專利名稱：：牦牛銅鋅超氧化物歧化酶重組表達蛋白質的制作方法
技術領域：
：本發明涉及基因工程
技術領域：
，具體地說，涉及一種構建牦牛Cu，Zn-SOD-m22b(+)~E.co7iBL21(DE3)基因工程菌及IPTG誘導表達與重組蛋白質純化的技術。
背景技術：
：超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)是一類含有不同金屬離子的氧化還原酶，廣泛存在于自然界各種生物體內，按所含金屬輔因子的不同，可將SOD分為3大類型銅鋅超氧化物歧化酶(Cu，Ζη-SOD)、錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)0Cu,Zn-SOD主要存在于真核生物胞漿中，另外在細胞核、溶酶體、過氧化物酶體中也有存在；Mn-SOD在真核生物的線粒體及原核生物的胞漿中皆存在；Fe-SOD主要存在于葉綠體和原核生物中。Mn-SOD和Fe-SOD出現在生命進化的早期，而Cu，Zn-SOD是在以后的發展中單獨進化而成的。Cu,Zn-SOD在脊椎動物中約占總SOD活性的80%以上，在人體內Cu，Zn-SOD含量最高。1938年，Marm和Keilin首次從牛紅細胞中分離出一種藍色的含銅蛋白質(Hemocuprein)。1968年，McCord和Fridovich等對Hemocuprein的功能進行研究，因其能催化超氧陰離子(V的歧化反應而將其命名為超氧化物歧化酶(S0D)，其作用主要是專一地清除生物氧化中產生的超氧陰離子自由基(superOXideradical，02_)等中間物的毒性，能有效地防御活性氧對生物體的毒害作用。Mn-SOD主要存在于原核細胞和真核細胞的線粒體基質中，呈紫紅色。某些真核生物的葉綠體中也含有一定量的Mn-SOD。真核生物中主要分布于細胞的線粒體內，其基因為單拷貝基因，在人體內位于第6號染色體上，其分子量為80，000道爾頓(SOkDa)，該酶與Cu,Zn-SOD無同源性。MnSOD具有抵抗氧化自由基，延緩衰老和抗腫瘤的作用，并與許多氧化損傷引起的疾病有關。Fe-SOD首次于大腸桿菌中分離得到，Fe-SOD呈黃褐色，主要存在于五coli和Methanobacteriumbryantil等原核生物及少數高等植物(如油菜、檸檬、銀杏、番茄、水百合等)細胞的葉綠體基質中。Fe-SOD其活性中心的金屬離子與3個His、一個Asp和一個H2O配位，它的分子結構為二聚體或三聚體，其分子構象主要為α螺旋，與Mn-SOD為同一進化起源。超氧化物歧化酶是一種用途極廣的藥用酶，在預防和治療氧自由基危害、損傷和抗衰老、抗炎癥、抑制腫瘤和癌癥、治療肌肉萎縮及在免疫系統中治療無菌性炎癥有重要的功能。1992年吳瑞芳介紹了德國格蘭泰有限公司(GrunenthalGmbH)從動物血液中提取的商品名為潘樂新針(Peroxinorm)的注射用SOD制劑，主要用于治療放射性膀胱炎、類風濕性關節炎。我國自上世紀八十年代以來，對超氧化物歧化酶的應用研究主要側重于動植物SOD的提取和純化，目前市場上的SOD產品大部分是從動物血液中提取的，以豬血為原料提取SOD制劑為多。中國專利CN00113802.2公開了一種牦牛血超氧化物歧化酶及其提取純化工藝和應用。但大多數從動物血液中直接提取的SOD制劑可能對人體有排異性，存在免疫源性的問題。為解決天然SOD免疫源性的問題，美、日、英、德等國相繼開發了人源SOD基因工程產品，已進入到II期、III期臨床研究。國內周潮等也對人紅細胞SOD凍干制劑進行了研究。但用人紅細胞生產注射用SOD制劑其原料來源受到極大的限制，并且其療效不一，Jadot等人提出同源SOD不被細胞膜受體辨認而無活性的觀點，所以應對重組人源SOD的研究開發持謹慎態度，注意其應用領域。鑒于直接從動物血中提取的天然SOD存在工藝復雜、提取率低并存在免疫源的問題，人源SOD存在來源受限及同源SOD可能不被細胞膜受體辨認而無活性的問題，尋找廉價、高效的外源基因表達系統是突破傳統制備方法的有效途徑之一。目前有許多外源SOD基因表達系統的報道，但未見有成功表達有生物活性的重組蛋白的報道。很多外源SOD基因表達系統都采取了胞內表達的策略，在五coli胞內表達雖然具有產量高、操作簡便的優點，但由于胞內缺少真核生物中翻譯后修飾所需的酶類，或缺乏蛋白折疊過程中需要的某些酶和輔助因子，致使中間體大量積聚，容易形成包涵體沉淀。不可溶、無生物活性的包涵體必須經過變性、復性等繁瑣過程才能獲得天然結構和生物活性，增加了工作難度和生產成本。為了克服這一缺點，本發明選擇了帶有評仿信號序列的載體，評仿信號肽可以使目的蛋白被導入周質空間。五coli的胞周質中含有一系列的酶，并提供了一個氧化的環境，這些都有利于二硫鍵的正確形成，并增強硫基蛋白的正確折疊使活性蛋白質的產量得到提高，增強基因產物的可溶性，同時，周質空間和胞外培養基中的蛋白酶活性要比胞質中低，使所表達的蛋白能避免胞內降解從而穩定地存在于胞周質中。
發明內容本發明的第一個目的是提供一種構建含有牦牛Cu，Zn-SODcMk的表達載體的方法及構建的重組載體以及利用該載體轉化的重組基因工程菌。本發明的第二個目的是提供從所述的基因工程菌重組牦牛Cu，Zn-SOD蛋白質及純化該重組蛋白質的方法。本發明實現上述發明目的采用的技術方案如下一種構建含有牦牛Cu，Zn-SODdMk的表達載體的方法，包括以下步驟(1)根據奶牛Cu，Zn-SODcDNA序列(匪174615)用DNAsisforWindowsVer2.5設計一對PCR引物，引物序列如下上游引物P15‘-CATGCCATGGCGACGAAGGCCGTCTGCGTGC-3‘下游引物P25‘-CCCAAGCTTGAATGTTTACTTGGCAATTC-3‘(2)提取牦牛肝臟RNA，以提取的牦牛肝臟RNA為模板，在引物Pl和P2的引導下進行逆轉錄PCR(RT-PCR)擴增；(3)將RT-PCR產物連接到pGM-T載體，轉化到E.colHQV10宿主菌進行克隆，用菌液PCR、質粒雙酶切方法篩選陽性重組質粒，用雙脫氧鏈終止法對陽性重組質粒中的Cu,Zn-SODcMk測序，將測序結果正確的陽性重組質粒命名為Cu，Zn-SOD-pGW-質粒；(4)用限制性內切酶AfcoI和HindIII對Cu，Zn-SOD-^Qk-質粒和pET22b⑴質粒分別進行雙酶切，分別回收得到Cu，Zn-SODcMk片段和pET22b(+)開環線狀載體；(5)將Cu，Zn-SODcMk片段連接到pET22b(+)開環線狀載體，轉化到E.co7iT0P10宿主菌，用菌液PCR、質粒雙酶切及DNA測序法篩選陽性重組質粒，得到重組載體Cu,Zn-S0D-pET22b(+)。