專利名稱：牙齦卟啉單胞菌促血凝功能結構域hgp44基因的克隆重組菌及構建方法
技術領域：
本發明涉及牙齦卟啉單胞菌促血凝功能結構域Hgp44基因的原核表達質粒。
背景技術：
牙周病是人群中發病率很高的口腔三大疾病之一，在我國人群中發病率高達75% 以上。牙周病是由牙菌斑中的微生物引起的牙周支持組織的慢性感染性疾病，主要癥狀是 牙周袋形成、進行性附著喪失和牙槽骨吸收，最終可導致牙松動和被拔除。牙周病屬于慢性 感染性疾病，免疫機制在疾病的發展過程中也發揮了重要的作用。冠心病是目前主要致死性疾病之一，病因機制復雜，傳統的致病因素是高血脂、高 血壓、糖尿病、遺傳、吸煙等。近年來越來越多的學者發現動脈粥樣硬化(AS)形成過程中常 伴隨著炎癥反應，病原微生物可以侵襲入內皮細胞、平滑肌細胞，激發和促進動脈粥樣硬化 的炎癥反應，由此推測感染可能是冠心病一個重要的致病因子。炎癥反應和免疫反應關系 非常密切，免疫反應是炎癥反應的重要啟動因素。大量的流行病學研究揭示了牙周病和冠心病之間存在一定的相關性，進一步的實 驗研究提示牙周病主要致病菌牙齦卟啉單胞菌(P. g)在一定程度上促進了動脈粥樣硬化 形成。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,P. g)是革蘭氏陰性、專性厭氧的產黑 色素短桿菌，能產生多種與牙周組織破壞有關的侵襲性因子，主要有內毒素、菌毛、牙齦素 等，是目前公認的重要的牙周炎致病菌，也是牙周炎活動性檢測的指示菌。投射掃描電子顯 微鏡發現P. g可以侵入人臍靜脈內皮細胞。牙齦素是P. g分泌的胞外蛋白酶，可破壞細胞基質，使宿主免疫調節失 衡。目前發現，與牙周疾病關系密切的牙齦素主要有兩種精氨酸特異性蛋白酶 (Arginine-gingipains, Rgps)禾口賴氛酸特異性蛋白醇(Lysine-gingipain, Kgp)，其中 Rgps又稱卟啉素，分為RgpA和RgpB兩種。RgpA和Kgp均為非共價復合物，包一個N-末端 前肽區，蛋白水解區和一個C-末端粘附素區(HGP15[HbR]，Hgpl7，Hgp27和Hgp44)，具有獨 立的催化區域和凝集區域。然而RgpB—級結構只有催化區域，其相當于HRgpA的催化亞基。 動脈粥樣硬化過程伴隨有炎癥反應，而內皮細胞激活是炎癥反應的關鍵步驟。P. g可以激活 內皮細胞黏附分子如細胞間黏附分子、血管細胞黏附分子的釋放，從而有利于中性粒細胞 向內皮細胞趨化，促進血管平滑肌細胞的遷移和增殖，促進血細胞的游走以及動脈粥樣硬 化的形成。Hgp44是牙齦素上一段粘附素區域，Hgp44能夠通過粘附到HIV_lgpl20蛋白上， 阻斷HIV-I外膜介導的膜融合，進一步阻斷HIV感染。同時，P. g依賴細胞內編碼Hgp44粘 附素的基因誘導血小板聚集。目前關于Hgp44促進血小板聚集的研究國外報道很少，而國 內沒有研究報道過。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種牙齦卟啉單胞菌促血凝功能結構域Hgp44基因的克隆重組菌，它是Hgp44-pET22b-BL21 (DE3)大腸埃希氏菌，其保藏編號為CGMCC NO. 3799，其拉丁學名為 Escherichia coli。本發明另一個所要解決的技術問題是提供一種上述克隆重組菌的構建方法，為 此，本發明采用以下技術方案它包括以下步驟1)、通過PCR方法克隆得到Hgp44基因；所述Hgp44基因序列如序列表中SEQ ID NO :1所示，PCR擴增的引物為上游5~-CCATATGAGCGGTCAGGCCGAG-3~下游-GCTCGAGTGCCGTAATCGTCTCTTC-3“，2)、通過酶切連接方法將Hgp44基因連接到表達載體pET 22b，形成質粒 Hgp44-pET22b ；3)、將構建的Hgp44-pET22b載體轉化到受體菌coli. BL21 (DE3)中，獲得克隆重組 菌 Hgp44-pET22b-BL21 (DE3)。牙齦卟啉單胞菌誘發機體產生一系列細胞因子引起機體自身免疫反應，并通過 RgpA,Kgp和HagA的編碼基因，即細胞內編碼Hgp44粘附素的基因誘導血小板聚集，促進內 膜膽固醇的沉積和血管壁增厚，從而對心血管系統產生嚴重危害。基于Hgp44在牙齦卟啉 單胞菌毒性中具有的意義，本發明利用已發表的牙齦卟啉單胞菌ATCC 33277Hgp44序列， 設計引物，采用PCR方法從P. g ATCC 33277全基因組DNA中擴增出Hgp44基因片段，克隆 到pMD 18-T載體，經酶切鑒定正確后送測序，測序結果證實與Genbank中牙齦卟啉單胞菌 ATCC 33277Hgp44序列高度同源。