物進行酶 切，繼而插入表達載體pET32a。經篩選鑒定得到正確的克隆后，在BL21(ED3)大腸桿菌中 進行表達，從中篩選出具有高表達水平的重組克隆菌，最后從(1)培養基成分，(2)培養基 PH條件，(3)誘導時機，即菌液在600nm波長下的光密度值(0D_)，(4)氨芐青霉素(AMP) 濃度，(5)接種量，(6)誘導劑異丙基硫代半葡萄苷(IPTG)濃度，(7)誘導溫度七個方面對 重組工程菌的表達條件進行了比較優化。通過優化試驗，得出一系列優化表達條件(1)含 有葡萄糖的M9-TY培養基，(2)培養基初始pH值7.0，(3)誘導時機為菌液在600nm波 長下的光密度(OD6J ^ 1. 1，(4)氨芐青霉素濃度50mg/L，(5)5%的接種量，(6) IPTG濃度 0. 25mM, (7)誘導溫度37°C。最終重組蛋白相對表達量大約為15%，包涵體得率接近13%。本試驗成功構建了 HPV16 L2E7基因的重組表達載體，并篩選得到了具有高表達水 平的重組工程菌。為下一步進行HPV16 L2E7蛋白的工業發酵，疫苗的下游研發提供參考依 據。HPV16 L2E7蛋白的高效表達方案，其實施方案如下
(1)將表達HPV16 L2E7蛋白的工程菌株大腸桿菌，在菌種固體培養基上劃線培 養，挑取單克隆菌落在3ml菌種培養基中活化培養過夜；(2)用于菌液培養的培養基以傳統的M9培養基為基礎，選擇不同的初始葡萄糖濃 度0.4% _6%，初始胰蛋白胨含量0.5% _1.0%，以及初始酵母提取物含量0.5% -1.0%, 將活化種子菌液按體積比5%的接種比例接種于IOOml培養基中，37°C下培養菌體OD6tltl至 0. 2-2.0，然后加異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)濃度至0. l-2mM進行誘導，在28-37°C條件下 繼續培養3-6小時；(3)取菌液1毫升，12000轉/分鐘離心1分鐘，用100微升凝膠上樣緩沖液重懸 沉淀，沸水煮10分鐘，進行分離膠濃度為8%的蛋白質凝膠電泳，用考馬斯亮藍染染色；(4)掃描凝膠圖像，然后用Quantity one 4. 6. 2軟件分析圖片，計算蛋白的相對
表達量。
通過基因克隆技術把HPV16 L2E7基因插入了 pET32a表達載體，獲得了一株高表達 HPV16 L2E7蛋白的表達菌株。所用到的培養基配方為菌種固體培養基胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化鈉10克，葡萄糖10克，瓊 脂粉5克，加水至1000毫升，高壓滅菌；菌種培養基為胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化鈉10克，葡萄糖10克，加水 至1000毫升，高壓滅菌；表達培養基為七水磷酸氫二鈉12. 8克，磷酸氫鉀3克，氯化鈉0. 5克，氯化銨1 克，葡萄糖0. 4克，1摩爾硫酸鎂2毫升，1摩爾氯化鈣0. 1毫升，胰蛋白胨5克，酵母提取物 5克，葡萄糖10克，加水至1000毫升，高壓滅菌。本發明的另一個內容是提供一種HPV16 L2E7蛋白的高效表達方案，通過正交試驗 的方法，來獲得其具體的表達條件。其實施方案如下(1)將表達HPV16 L2E7蛋白的工程菌株大腸桿菌(pET32a_HPV16L2E7/BL21DE3)，在 菌種固體培養基上劃線培養，挑取單克隆菌落在3ml菌種培養基中活化培養過夜。(2)用于菌液培養的表達培養基，選擇不同的初始葡萄糖濃度0. 4% _6%，初始胰 蛋白胨含量0. 5% -1. 0%以及初始酵母提取物含量0. 5% -1. 0%，將活化種子菌液按體積 比5%的接種比例接種于IOOml培養基中，37°C下培養菌體OD6c 至0. 2-2. 0，然后加IPTG濃 度至0. l-2mM進行誘導，在28-37°C條件下繼續培養3_6小時。(3)取菌液1毫升，12000轉/分鐘離心1分鐘，用100微升凝膠上樣緩沖液重懸 沉淀，沸水煮10分鐘，進行分離膠濃度為8%的蛋白質凝膠電泳，用考馬斯亮藍染染色；(4)掃描凝膠圖像，然后用Quantity one 4. 6. 2圖像軟件分析圖片，計算蛋白的