上述構建含有牦牛O/,Zn-SODcmk表達載體方法的步驟(2)中所述逆轉錄PCR擴增包括逆轉錄和PCR反應，其中所述逆轉錄的10μL體系為MgCl22.0μL，lOXRTBufferl.OμL，RNaseFreedH203.75μL,dNTPMixturel.OyL,AMVReverseTranscriptaseO.5μL,RNaseInhibitorO.25μL,Oligo-TO.5μL,耗牛月干臟RNA1.0μL，逆轉錄擴增反應條件為:42°C，45min；99°C，5min；5°C，5min。所述PCR反應的50μL體系為牦牛cDNA模板1.25ng，10XPCR緩沖液5.00μL，25mmol/L的MgCl22.00μL,2.5mmol/L的dNTPs2.00μL,5U/μL的位TaqDNA聚合酶0.50μL，20pmol/yL的上游引物Ρ10.50μL，20pmol/μL的下游引物P20.50μL，余量為無菌蒸餾水，PCR擴增反應條件為94°C預變性5min；94°C變性35s，50.50°C退火35s，72°C延伸90s，共32個循環；72°C延伸IOmin0上述構建含有牦牛級Zn-SODcmk表達載體方法的步驟(3)中所述將RT-PCR產物連接到pGM-T載體進行克隆的5μL連接體系為Zn~SODcmk2.OOyL,載體pGM-TO.5μL，LigationMix2.5μL，步驟(5)中所述將Ω/，ZnSODcmk片段連接到pET22b⑴開環線狀載體后轉化到E.CO7iT0P10宿主菌的5yL連接體系為Cu,Zn-SODomkl.00μL,pET22b(+)開環線狀載體0.5μL，LigationMix2.5μL,連接條件為16°C連接過夜。上述構建含有牦牛Cu，Zn-SODcDNA表達載體方法的步驟(3)、步驟(5)中所述轉化按以下步驟進行(1)將5.0μL連接體系加入50μL冰上預冷的Ε.coliTOVlQ感受態細胞，冰浴30min；(2)42°C水浴熱激90s，放入冰浴IOmin；(3)加入SOC培養基800.0μL，混勻，37°C、120r/min振蕩培養60min；(4)5000r/min離心30s，吸去大部分上清液，留下200.0μL上清液，重懸沉淀；(5)將細菌懸濁液均勻涂布在LB平板培養皿上，在37°C培養1220h，所述LB平板培養皿含有10mmol/LIPTG、40.0μL2%X-gal、100.0μg/mLAmp；(6)用封口膠封住LB平板培養皿，放入4°C冰箱顯色30min；(7)挑取單個白色菌落接種于2mLLB液體培養基，37°C、120r/min培養12h后進行菌液PCR鑒定，所述LB液體培養基含100.0μg/mLAmp。上述構建含有牦牛Cu，Zn-SODcMk表達載體方法的步驟(3)、步驟(5)中所述重組質粒鑒定方法的菌液PCR反應體系及反應條件與上述RT-PCR中50μLPCR反應體系及擴增條件相同。上述構建含有牦牛Cu，Zn-SODcmk的表達載體方法的步驟(4)所述雙酶切的20μL體系為質粒DNA10.00μL,10XKBuffer2.00μL,BSA3.00μL,HindIII1.00μL,AfcoII.00μL，余量為無菌蒸餾水，雙酶切的反應條件為，37°C消化3h。按照上述構建方法得到的重組載體Cu，Zn-SOD-m22h⑴包含由序列表中序列3的核苷酸序列組成的牦牛Cu,Zn-SODcmk基因、/^仿信號序列、pET22b(+)載體元件，并且所述牦牛銅鋅超氧化物歧化酶cDNA基因位于pET22b(+)載體的NcoI和Viz7i////限制性內切酶酶切位點之間。將重組載體Cu，Zn-SOD-m22b(+)轉化到E.co7iBL21(DE3)宿主菌中得到牦牛Cu，Zn-SOD~m22b(+)-Ε.co7iBL21(DE3)工程菌。轉化方法同構建含有牦牛Cu,Zn-SODcDNA表達載體方法的步驟(3)、步驟(5)中所述轉化方法相同，所用宿主菌為E.co7iBL21(DE3)感受態細胞。轉化得到牦牛Cu，Zn-SOD-^\22b(+)~B.co7iBL21(DE3)工程菌后經菌液PCR、質粒雙酶切及DNA測序法篩選陽性重組質粒，得到鑒定正確的Cu，Zn-SOD~m22b(+)-Ε.co7iBL21(DE3)基因工程菌。一種牦牛Cu，Zn-SOD~m22h(+)_Ε·co7iBL21(DE3)基因工程菌高效表達方法及重組蛋白質純化方法，包括對鑒定正確的重組基因工程菌進行IPTG誘導表達、用負染色法對表達產物進行鑒定、對重組蛋白進行純化及復性，其中所述重組基因工程菌IPTG誘導表達方法包括以下步驟(1)經鑒定正確的Cu，Zn-SOD-m22b(+)_Ε·co7iBL21(DE3)基因工程菌接種于含氨芐青霉素的LB培養基中，37°C120rpm震蕩培養過夜，基因工程菌菌液與LB培養基的體積比為1:100；(2)次日，將過夜培養后的基因工程菌以1:40的體積比例接種到含氨芐青霉素的LB培養基中，于37°C震蕩培養；(3)細菌OD6qq=O.51時，加入lmMIPTG，30°C，誘導表達9小時；(4)4000r/min離心5min，收集菌體，進行SDS-PAGE電泳，所述SDS-PAGE電泳的分離膠濃度為15%，積聚膠濃度為5%；所述負染色法鑒定表達產物包括以下步驟(1)將溶于PBS緩沖液的總蛋白上清液進行10%PAGE電泳，分別用提純的牦牛血液Cu,Zn-SOD和含空載體的細菌細胞上清液作為陽性對照和陰性對照；(2)電泳結束后取出凝膠條，浸入NBT-TEMED-核黃素體系溶液中避光染色30min，倒出染色液，所述NBT-TEMED-核黃素體系溶液中含有1.5mmol/LNBT、0.lmmol/LTEMED、0.12mmol/L核黃素、67mmol/L磷酸鹽緩沖液pH7.5；(3)用pH7.5的PBS沖洗膠片兩次，膠片置于20W日光燈下照射45min，凝膠條無SOD活性部分全部為紫藍色，有SOD活性的部分顯現出無色透明的酶帶，記錄結果數據；所述重組Cu，Zn-SOD蛋白質純化方法，包括以下步驟(1)經IPTG誘導的表達菌，4°C12000r/min離心15min，收集菌體；(2)按Ig菌體濕重加入10mLpH7.4的細胞裂解液重懸菌體，洗滌2次，所述細胞裂解液包括20mMNa3P04、500mMNaCl；(3)菌體懸濁液置于冰上超聲破碎20min，破碎5s、間斷9s，4°C12000r/min離心15min，收集沉淀；(4)按Ig菌體濕重加入20mLpH7.4的包涵體洗滌液I重懸沉淀，4°C靜置20min，反復洗滌5次，所述包涵體洗滌液I包括20mMNa3P04、500mMNaCl、0.l%TritonX-100；(5)以同樣的方法用pH7.4的包涵體洗滌液II洗滌包涵體5次，4°C12000r/min離心15min，收集沉淀，所述包涵體洗滌液II包括20mMNa3P04、500mMNaCl、2MUrea；(6)按Ig菌體濕重加入IOmL包涵體變性液向洗滌后的沉淀中加入pH7.4的包涵體變性液，4°C溶解過夜，40C12000r/min離心30min，收集上清液，經0.45μm濾膜過濾備用，所述包涵體變性液包括20mMNa3P04，500mMNaCl，8MUrea；所述重組蛋白質復性包括以下步驟將上述重組Cu，Zn-SOD蛋白質純化方法步驟(6)純化得到的包涵體蛋白用尿素濃度梯度法4°C透析復性，透析緩沖液依次以含6M、5M、4M、3M、2M、1M、OM尿素的PBS緩沖液，最后以無尿素的PBS緩沖液4°C透析過夜。