本發明選用的pMD18-T Simple Vector是一種高效克隆PCR產物(ΤΑ Cloning) 的專用載體，由PUC18載體改建而成，它消除了 pUC18載體上的多克隆酶切位點，再在pUC18 載體的多克隆酶切位點處導入了 EcoR V酶切位點，使用EcoR V進行酶切反應后，再在兩側 的3'端添加“T”而成本發明進行PCR反應擴增Hgp44基因時在PCR產物的3'末端添加 “A”的特性，使用該載體可以大大提高PCR產物的連接、克隆效率。PMD18-T載體消除了多 克隆酶切位點，克隆后的PCR產物將無法使用載體上的限制酶切下，所以本發明在為Hgp44 基因設計引物時便引入了 Xho I和Nde I的酶切位點，在酶切反應時就不會受到T載體上 其他多克隆酶切位點上的限制酶影響，如此大大提高了酶切效率，增加了亞克隆成功率。另 外，該載體分子量為2692bp，和擴增的目的基因hgp44的1083bp相比，在后期酶切回收目 的基因時可以很好的分辨，有利于產物的準確回收。表達載體PET 22b含有本實驗所需要 的內切酶位點，氨芐抗性有利于篩選轉化后的陽性克隆。配合E. coli.BL21(DE3)表達宿主 菌，用于高效表達外源基因的蛋白表達。本發明選用原核表達載體PET 22b在大腸桿菌中 進行融合表達，通過SDS-PAGE分析顯示表達蛋白的分子量約44KD左右，與預期的Hgp44蛋 白大小一致。本發明成功克隆了牙齦卟啉單胞菌的促血凝功能結構域Hgp44基因，并構建了 Hgp44原核表達系統，為繼續研究Hgp44的特性及其促進血小板聚集的具體機制奠定基礎。 Hgp44蛋白的成功表達為取得相應抗體，制備預防性疫苗的提供了前提條件，為建立敏感、 特異的牙齦素免疫檢測方法奠定了基礎，也為進一步阻斷牙周病致病途徑提供良好的分子 工具，為進一步明確牙周病和冠心病之間的相互關系奠定基礎。
圖1為Hgp44的PCR擴增結果電泳圖。圖2為pMD18T_Hgp44質粒Xho I、Nde I雙酶切鑒定結果圖。圖3為pET22b_Hgp44質粒PCR鑒定結果電泳圖。圖4為pET22b_Hgp44質粒的構建流程圖。圖5為重組菌Hgp44-pET22b-BL21 (DE3)表達蛋白的SDS-PAGE鑒定圖
具體實施例方式實施例1，牙齦卟啉單胞菌ATCC 33277基因組DNA及其目的基因Hgp44的獲得。本實施例描述了本發明提供的牙齦卟啉單胞菌促血凝功能結構域Hgp4基因的獲 得方法，克隆方法為PCR，包括以下步驟1、牙齦卟啉單胞菌ATCC 33277的培養和收集將牙齦卟啉單胞菌ATCC 33277菌種(上海市第九人民醫院口腔實驗室提供)接 種于非選擇性的⑶C瓊脂平板，37°C厭氧箱內(80% N2,10% C02及10% H2并放置鈀粒) 培養，常規接種，傳代，每平皿選取4-8個進行涂片及生化鑒定及檢查。用PBS將平板上的 P. g菌落收集入1. 5ml的EP管中。2、牙齦卟啉單胞菌ATCC 33277基因組抽提用上海生工生物工程技術服務有限公司的柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒(EZ SpinColumn Bacterial Genomic DNA Isolation Kit UNIQ-10)抽提 P. g 菌的全基因組。 抽提的P. g基因組(標記為P. g DNA)凍存于-20°C冰箱。3、PCR 擴增目的片段 P. g ATCC 33277 的 Hgp44 基因根據GenBank已知的U15282Hgp44基因序列設計并合成特異引物上游 5~-CCATATGAGCGGTCAGGCCGAG-3~ 下游 5:GCTCGAGTGCCGTAATCGTCTCTTC_3~。PCR擴增產物經1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，產物片段約為llOObp，與預期大小相 符，見圖 1。圖中，M :DL2000DNA Marker ；1 陰性對照；2、3、4 :Hgp44 的 PCR 產物實施例2重組質粒pMD_Hgp44制備將實施例1的擴增產物回收后克隆到pMD 18-T載體，轉化感受態細胞DH5a，經氨 芐及X-Gal/IPTG篩選陽性菌落，增菌后提取質粒，經Xho I、Nde I雙酶切后電泳檢測，在 IlOObp處可見酶切片段，初步成功構建pMD-Hgp44重組質粒。