相對表達量。優選地，本發明所述的方法中，步驟(2)中的菌種固體培養基配方為胰蛋白胨10 克，酵母提取物5克，氯化鈉10克，葡萄糖10克，瓊脂粉5克，加水至1000毫升，高壓滅菌；優選地，本發明所述的方法中，步驟(2)中的菌種培養基配方為胰蛋白胨10克， 酵母提取物5克，氯化鈉10克，葡萄糖10克，加水至1000毫升，高壓滅菌；優選地，本發明所述的方法中，步驟(2)中的表達培養基配方為七水磷酸氫二鈉 12. 8克，磷酸氫鉀3克，氯化鈉0. 5克，氯化銨1克，葡萄糖0. 4克，1摩爾硫酸鎂2毫升，1摩爾氯化鈣0. 1毫升，胰蛋白胨5克，酵母提取物5克，葡萄糖10克，加水至1000毫升，高壓滅菌。“菌種固體培養基配方為胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化鈉10克，葡萄糖 5-10克，瓊脂粉5克，加水至1000毫升，高壓滅菌。菌種培養基配方為胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化鈉10克，葡萄糖5-10 克，加水至1000毫升，高壓滅菌。表達培養基配方為七水磷酸氫二鈉12. 8克，磷酸氫鉀3克，氯化鈉0. 5克，氯化 銨1克，1摩爾硫酸鎂2毫升，1摩爾氯化鈣0. 1毫升，胰蛋白胨2. 5-5克，酵母提取物2. 5-5 克，葡萄糖5-10克，加水至1000毫升。優選地，本發明所述的方法中，步驟(2)中37°C下培養菌體OD6tltl至1.0左右，力口 IPTG進行誘導。優選地，本發明所述的方法中，步驟(2)中IPTG的添加濃度維持在0. ImM左右。優選地，本發明所述的方法中，步驟(2)中加IPTG誘導后的培養溫度維持在37°C。優選地，本發明所述的方法中，步驟(2)中加IPTG誘導后的繼續培養5h。本發明還提供了一株高效表達HPV16 L2E7蛋白的工程菌大腸桿菌(表達質粒簡 圖，見附件1)。本發明提供了改良的培養基，該培養基能充分滿足工程菌在表達蛋白過程中的營 養要求，和傳統的表達培養基相比成本下降，并且有效的控制了培養誘導過程中的關鍵參 數。采用本發明所述的方法，不僅將表達質粒的保有率從40%-50%提高到95%以上，并且 使得HPV16 L2E7蛋白表達效率提高了 40%以上。


圖1.顯示了 16型人乳頭瘤病毒L2E7重組表達質粒的結構簡圖。圖2.顯示了 16型人乳頭瘤病毒L2E7基因聚合酶鏈式反應產物酶切結果。圖3.顯示了 16型人乳頭瘤病毒L2E7重組表達菌表達HPV16 L2E7重組蛋白的結^ ο圖4.顯示了 16型人乳頭瘤病毒L2E7重組表達菌表達HPV16L2E7重組蛋白的蛋 白免疫印跡鑒定結果。圖5.顯示了 16型人乳頭瘤病毒L2E7重組表達菌表達HPV16L2E7重組蛋白表達 量的分析結果。
具體實施例方式下列實施例說明但不限制本發明。實施例1 HPV16 L2E7重組表達質粒的構建(1)設計引物HPV16 L2-F :5，-GCTCTAGAAATAATTTGTTTAACTTTAAGAAGGAG這是運用PCR技術擴增HPV16 L2E7基因的正向引物。HPV16 E7-R :5’ -CGGGATCCTTACTATTATGGTTTCTGAGAACAG這是運用PCR技術擴增HPV16 L2E7基因的反向引物。