用鄰苯三酚自氧化法對表達產物SOD及復性蛋白質進行酶活性測定，包括以下步驟(1)鄰苯三酚自氧化速率的測定取pH8.2的Tris-HCl-EDTA緩沖液4.5mL加入IOmL比色管中，于25°C進行恒溫孵育，再加入經過25°C恒溫孵育的45mmol/L的鄰苯三酚溶液10.0μL，混勻后置于Icm石英比色杯中于325nm波長測光密度，每隔30s測一次光密度值，共測4min，求出鄰苯三酚自氧速率0Da/min，同時用lOmmol/L鹽酸做空白試驗；(2)S0D活性測定取pH8.2的Tris-HCl-EDTA緩沖液4.5mL于IOmL比色管中，25°C恒溫lOmin，加入已恒溫至25°C的樣品緩沖液10mL，混勻，用325nm波長測定密度值，每30s測一次，測4min，求出光密度值變化速率ODbAiin；(3)按下述公式計算酶活力酶活力(U/mL)=(ODa-ODb)/ODaX100%+S(Fc)XnXV1ZV2式中V1—反應體系；V2—測定樣品體積；N—樣品稀釋液倍數；ODa—鄰苯三酚的自氧化速率；ODb—樣品光密度值變化速率。經測定，表達產物中SOD的酶活力為35U/mg，純化后的牦牛重組Cu，Zn-SOD酶活力為3612U/mg。超氧化物歧化酶(SOD)是機體內唯一可清除超氧陰離子自由基((V)的天然清除齊U。在抗衰老、抗氧化應激、抗炎、和治療自身免疫疾病等方面SOD有很重要的作用。目前，我國SOD的開發及應用取得了很大的進展，作為藥用酶，由于天然SOD存在來源有限、異體蛋白免疫原性、進入細胞能力弱、在血中半衰期短、不能口服、價格昂貴等缺點，從而限制了SOD在相關領域的應用；人源SOD制劑其原料來源受到極大的限制，并且根據Jadot等人提出同源SOD不被細胞膜受體辨認而無活性的觀點，應對重組人源SOD的研究開發持謹慎態度。本發明選用的牦牛是生存在喜馬拉雅山脈和青藏高原海拔3000米左右的高原動物，高寒缺氧、高強度紫外輻射等惡劣環境使其在進化過程中體內保護酶(CAT、SOD、P0D)活性的升高，SOD活性也隨氧含量的降低而升高從而提高了機體對缺氧條件下的適應性。另外，本發明的前期研究發現，牦牛SOD氨基酸與人和豬SOD比較，牦牛SOD氨基酸序列與人的SOD氨基酸序列同源性最高，牦牛SOD蛋白質比豬更接近于人。因而，牦牛可以作為比豬更合適的SOD供體。本發明提供了一種重組牦牛Cu，Zn-SOD蛋白質及構建牦牛Cu，Zn-SOD高效表達系統、重組蛋白質純化的方法，選用大腸桿菌作為宿主，其遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達量高、易于操作，大腸桿菌為宿主的體系是表達外源蛋白的首選體系。本發明選用的PET22M+)載體具有很強的T7啟動子并帶有/70仿信號肽，同時，本發明設計的Cu,Zn-SODzmk^端酶切位點AfcoI緊接著/70仿信號肽序列，3'端歷III酶切位點緊接著終止密碼子，這有利于表達的產物分泌到細胞周質空間組裝成高級結構。本發明利用基因工程技術構建了牦牛Cu，Zn-SOD重組原核表達系統Cu,Zn-SOD-m22b(+)~E.co7iBL21(DE3)，并建立了重組表達后牦牛Cu，Zn-SOD蛋白質純化方法，活性染色與活性測定后得出該基因工程菌表達的牦牛Cu，Zn-SOD蛋白活性高，且高效穩定表達。與SOD傳統的血液來源相比，本發明提供的表達系統及純化方法高效穩定，成本低，效果好，適用于大規模生產，極大地降低了生產成本，為SOD在臨床治療、制藥、保健品、食品等領域的應用與開發提供了豐富的SOD資源。圖1為牦牛肝臟總RNA電泳結果。圖2為牦牛Cu,Zn-SOD的RT-PCR擴增結果。圖3為重組克隆載體的PCR鑒定結果。圖4為重組子的酶切鑒定結果。圖5為人Cu，Zn-SOD與牦牛、豬和普通牛的核苷酸序列同源性比較結果。圖6為人Cu，Zn-SOD與牦牛、豬和普通牛的氨基酸序列同源性比較結果。圖7為重組表達載體的PCR鑒定結果。圖8為重組表達載體的酶切鑒定結果。圖9為牦牛Cu，Zn-SOD表達產物SDS-PAGE電泳結果。圖10為Cu，Zn-SOD表達產物活性染色結果。圖11為牦牛Cu，Zn-SOD蛋白質純化結果。圖中標記圖1中，1、2表示牦牛1肝臟總RNA，3、4表示牦牛2肝臟總RNA。圖2中，M表示DNAmarkerDL2000分子量標記，1表示牦牛ICu,Zn-SODRT-PCR產物，2表示牦牛2Cu,Zn-SODRT-PCR產物。圖3中，M表示DNAmarkerDL2000分子量標記，1、2表示隨機挑取的重組菌進行PCR反應的產物。圖4中，M表示DNAmarkerDL2000分子量標記，1、2、3、4表示重組質粒的酶切結果。圖7中，M表示DNAmarkerDL2000分子量標記，1、2、3、4表示重組載體PCR反應的產物。圖8中，M表示DNAmarkerDL2000分子量標記，1、2、3、4表示重組載體經AfcoI和Λ/7/ΙΙΙ酶切后的產物，5表示牦牛Cu，Zn-SOD基因。圖9中，M表示蛋白質分子量標準，1表示大腸桿菌BL21(DE3)的表達產物，2未經IPTG誘導的pET22b(+)-BL21(DE3)表達產物，3表示經IPTG誘導的pET22b(+)-BL21(DE3)表達產物，4表示IPTG誘導后的牦牛Cu，Zn-SOD-m22b(+)-Ε.co7iBL21(DE3)表達產物。圖10中，0表示牦牛血液Cu,Zn-SOD,1表示誘導的pET22b(+)-BL21(DE3)，2表示未經IPTG誘導的Cu，Zn-SOD-^\22b(+)-E.co7iBL21(DE3)，3表示IPTG誘導的Cu,Z/-S0D-pET22b(+)-B.co7iBL21(DE3)，4，5表示經IPTG誘導并加入Cu2+和Zn2+的Cu,Zn-SOD-^\22b(+)-E.co7iBL21(DE3)。圖11中，M表示蛋白質分子量標準，1、2、3、4表示純化后的牦牛Cu，Zn-SOD蛋白質，5、6表示牦牛Cu，Zn-SOD~m22h(+)-Ε.coliBL21(DE3)表達的總蛋白。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明，實施例中所用方法如無特別說明，均為常規方法。所用引物合成由TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司完成。實施例1、牦牛Cu,Z/7-^cDNA-pET22b(+)重組載體構建一、引物設計根據奶牛Cu，Zn-SODcmk序列(NMl74615)，用DNAsisforWindowsVer2.5設計一對PCR引物，即上游引物Pl和下游引物P2上游引物Pl:5''-|CATCt|CCATGGCGACGAAGGCCCtTCTGCGTGC-3fr*t薛弓1P2ο~CCCAAGC"TTGAATGTTXACTTGCJCAATT"0~3“上述上游引物Pl序列中劃線部分為限制性內切酶AfcoI酶切位點；下游引物P2序列中劃線部分為限制性內切酶ZZiz7i/III酶切位點；引物序列中方框部分為酶切位點保護堿基；二、RT-PCR擴增牦牛Cu，Zn-SODcmk片段(1)牦牛肝臟RNA提取根據SIGMA公司提供的總RNA提取方法，按以下步驟提取牦牛肝臟總RNA。φ取-70V保存的牦牛肝臟組織50lOOmg，剪碎后移入20mL預先加入ImLTRIREAGENT的勻漿器中進行勻漿，至細胞完全裂解；(g將勻漿所得液體移入2mLEppendorf管，于室溫靜置IOmin左右，4°C10000r/min離心15min；:1取上層液體移入另一Eppendorf管，加入0.5mL氯仿，振蕩搖勻，室溫靜置IOmin；；!)將Eppendorf管置于高速臺式冷凍離心機，在4°C10000r/min離心15min；S吸取上層水相置于另一新的無菌Eppendorf管中，重新加入0.5mL氯仿，振蕩搖勻，室溫靜置5min后于4°C，10000r/min離心15min；:f吸取上層水相置于另一新的無菌Eppendorf管中，加入0.5mL異丙醇，振蕩搖勻后于室溫靜置1520min(或于4°C靜置Ih左右)；4"C10000r/min離心lOmin，棄上清，加0.5lmL75%乙醇洗滌兩次；取40.OμL無RNAase的水重懸干燥后的RNA，置_70°C保存。上述提取的牦牛肝臟總RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳后，可見28S核糖體RNA，18S和5S核糖體RNA三條帶，無拖尾(見圖1)，經紫外分光光度計檢測，0D260nm/280nm值在1.852.05之間，說明RNA完整性好，且其純度高，可用作RT-PCR試驗。(2)cDNA第一條鏈的合成以牦牛肝臟RNA為模板，Oligo-dT為引物，按照表1所示配制逆轉錄反應液，用AMV反轉錄酶合成cDNA第一條鏈。反應體系如下表1反轉錄反應體系<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>逆轉錄反應條件為:42°C,45min;99°C,5min;5°C，5min。(3)PCR擴增按照表2所示配置PCR反應體系，PCR擴增反應條件為95.0°C預變性IOmin；94.0°C變性35s，50.5°C退火35s，72.0°C延伸90s，共32個循環；72.0°C再延伸IOmin,擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。表2PCR反應體系<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由圖2可知，RT-PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳在約480bp處可見一特異性條帶，與預期目標片段大小一致。三、牦牛Cu，Zn-SODcmk克隆將RT-PCR產物連接到pGM-T載體并轉化到大腸桿菌T0P10感受態細胞進行克隆，用菌液PCR、質粒雙酶切方法篩選陽性重組質粒，用雙脫氧鏈終止法對陽性重組質粒中的Cu,Zn-SODcMk測序，將測序結果正確的陽性重組質粒命名為Cu，Zn-SOD-^QA-質粒，具體按如下操作步驟進行(1)連接反應將RT-PCR產物連接到pGM-T載體進行克隆，連接反應體系如表3所示。按照表3所示，配制連接5.0μL反應體系，將連接反應體系放入置于16°C的低溫水浴連接過夜。！_表3.連接反g體系_樣品_實驗組_陰性對照_陽性對照_ICujZn-SODcDMA2.OAL0Μ·O^L|tlfrpGI-T0.5μL0.5μ0.5M-L1LigationMix2.5μL2.2.5μLSBΗ;00M"L2.OAL0.5μL|controlinsertDHAΟμ_OM-L_0._I(2)轉化①取一管大腸桿菌T0P10感受態細胞，置于冰浴中，待融化后用預冷的槍頭吸取3050.0μL到一個新的預冷的無菌離心管中，加入連接產物5.0μL，輕輕旋轉以混合內容物，在冰中放置2030min；②42°C水浴熱激90s，不要搖動管子，然后迅速放入冰浴IOmin；③加入SOC培養基800.0μL，輕輕混勻，37°C、160r/min振蕩培養45min90min；④8000r/min離心30s，輕輕吸去上清液，留下約200.0μL上清液，重懸沉淀將菌混勻，分兩次涂板；⑤涂布預先已準備好含有100.0μL100mmol/LIPTG、40.0μL2%X-gal、100.0μg/mLAmp的LB平板，在室溫吸收后，然后倒置培養皿37°C培養1220h；⑥然后用封口膠封住，放入4°C冰箱顯色30min。(3)用菌液PCR、質粒雙酶切方法篩選陽性重組質粒，用雙脫氧鏈終止法對陽性重組質粒中的Cu，Zn-SODcDNA測序，將測序結果正確的陽性重組質粒命名為Cu，Zn-S0D-pGM-T質粒。具體如下菌液PCR鑒定重組子用滅菌牙簽挑取單個白色菌落，接種于含有氨芐青霉素的2mLLB液體培養基中，37°C振蕩過夜培養。取2.0μL菌液作模板，按表2配制PCR反應液，反應條件與RT-PCR中的PCR反應條件相同。用未經轉化的Τ0Ρ10作為陰性對照。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。雙酶切鑒定重組子①質粒DNA的提取a.挑取一些獨立的轉化菌落進行小規模培養，用無菌牙簽或接種環挑取單菌落于20mL含有適量氨芐青霉素的LB培養基中，37°C劇烈震搖培養過夜；b.將1.2mL培養物倒入微量離心管中，于5000r/min離心Imin(兩次)。將剩余的培養物存于4°C冰箱；c.吸取并棄去培養液，使細菌沉淀盡可能干燥；d.將細菌沉淀重懸于100.0μL溶液I中，劇烈振蕩；e.加200.0μL溶液II，蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混合內容物，確保離心管的整個表面均與溶液II接觸，不要振蕩，將離心管放置冰上5min；f.加150.OyL溶液III，蓋緊管口，將管倒置，溫和振蕩20s，使溶液III在黏稠的細菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上5min；g.12000r/min離心5min，將上清液轉移到另一離心管中；h.