(2)以HPV16 L2-F和HPV16 E7-R為引物，進行PCR擴增，具體PCR條件為30個循 環的 980C IOs (變性)，55°C 15s (退火)，72°C IOOs (延伸)。 (3)用限制性內切酶XbaI和BamHI對PCR擴增產物進行酶切，通過瓊脂糖凝膠電 泳檢驗酶切產物，切下合適大小的條帶純化回收DNA (見圖2)。(4)回收產物連接至限制性內切酶XbaI和BamHI消化過得pET32a載體中。將所 得連接產物轉化至BL21 (DE3)大腸桿菌感受態細胞中，涂培養過夜，挑取單克隆菌落鑒定， 獲得正確的HPV16 L2E7重組表達菌。實施例2HPV16 L2E7重組表達菌表達HPV16 L2E7重組蛋白 (1)挑取HPV16 L2E7重組表達菌單克隆菌落，于菌種培養基中過夜培養，將活化種 子菌液按體積比5%的接種比例接種于5ml培養基中，37°C下培養菌體0D600至0. 8，然后 加IPTG濃度至ImM進行誘導，在28°C條件下繼續培養3小時。(2)取菌液1毫升，12000轉/分鐘離心1分鐘，用100微升凝膠上樣緩沖液重懸沉 淀，沸水煮10分鐘，進行分離膠濃度為8%的蛋白質凝膠電泳，用考馬斯亮藍染染色。(見 圖3)實施例3蛋白免疫印跡鑒定HPV16 L2E7重組表達菌表達HPV16 L2E7重組蛋白將實施例2步 驟(2)中的未經過考馬斯亮藍染色的凝膠中的蛋白通過電轉印系統轉至PVDF膜上(轉印 條件為200mA恒流條件下2小時)，用含有5%脫脂牛奶的磷酸鹽緩沖液室溫下封閉1小 時，以1 2000的比例加入一抗，4°C過夜培養，用含0. 02%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液洗滌 PVDF膜四遍，每次lOmin，，以1 2000的比例加入二抗，室溫培養1小時，用含0. 02 %吐 溫-20的磷酸鹽緩沖液洗滌PVDF膜四遍，每次lOmin，加入增敏二氨基聯苯胺顯色液顯色。 (見圖4)實施例4HPV16 L2E7重組表達菌表達HPV16 L2E7重組蛋白表達量的結果分析將實施例2步驟(2)中考馬斯亮藍染染色所得的SDS-PAGE凝膠通過凝膠成像儀 成像獲得表達信息，然后用Quantity one 4. 6. 2軟件對所的圖像信息進行分析，得到HPV16 L2E7蛋白的表達信息。(見圖5)實施例5 HPV16 L2E7在大腸桿菌中的優化表達(一)(1)將表達HPV16 L2E7蛋白的工程菌株大腸桿菌，在菌種固體培養基上劃線培養， 挑取單克隆菌落在3ml菌種培養基中活化培養過夜。(2)用于菌液培養的培養基以M9培養基為基礎，初始葡萄糖濃度1 %，初始胰蛋白 胨含量為0. 5%以及初始酵母提取物含量為0. 5%，將活化種子菌液按體積比5%的接種比 例接種于IOOml培養基中，37°C下培養菌體0D600至0. 8 (單位)，然后加IPTG濃度至ImM 進行誘導，在28°C條件下繼續培養3小時。(3)取菌液1毫升，12000轉/分鐘離心1分鐘，用100微升凝膠上樣緩沖液重懸 沉淀，沸水煮10分鐘，進行分離膠濃度為8%的蛋白質凝膠電泳，用考馬斯亮藍染染色。(4)掃描凝膠圖像，然后用Quantity one 4. 6. 2圖像軟件分析圖片，計算得到重 組蛋白的相對表達量為10. 21%。
實施例6HPV16 L2E7在大腸桿菌中的優化表達(二)(1)將表達HPV16 L2E7蛋白的工程菌株大腸桿菌，在菌種固體培養基上劃線培養，挑取單克隆菌落在3ml菌種培養基中活化培養過夜。(2)用于菌液培養的培養基以M9培養基為基礎，初始葡萄糖濃度1 %，初始胰蛋白 胨含量為0. 5%以及初始酵母提取物含量為0. 5%，將活化種子菌液按體積比5%的接種比 例接種于IOOml培養基中，37°C下培養菌體0D600至1.0，然后加IPTG濃度至ImM進行誘 導，在28°C條件下繼續培養3小時。