加等體積酚一氯仿一異戊醇(25:24:1)，振蕩混勻；i.12000r/min離心5min，將上清液轉移至另一管離心管中；j.加入2倍體積的無水乙醇并置于冰中30min，使DNA沉淀；k.12000r/min離心5min，小心吸去上清液，將離心管倒置于一張濾紙上，以使有液體流出，再將附于管壁的液滴除盡；1.用lmL70%乙醇溶液洗滌沉淀，12000r/min離心5min，棄去上清液，在空氣使核酸沉淀干燥；m.用50.0μL含無DNA酶的胰RNA酶20μg/mL的TE重新溶解核酸，振蕩貯于_20°C。②Cu，Zn-SOB-pGM-T質粒雙酶切鑒定上述提取的質粒、限制性內切酶Λ/^ΙΠ、Λ^οΙ及各種緩沖液按照表4所示配置雙酶切體系，置于37°C消化3h左右，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>由圖3可知，菌液PCR擴增產物約480bp，與預期片段大小相符，由圖4可知，篩選的Cu，Zn-SOD-^Qk-重組質粒被AfcoI和歷III酶切為3001bp和467bp兩個片段，與預期片段大小相符，表明篩選的重組質粒為陽性β/,辦-5’fl9_pGM-T重組質粒。質粒測序經菌液PCR、雙酶切鑒定篩選的Cu,Zn-SOD-pGM-T陽性重組質粒用雙脫氧鏈終止法進行測序。將鑒定正確的陽性重組質粒分別送至TaKaRa公司和成都金杰生物技術有限公司測序。經DNAMAN、DNAsis軟件分析，TaKaRa公司和成都金杰生物技術有限公司測序結果完全一致。將序列提交到NCBI數據庫進行BlAST比對分析，結果表明，上述克隆的牦牛Cu,Zn-SODcWA序列正確。由圖5、圖6可知，經測序所得的牦牛Cu，Zn-SODcMk及氨基酸序列與NCBI中人、豬、普通牛3個物種的cDNA及氨基酸序列在DNAMAN中進行序列比對，牦牛Cu，ZnSOD與人共有61個堿基和26個氨基酸殘基存在差異，牦牛及普通牛Cu,Zn-SODcmk較人少6個堿基，該連續6個堿基分別編碼天冬酰胺(N)和甘氨酸(G)。在比較的四個物種氨基酸序列中，從129到151位氨基酸殘基完全相同，該部分肽段參與第8個β-折疊的形成，是C端重要的功能性區域。研究表明，這一區段(環VII)的Glul30、Glul31和Lysl34位于靜電環表面，是活性通道的組成部分，通過形成正電場起作用，雖然與酶活性無關，但與底物識別有關，在底物進入活性中心的過程中有導向作用。Argl41在酶催化過程中是唯一具有靜電學和酶促動力學雙重作用的氨基酸，在酶與底物的結合及催化反應中都具有作用。由表5可知，人與豬的核苷酸序列同源性最高為88.3%，其次為牦牛86.7%，最低為普通牛86.3%。但氨基酸序列比較顯示，人與牦牛的氨基酸序列同源性最高82.9%，其次為普通牛82.2%，最低為豬81.1%。由此可見，采用重組牦牛Cu，Zn-SOD蛋白作為注射用蛋白其免疫反應可能較豬源Cu，Zn-SOD的小，這一結論與國外為什么均采用牛血提取的SOD作為注射用藥一致。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>四、牦牛Cu，Zn-SOD~m22b(+)重組載體構建用限制性內切酶AfcoIMHindIIIMCu,Zn-SOD-^-I質粒和pET22b⑴質粒分別進行雙酶切，分別回收得到Cu，Zn-SODcmk片段和pET22b(+)開環線狀載體；將Cu，Zn-SODcMk片段連接到pET22b(+)開環線狀載體，轉化到五C^iTOPlO宿主菌，用菌液PCR、質粒雙酶切及DNA測序法篩選陽性重組質粒，得到重組載體Cu，Zn-SOD~m22b(+)，具體按如下操作步驟進行U)Cu,Zn-SOB-pGM-T質粒及pET22b(+)載體雙酶切上述提取的質粒、限制性內切酶Λ/^ΙΠ、Λ^οΙ及各種緩沖液按照表4所示配置雙酶切體系，置于37°C消化3h左右，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。(2)目的片段的回收純化采用上海生物工程有限公司凝膠回收試劑盒純化PCR擴增產物，方法如下①將100μLRT-PCR產物于1%的瓊脂糖凝膠中電泳；②用干凈的手術刀切下含有目的基因片段的瓊脂糖凝膠塊，放入1.5mLEppendorf管中，稱其重量；③按每IOOmg瓊脂糖凝膠加入400.0μLBindingBufffer,混勻后置5060°C、水浴鍋內水浴lOmin，使膠徹底融化，加熱融膠時每2min混勻一次；④將spinColumn柱放入2mL收集管中，將融化的膠溶液轉移到spinColum柱中，12000r/min室溫離心Imin；⑤取下spinColumn柱，倒掉收集管中的廢液，將spinColumn柱放入原收集管中，加入300.0μLBindingBuffer,12000r/min室溫離心Imin；⑥取下spinColumn柱，倒掉收集管中的廢液，將spinColumn柱放入原收集管中，加入700.0μLDNAffashBuffer,室溫放置23min，12000r/min室溫離心Imin；⑦重復步驟6；⑧倒掉收集管中的廢液，將spinColumn柱放入原收集管中，空轉，12000r/min,室溫離心Imin；⑨將spinColumn柱放入一只新的1.5mLEppendorf管，在柱膜中央加30.0μLElutionBuffer室溫或37°C放置2min；⑩12000r/min高速離心lmin，離心管中的液體即含有回收的DNA片段，可立即使用或-20°C保存備用；(3)連接反應將RT-PCR產物連接到pET22b(+)載體，連接反應體系如表6所示。按照表6所示，配制連接5.0μL反應體系，將連接反應體系放入置于16°C的低溫水浴連接過夜。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(4)轉化將連接體系轉化到大腸桿菌T0P10感受態細胞，具體操作與上述步驟三牦牛Cu，Zn-SODcmk克隆中的轉化操作相同。(5)重組質粒鑒定用菌液PCR、質粒雙酶切方法篩選陽性重組質粒并用DNA測序方法重組質粒進行鑒定，測序正確的重組質粒即為Cu，Zn-SOD~m22b(+)重組載體，命名為Cu，ZnSOD~m22b(+)。具體操作與上述步驟三牦牛Cu，Zn-SODcMk克隆中的菌液PCR、質粒雙酶切鑒定操作相同。由圖5可知，重組表達載體O/,Zn-SOD~m22b(+)表達載體在Cu，ZnSOD特異性引物引導下擴增得到了約480bp的片段，與Cu，Zn-SODcmk片段大小相符。圖6可知，重組載體經雙酶切后，斷裂為5440bp和476bp兩條片段，與預期片段大小相符。對牦牛Cu,Zn-SOD-m22b(+)重組載體測序結果與實施例1中已測序的牦牛O/,Z/-5’fl9cDNA進行比對，結果顯示，O/,辦-Sfl^cDNA兩次測序結果完全一致，表明重組原核表達載體構建成功。實施例2、牦牛Cu,Zn-SOD-^E\Tlh(+)-￡co//BL21(DE3)基因工程菌表達一、構建牦牛Cu，Zn-SOD-^\22b(+)-E.co7iBL21(DE3)基因工程菌將O/,Z/-5’fl9-pET22b(+)重組載體轉化到大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌，具體操作步驟與上述實施例1步驟三牦牛Cu，Zn-SODcmk克隆中的轉化操作相同。二、IPTG誘導Cu，Zn-SOD-^\22b(+)~B.co7iBL21(DE3)基因工程菌表達(1)挑取重組菌單菌落于LB培養基中培養過夜，以含有空載體的細菌樣品做對照；(2)次日，將實驗組與對照組活化的種子菌以1:40體積比的比例接種到含有氨芐青霉素的LB培養基中，于37°C，120rpm震蕩培養；(3)待實驗組與對照組細菌OD6tltl=O.51時，加IPTG至濃度為lmmol/L，繼續培養5h；(4)4000r/min離心5min，收集菌體。三、表達產物SDS-PAGE電泳檢測(1)將上述離心收集的表達產物溶于PBS緩沖液(含8mol/L尿素，pH7.5)，4°C，12000rpm，離心IOmin；(2)取上清加入等體積2XSDS樣品緩沖液，煮沸5min；(3)吸取10μL樣品，用常規SDS-PAGE方法進行檢測(濃縮膠濃度4.5%，分離膠濃度10%)，記錄結果數據。取Cu，Zn-SOD-m22b(+)_E.co7iBL21(DE3)基因工程菌誘導的蛋白質上清液進行SDS-PAGE電泳檢測，以IPTG誘導的含pET22b(+)空載體的菌體蛋白和未經誘導的Cu,Zn-SOD~m22b(+)~E.co7iBL21(DE3)基因工程菌菌體蛋白為對照組。由圖9可知，實驗組與對照組均呈現出17.SKDa的蛋白質條帶，與重組Cu，Zn-SOD蛋白質單體分子量相符，與對照組相比，經IPTG誘導的O/,Zn-SOD-m22b(+)-E.co7iBL21(DE3)基因工程菌的蛋白條帶更為明顯，蛋白質含量更高。由此表明，實驗組中該特異性蛋白質條帶可能為在大腸桿菌中表達的牦牛Cu，Zn-SOD蛋白，但表達產物的活性還需進一步檢測。四、負染色法鑒定表達產物(1)將上述溶于PBS的上清液進行10%PAGE電泳，分別用提純的牦牛血液Cu，Zn-SOD和含空載體的細菌細胞上清液作為陽性對照和陰性對照；(2)電泳結束后取出凝膠條，放入NBT-TEMED-核黃素體系溶液(1.5mmol/LNBT+O.lmmol/LTEMED+O.12mmol/L核黃素+67mmol/L磷酸鹽緩沖液pH7.5)中避光染色30min，倒出染色液。(3)用pH7.5的PBS沖洗膠片兩次，膠片置與強20W日光燈下照射45min左右，則凝膠條無SOD活性部分全部為紫藍色，而有SOD活性的部分顯現出無色透明的酶帶，記錄結果數據。取等量經IPTG誘導的Cu，Zn-SOD-^\22b(+)~B.co7iBL21(DE3)基因工程菌表達產物和含空載體pET22b(+)的細菌的誘導表達產物進行PAGE電泳，以牦牛血液中提取的Cu，Zn-SOD為對照。由圖10可知，對照組牦牛血液Cu，Zn-SOD和經IPTG誘導的Cu,Zn-SOD~m22b{+)~E.co7iBL21(DE3)重組菌表達產物都在同一水平線上出現較亮的條帶，表明本研究的牦牛偽,辦-5’fl9cDNA在大腸桿菌中表達的產物具有生物學活性且分子量與天然牦牛Cu，Zn-SOD基本一致，為32KDa。五、表達產物的酶活性測定用鄰苯三酚自氧化法對表達產物SOD進行酶活性測定，用含空載體的菌液作對照。(1)鄰苯三酚自氧化速率的測定取pH8.2的Tris-HCl-EDTA緩沖液4.5mL于IOmL比色管中，在25°C恒溫的45mmol/L的鄰苯三酚溶液10.0μL，混勻后迅速置Icm石英比色杯325nm波長測光密度，每隔30s測一次光密度值，共測4min，求出鄰苯三酚自氧速率ODa/min。同時用10mmol/L鹽酸做空白試驗。(2)SOD活性測定取pH8.2的Tris-HCl-EDTA緩沖液4.5mL于IOmL比色管中，25°C恒溫lOmin，加入已恒溫至25°C的樣品緩沖液10mL，迅速混勻，用325nm波長測定密度值，每30s測一次，測4min，求出光密度值變化速率0Db/min。(3)計算方法酶活力(U/mL)=(ODa-ODb)/ODaX100%+S(Fc)XnXV1ZV2(V1—反應體系；V2—測定樣品體積；N—樣品稀釋液倍數；ODa—鄰苯三酚的自氧化速率；ODb—樣品光密度值變化速率)用鄰苯三酚自氧化法分別對IPTG誘導5h的含pET22b(+)空載體和Cu,Zn-S0D-pET22b(+)重組載體的受體菌表達產物蛋白粗提液中牦牛Cu，Zn-SOD進行活性測定。結果顯示，Cu,Zn-SOD-m22b(+)~E.co7iBL21(DE3)基因工程菌表達產物每毫克粗蛋白中Cu,Zn-SOD活性為35U/mg。由此表明，Cu，Zn~SOD-^122b(+)-B.co7iBL21(DE3)基因工程菌表達的牦牛Cu，Zn-SOD蛋白活性較高。實施例3、牦牛Cu,Zn-SOD蛋白質純化一、包涵體洗滌法純化Cu，Zn-SOD蛋白質(1)經IPTG誘導的表達菌，4°C12000r/min離心15min，收集菌體；(2)菌體中加入細胞裂解液(20mMNa3P04，500mMNaCl，pH7.4，Ig菌體濕重加入IOml裂解液)重懸菌體，洗滌2次；(3)菌體懸濁液置于冰上超聲破碎20min，破碎5s、間斷9s，4°C12000r/min離心15min，收集沉淀；(4)加入包涵體洗滌液I(20mMNa3P04，500mMNaCl，0.l%TritonX-100,pH7.4，Ig菌體濕重加入20ml包涵體洗滌液)重懸沉淀，4°C靜置20min，反復洗滌5次；(5)以同樣的方法用包涵體洗滌液II(20mMNa3P04,500mMNaCl,2MUrea,pH7.4)洗滌包涵體5次，4°C12000r/min離心15min,收集沉淀；(6)洗滌后的沉淀加入包涵體變性液(20mMNa3P04，500mMNaCl，8MUrea，pH7.4，Ig菌體濕重加入IOml包涵體變性液)4°C溶解過夜，4°C12000r/min離心30min，收集上清液，經0.45μm濾膜過濾備用。二、包涵體蛋白透析復性用尿素濃度梯度法透析復性牦牛Cu，Zn-SOD蛋白質(1)將透析袋剪成適當長度，在含ImMEDTA的Na2CO3溶液中沸30分鐘，用蒸餾水徹底清洗；(2)用棉線將透析袋的一頭扎結，并保證不漏，將洗脫下來的含有目的蛋白的各管洗脫液混合，加到透析袋中，打結透析袋的另一頭，將透析袋加入到含6M尿素的PBS透析緩沖液中；(3)更換透析液，依次以含6M、5M、4M、3M、2M、1M、OM尿素的磷酸鹽緩沖液，4°C進行透析。(4)以不含尿素的PBS緩沖液4°C透析過夜，Bradford法測定純化后的融合蛋白濃度。