(3)取菌液1毫升，12000轉/分鐘離心1分鐘，用100微升凝膠上樣緩沖液重懸 沉淀，沸水煮10分鐘，進行分離膠濃度為8%的蛋白質凝膠電泳，用考馬斯亮藍染染色。(4)掃描凝膠圖像，然后用Quantity one 4. 6. 2圖像軟件分析圖片，計算得到重 組蛋白的相對表達量為12. 73%。實施例7 HPV16 L2E7在大腸桿菌中的優化表達(三)(1)將表達HPV16 L2E7蛋白的工程菌株大腸桿菌，在菌種固體培養基上劃線培養， 挑取單克隆菌落在3ml菌種培養基中活化培養過夜。(2)用于菌液培養的培養基以M9培養基為基礎，初始葡萄糖濃度1 %，初始胰蛋白 胨含量為0. 5%以及初始酵母提取物含量為0. 5%，將活化種子菌液按體積比5%的接種比 例接種于IOOml培養基中，37°C下培養菌體0D600至1. 0，然后加IPTG濃度至0. ImM進行誘 導，在28°C條件下繼續培養3h。(3)取菌液1毫升，12000轉/分鐘離心1分鐘，用100微升凝膠上樣緩沖液重懸 沉淀，沸水煮10分鐘，進行分離膠濃度為8%的蛋白質凝膠電泳，用考馬斯亮藍染染色。(4)掃描凝膠圖像，然后用Quantity one 4. 6. 2圖像軟件分析圖片，計算得到重 組蛋白的相對表達量為12.91%。實施例8 HPV16 L2E7在大腸桿菌中的優化表達(四)(1)將表達HPV16 L2E7蛋白的工程菌株大腸桿菌，在菌種固體培養基上劃線培養， 挑取單克隆菌落在3ml菌種培養基中活化培養過夜。(2)用于菌液培養的培養基以M9培養基為基礎，初始葡萄糖濃度1 %，初始胰蛋白 胨含量為0. 5%以及初始酵母提取物含量為0. 5%，將活化種子菌液按體積比5%的接種比 例接種于IOOml培養基中，37°C下培養菌體0D600至1. 0，然后加IPTG濃度至0. ImM進行誘 導，在37°C條件下繼續培養3h。(3)取菌液1毫升，12000轉/分鐘離心1分鐘，用100微升凝膠上樣緩沖液重懸 沉淀，沸水煮10分鐘，進行分離膠濃度為8%的蛋白質凝膠電泳，用考馬斯亮藍染染色。(4)掃描凝膠圖像，然后用Quantity one 4. 6. 2圖像軟件分析圖片，計算得到重 組蛋白的相對表達量為13. 76%。實施例9 HPV16 L2E7在大腸桿菌中的表達優化(五)(1)將表達HPV16 L2E7蛋白的工程菌株大腸桿菌，在菌種固體培養基上劃線培養， 挑取單克隆菌落在3ml菌種培養基中活化培養過夜。(2)用于菌液培養的培養基以M9培養基為基礎，初始葡萄糖濃度1 %，初始胰蛋白 胨含量為0. 5%以及初始酵母提取物含量為0. 5%，將活化的種子菌液按體積比5%的接種 比例接種于IOOml培養基中，37°C下培養菌體0D600至1. 0，然后加IPTG濃度至0. ImM進行誘導，在37°C條件下繼續培養5h。
(3)取菌液1毫升，12000轉/分鐘離心1分鐘，用100微升凝膠上樣緩沖液重懸 沉淀，沸水煮10分鐘，進行分離膠濃度為8%的蛋白質凝膠電泳，用考馬斯亮藍染染色。(4)掃描凝膠圖像，然后用Quantity one 4. 6. 2圖像軟件分析圖片，計算得到重 組蛋白的相對表達量為14. 11%。實施例10培養基改變前后的效果比較將重組表達菌涂布于含有不含抗生素的固體培養基中，37度培養過夜，從中挑取 100個單克隆菌落，按矩陣接種于含有氨芐青霉素的固體培養基中，37度培養過夜。計算最 終生長的單克隆菌落數。
表達質粒保褲=(最終生長的單克隆菌落數/100)X100%
權利要求