(1)在96孔酶標板A行各孔中依次加入不同濃度的BSA標準蛋白質溶(0.110mg/ml結晶牛血清蛋白溶液)10μL，同樣的方法在B行與C行中也加入標準蛋白質溶10μL；(2)在第四行各孔中各加10μL樣品，每個樣品重復加3孔；(3)各孔中加入考馬斯亮藍G250染色液200ul，混勻，反應板室溫放置(樣品中若有蛋白質存在，試劑又棕色變成藍色)；(4)用酶標儀讀取各孔595nm的吸光度值；(5)用A、B、C三列吸光度的平均值繪制標準曲線，計算待測蛋白質濃度。經計算，本發明得到的牦牛Cu，Zn-SOD蛋白質濃度為0.14mg/ml。三、復性蛋白質SDS-PAGE電泳檢測上述復性后的蛋白質進行SDS-PAGE電泳檢測，方法與實施例3中相同。由圖11可知，重組基因工程菌表達的牦牛Cu，Zn-SOD蛋白質單體分子量為17.SkDa0四、復性蛋白質酶活性測定用鄰苯三酚自氧化法測定復性后的SOD酶活性，方法與實施例3中相同。鄰苯三酚自氧化速率在每分鐘的光吸收值為0.07，本發明中牦牛Cu，Zn-SOD酶活力為3612U/mg。序列表<110>西南民族大學<120>牦牛銅鋅超氧化物歧化酶重組表達蛋白質<160>4<210>1<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>1ggccatggcgacgaaggccgtctgcgtgc29<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>2gcaagcttgaatgtttacttggcaattc28<210>3<211>459<212>DNA<213>牦牛(Bosgrunniens)<400>atggcgacgaaggccgtctgcgtgctgaagggcgacggcccggtgcaaggcaccatccac60ttcgaggcaaagggagatacagtcgtggtaactggatccattacaggattgactgaaggt120gatcatggattccacgtccatcagtttggagacaatacacaaggctgtaccagtgcaggt180cctcactttaatcctctgtccaaaaaacacggtgggccaaaagatgaagagaggcatgtt240ggagacctgggcaatgtgacagctgacaaaaacggtgttgccgtcgtggatattgtagat300tctctgatttcactctcaggagaatattccatcattggccgcacgatggtggtccatgaa360aaaccagatgacttgggcagaggtggaaatgaagaaagtacaaagactggaaacgctgga420agtcgtttggcctgtggtgtaattggaattgccaagtaa459<210>1<211>152<212>PRT<213>牦牛(Bosgrunniens)<400>4MetAlaThrLysAlaValCysValLeuLysGlyAspGlyProValGlnGlyThrlleHis20PheGluAlaLysGlyAspThrValValValThrGlySerlleThrGlyLeuThrGluGly40AspHisGlyPheHisValHisGlnPheGlyAspAsnThrGlnGlyCysThrSerAlaGly60ProHisPheAsnProLeuSerLysLysHisGlyGlyProLysAspGluGluArgHisVa180GlyAspLeuGlyAsnValThrAlaAspLysAsnGlyValAlaValValAspIleValAsp100SerLeuIleSerLeuSerGlyGluTyrSerIIeIIeGlyArgThrMetValValHisGlu120LysProAspAspLeuGlYArgGlyGlyAsnGluGluSerThrLysThrGlyAsnAlaGly140SerArgLeuAlaCysGlyValIIeGlyIIeAlaLys*15權利要求一種構建含有牦牛Cu,Zn-SODcDNA的表達載體的方法，其特征在于包括以下步驟(1)根據奶牛Cu,Zn-SODcDNA序列，用DNAsisforWindowsVer2.5設計一對PCR引物，引物序列如下上游引物P1:5′-CATGCCATGGCGACGAAGGCCGTCTGCGTGC-3′下游引物P2:5′-CCCAAGCTTGAATGTTTACTTGGCAATTC-3′(2)提取牦牛肝臟RNA,以提取的牦牛肝臟RNA為模板，在引物P1和P2的引導下進行逆轉錄PCR擴增；(3)將RT-PCR產物連接到pGM-T載體，轉化到E.coliTOP10宿主菌進行克隆，用菌液PCR、質粒雙酶切方法篩選陽性重組質粒，用雙脫氧鏈終止法對陽性重組質粒中的Cu,Zn-SODcDNA測序，將測序結果正確的陽性重組質粒命名為Cu,Zn-SOD-pGM-T質粒；(4)用限制性內切酶NcoⅠ和HindⅢ對Cu,Zn-SOD-pGM-T質粒和pET22b(+)質粒分別進行雙酶切，分別回收得到Cu,Zn-SODcDNA片段和pET22b(+)開環線狀載體；(5)將Cu,Zn-SODcDNA片段連接到pET22b(+)開環線狀載體，轉化到E.coliTOP10宿主菌，用菌液PCR、質粒雙酶切及DNA測序法篩選陽性重組質粒，得到重組載體Cu,Zn-SOD-pET22b(+)。2.根據權利要求1所述的構建含有牦牛Cu，Zn-SODcmk的表達載體的方法，其特征在于步驟(2)中所述逆轉錄PCR擴增包括逆轉錄和PCR反應，其中所述逆轉錄的IOyL體系為MgCl22.ΟμL，IOXRTBufferl.ΟμL，RNaseFreedH203.75μL,dNTPMixturel.OyL,AMVReverseTranscriptaseO.5μL,RNaseInhibitorO.25μL,Oligo-TO.5μL,牦牛肝臟RNA1.OyL,逆轉錄擴增反應條件為420C，45min；99°C，5min；5°C，5min；所述PCR反應的50μL體系為牦牛cDNA模板1.25ng，10XPCR緩沖液5.00μL，25mmol/L的MgCl22.00μL,2.5mmol/L的dNTPs2.00μL,5U/μL的位TaqDNA聚合酶0.50μL，20pmol/yL的上游引物Ρ10.50μL，20pmol/μL的下游引物P20.50μL，余量為無菌蒸餾水，PCR擴增反應條件為94°C預變性5min；94°C變性35s，50.50°C退火35s，72°C延伸90s，共32個循環；72°C延伸IOmin03.根據權利要求1所述的構建含有牦牛Cu,Zn-SODcMk的表達載體的方法，其特征在于步驟(3)中所述將RT-PCR產物連接到pGM-T載體進行克隆的5μL連接體系為-.Cu，Zn-SODomkl.00μL,載體pGM-TO.5μL,LigationMix2.5μL，步驟(5)中所述將Cu，Zn-SODcMk片段連接到pET22b⑴開環線狀載體后轉化到E.co7iT0P10宿主菌的5μL連接體系為Zn-SODomkl.00μL，pET22b(+)開環線狀載體0.5μL，LigationMix2.5yL，連接條件為16°C連接過夜。4.根據權利要求1所述的構建含有牦牛0/,Z/7-5’fl9CDNA的表達載體的方法，其特征在于步驟(4)所述雙酶切的20L體系為質粒DNA10.00μL,10XKBuffer2.00μL,BSA3.00μL,HindIII1.OOyL,AfcoII.00μL，余量為無菌蒸餾水，雙酶切的反應條件為，37°C消化3h。5.根據權利要求1所述的構建含有牦牛Cu,Zn-SODcmk的表達載體的方法，其特征在于步驟(3)、步驟(5)中所述轉化按以下步驟進行(1)將上述5.0μL連接體系，包括Ω/，Zn-SODomkl.00μL，線狀載體pGM_T或pET22b(+)O.5μL，LigationMix2.5μL,加入50μL冰上預冷的Ε.co7iTOPlO感受態細胞，冰浴30min；(2)42°C水浴熱激90s，放入冰浴IOmin；(3)加入SOC培養基800.0μL，混勻，37°C、120r/min振蕩培養60min；(4)5000r/min離心30s，吸去大部分上清液，留下200.0μL上清液，重懸沉淀；(5)將細菌懸濁液均勻涂布在LB平板培養皿上，在37°C培養1220h，所述LB平板培養皿含有10mmol/LIPTG、40.0μL2%X_gal、100.0μg/mLAmp；(6)用封口膠封住LB平板培養皿，放入4°C冰箱顯色30min；(7)挑取單個白色菌落接種于2mLLB液體培養基，37°C、120r/min培養12h后進行菌液PCR鑒定，所述LB液體培養基含100.0μg/mLAmp。6.按照權利要求1-5所述構建方法得到的重組載體0/,Z/7-5’fl9-pET22b(+)，其特征在于該重組載體包含由序列表中序列3的核苷酸序列組成的牦牛0/,Z/-5’fl9CDNA基因、PelB信號序列、pET22b(+)載體元件，并且所述牦牛銅鋅超氧化物歧化酶cDNA基因位于pET22b(+)載體的Afco/和^ifli////限制性內切酶酶切位點之間。7.一種牦牛Cu，Zn-SOD~m22b(+)-Ε.co7iBL21(DE3)工程菌，其特征在于它是將重組載體偽，Z/7-5a9-pET22b(+)轉化到萬.co/iBL21(DE3)宿主菌中得到的。8.一種權利要求7所述牦牛Ω/，Zn-SOD~m22b(+)~E.co7iBL21(DE3)基因工程菌高效表達方法，其特征在于該基因工程菌高效表達方法包括對鑒定正確的重組基因工程菌進行IPTG誘導表達、用負染色法對表達產物進行鑒定、對重組蛋白進行純化及復性，其中所述重組基因工程菌IPTG誘導表達方法包括以下步驟(1)經鑒定正確的Cu，Zn-SOD-m22b(+)_Ε·co7iBL21(DE3)基因工程菌接種于含氨芐青霉素的LB培養基中，37°C120rpm震蕩培養過夜，基因工程菌菌液與LB培養基的體積比為1:100；(2)次日，將過夜培養后的基因工程菌以1:40的體積比例接種到含氨芐青霉素的LB培養基中，于37°C震蕩培養；(3)細菌OD6qq=O.51時，加入lmMIPTG，30°C，誘導表達9小時；(4)4000r/min離心5min，收集菌體，進行SDS-PAGE電泳，所述SDS-PAGE電泳的分離膠濃度為15%，積聚膠濃度為5%；所述負染色法鑒定表達產物包括以下步驟(1)將溶于PBS緩沖液的總蛋白上清液進行10%PAGE電泳，分別用提純的牦牛血液Cu,Zn-SOD和含空載體的細菌細胞上清液作為陽性對照和陰性對照；(2)電泳結束后取出凝膠條，浸入NBT-TEMED-核黃素體系溶液中避光染色30min，倒出染色液，所述NBT-TEMED-核黃素體系溶液中含有1.5mmol/LNBT、0.lmmol/LTEMED、0.12mmol/L核黃素、67mmol/L磷酸鹽緩沖液pH7.5；(3)用pH7.5的PBS沖洗膠片兩次，膠片置于20W日光燈下照射45min，凝膠條無SOD活性部分全部為紫藍色，有SOD活性的部分顯現出無色透明的酶帶，記錄結果數據；所述重組Cu，Zn-SOD蛋白質純化方法，包括以下步驟(1)經IPTG誘導的表達菌，4°C12000r/min離心15min，收集菌體；(2)按Ig菌體濕重加入10mLpH7.4的細胞裂解液重懸菌體，洗滌2次，所述細胞裂解液包括20mMNa3P04、500mMNaCl；(3)菌體懸濁液置于冰上超聲破碎20min，破碎5s、間斷9s，4°C12000r/min離心15min，收集沉淀；(4)按Ig菌體濕重加入20mLpH7.4的包涵體洗滌液I重懸沉淀，4°C靜置20min，反復洗滌5次，所述包涵體洗滌液I包括20mMNa3P04、500mMNaCl、0.l%TritonX-100；(5)以同樣的方法用pH7.4的包涵體洗滌液II洗滌包涵體5次，4°C12000r/min離心15min，收集沉淀，所述包涵體洗滌液II包括20mMNa3P04、500mMNaCl、2MUrea；(6)按Ig菌體濕重加入IOmL包涵體變性液向洗滌后的沉淀中加入pH7.4的包涵體變性液，4°C溶解過夜，40C12000r/min離心30min，收集上清液，經0.45μm濾膜過濾備用，所述包涵體變性液包括20mMNa3P04，500mMNaCl，8MUrea；所述重組蛋白質復性包括以下步驟將上述重組Cu，Zn-SOD蛋白質純化方法步驟(6)純化得到的包涵體蛋白用尿素濃度梯度法4°C透析復性，透析緩沖液依次以含6M、5M、4M、3M、2M、1M、OM尿素的PBS緩沖液，最后以無尿素的PBS緩沖液4°C透析過夜。全文摘要本發明公開了一種牦牛銅鋅超氧化物歧化酶重組表達系統的構建方法及重組蛋白質。用逆轉錄聚合酶鏈式反應克隆牦牛肝臟Cu,Zn-SODcDNA，連接到原核表達載體pET22b(+)，構建重組原核表達載體，并轉化到大腸桿菌構建基因工程菌，對基因工程菌進行IPTG誘導表達并純化Cu,Zn-SOD蛋白質,得到的蛋白質用尿素濃度梯度法透析復性并用鄰苯三酚自氧化法進行酶活性測定。本發明提供了一種高效穩定的牦牛Cu,Zn-SOD重組表達系統的構建方法及重組表達的牦牛Cu,Zn-SOD蛋白質，本發明為豐富SOD資源，降低生產成本及SOD在自身免疫性疾病治療、制藥、保健品、食品、化妝品等領域的開發利用奠定了基礎。文檔編號C12N15/66GK101818166SQ20101016932公開日2010年9月1日申請日期2010年5月12日優先權日2010年5月12日發明者徐亞歐,楊德孝,毛亮,毛德才,袁忠,鄭玉才申請人:西南民族大學