一種16型人乳頭瘤病毒L2E7基因在大腸桿菌中的優化表達方法，其特征在于以16型人乳頭瘤病毒L2E7為目的基因，通過分子克隆技術構建得到16型人乳頭瘤病毒L2E7重組質粒，并在大腸桿菌中進行表達，從中篩選出具有高表達水平的重組菌株，最后從(1)培養基成分，(2)培養基pH條件，(3)誘導時機，(4)氨芐青霉素濃度，(5)接種量，(6)誘導劑，(7)誘導溫度七個方面對該重組工程菌的表達條件進行了比較；通過優化試驗，得出一系列優化表達條件(1)含有1％葡萄糖的表達培養基，(2)培養基初始pH值7.0，(3)誘導時機為菌液在600nm波長下的光密度≈1.1，(4)氨芐青霉素濃度為50克/升，(5)接種量為5％，(6)異丙基硫代半乳糖苷濃度為0.25毫摩爾，(7)誘導溫度37℃，最終重組蛋白相對表達量為15％左右，包涵體得率接近13％。
2.根據權利要求1所述的優化表達方法，其特征在于通過基因克隆技術把16型人乳頭 瘤病毒L2E7基因插入了表達載體，獲得了一株高表達16型人乳頭瘤病毒L2E7重組蛋白的表 達菌株。
3.根據權利要求1所述的優化表達方法，其特征在于所用到的表達培養基配方為七 水磷酸氫二鈉12. 8克，磷酸氫鉀3克，氯化鈉0. 5克，氯化銨1克，1摩爾硫酸鎂2毫升，1摩 爾氯化鈣0. 1毫升，胰蛋白胨2. 5-5克，酵母提取物2. 5-5克，葡萄糖5_10克，加水至1000毫升。
4.根據權利要求1所述的優化表達方法，其特征在于16型人乳頭瘤病毒L2E7重組蛋 白的高效表達方案步驟如下(1)將表達16型人乳頭瘤病毒L2E7重組基因的大腸桿菌菌株，在菌種固體培養基上劃 線培養，挑取單克隆菌落在3毫升菌種培養基中活化培養過夜；(2)用于大腸桿菌表達16型人乳頭瘤病毒L2E7重組蛋白的培養基以M9培養基為基礎， 選擇不同的初始葡萄糖濃度0. 4% _6%，初始胰蛋白胨含量0. 5% -1. 0%以及初始酵母提 取物含量0. 5% -1. 0%，將活化種子菌液按體積比5%的接種比例接種于100毫升培養基 中，37°C下培養菌體在600nm波長下的光密度至0. 2-2. 0，然后加異丙基硫代半乳糖苷濃度 至0. 1-2毫摩爾進行誘導，在28-37 °C條件下繼續培養3-6小時；(3)取菌液1毫升，12000轉/分鐘離心1分鐘，用100微升凝膠上樣緩沖液重懸沉淀， 沸水煮10分鐘，進行分離膠濃度為8%的蛋白質凝膠電泳，用考馬斯亮藍染染色；(4)掃描凝膠圖像，然后用Quantityone 4. 6. 2軟件分析圖片，計算蛋白的相對表達量。
5.根據權利要求4所述的優化表達方法，其特征在于所用到的菌種固體培養基配方 為胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化鈉10克，葡萄糖10克，瓊脂粉5克，加水至1000毫升，高壓滅菌。
6.根據權利要求4所述的優化表達方法，其特征在于所用到的菌種培養基配方為胰 蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化鈉10克，葡萄糖10克，加水至1000毫升，高壓滅菌。
全文摘要
本發明公開了一種16型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)L2E7基因在大腸桿菌原核表達菌株的構建及其表達條件的優化方法，以HPV16L2E7為目的基因，通過分子克隆技術構建得到HPV16L2E7重組表達質粒，并在大腸桿菌中進行表達，從中篩選出具有高表達水平的重組菌株，最后從(1)培養基成分，(2)培養基pH條件，(3)誘導時機，(4)氨芐青霉素濃度，(5)接種量，(6)誘導劑，(7)誘導溫度七個方面對該重組工程菌的表達條件進行了比較。該培養基能充分滿足工程菌在表達蛋白過程中的營養要求，和傳統的表達培養基相比成本下降，并且有效的控制了培養誘導過程中的關鍵參數。
文檔編號C12N1/21GK101845453SQ201010169578
公開日2010年9月29日 申請日期2010年5月11日 優先權日2010年5月11日
發明者任皎, 姜云水, 莊昉成, 李劍波, 毛子安, 田厚文, 趙莉, 高孟 申請人:浙江普康生物技術股份有限公司