重組質粒的限制性酶切鑒定 結果見圖2。圖中，M =DNAMarker ；1,2 重組質粒酶切鑒定結果。以下具體描述上述制備過程1、pMD 18-T連接試劑(大連盒寶生物工程有限公司)產品，按試劑盒說明與PCR 回收產物Hgp44基因連接。2XaCl2法制備宿主菌E. coli DH5a感受態細胞(天根生化科技(北京)有限公 司提供)，細胞懸浮液添加冷凍保護劑(15%-20%甘油)后超低溫冷凍貯存備用(_86°C)；3、重組克隆質粒pMD_Hgp44轉化感受態受體菌E. coli DH5a ；取50ul感受態受體菌與5ul連接產物混勻后，冰浴30min ；42°C熱休克90min ；立 即置冰上2min，加900ul LB培養液，37°C振搖1. 5小時(130轉/分)；涂平皿將培養物于 室溫下以4000rpm，離心1分鐘，吸去大部分上清，留約IOOul上清，將菌體吹打混勻，涂氨芐陽性的LB瓊脂培養基平皿[含氨芐100ug/ml，40ul X-Gal (20mg/ml溶于二甲基甲酰胺)， 4ulIPTG (200mg/ml) ]，37°C溫箱，培養過夜；4、陽性克隆的篩選和鑒定藍白斑法篩選陽性克隆，挑取白色菌落37°C培養過夜，增菌后提取質粒，進行PCR 初步鑒定和Xho I.Nde I雙酶切鑒定，最后經測序確認。5、用柱式質粒小量抽提試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)快速提取 pMD-Hgp44質粒，然后0. 8% Agarose電泳觀察提取結果。6、重組質粒的酶切鑒定采用限制性內切酶Xho I, Nde I (Fermentas (MBI))進行酶切，回收Hgp44基因片 段，1. 0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定結果見圖27、克隆后Hgp44基因的序列測定PCR和酶切初步鑒定后，將含陽性重組質粒的菌液送金思特生物技術公司測序。載 體取名為pMD-Hgp44，內含Hgp44基因片段，長度約為llOObp，測定結果如下GGCCAGTGCCAAGAAGCATGACGGCAAGTGGACGATTCCATATGAGCGGTCAGGCCGAGATTGTTCTTGAAGCTCACGATGTTTGGAATGATGGATCCGGTTATCAGATTCTTTTGGATGCAGACCATGATCAATATGGACAGGTTATACCCAGTGATACCCATACTCTTTGGCCGAACTGTAGTGTCCCGGCCAATCTGTTCGCTCCGTTCGAATATACGGTTCCGGAAAATGCAGATCCTTCTTGTTCCCCTACCAATATGATAATGGATGGTACTGCATCCGTTAATATACCGGCCGGAACTTATGACTTTGCAATTGCTGCTCCTCAAGCAAATGCAAAGATTTGGATTGCCGGACAAGGACCGACGAAAGAAGATGATTATGTATTTGAAGCCGGTAAAAAATACCATTTCCTTATGAAGAAGATGGGTAGCGGTGATGGAACTGAATTGACTATAAGCGAAGGTGGTGGAAGCGATTACACCTATACAGTCTATCGTGACGGCACGAAGATCCAGGAAGGTCTGACGGCTACGACATTCGAAGAAGACGGTGTAGCTGCAGGCAATCATGAGTATTGCGTGGAAGTTAAGTACACAGCCGGCGTATCTCCGAAGGTATGTAAAGACGTTACGGTAGAAGGATCCAATGAATTTGCTCCTGTACAGAACCTGACCGGTAGTGCAGTCGGCCAGAAAGTAACGCTTAAGTGGGATGCACCTAATGGTACCCCGAATCCGAATCCGAATCCGAATCCAAATCCAAATCCGAATCCGAATCCCGGAACAACAACACTTTCCGAATCATTCGAAAATGGTATTCCTGCCTCATGGAAGACGATCGATGCAGACGGTGACGGGCATGGCTGGAAGCCTGGAAATGCTCCCGGAATCGCTGGCTACAATAGCAATGGTTGTGTATATTCAGAGTCATTCGGTCTTGGTGGTATAGGAGTTCTTACCCCTGACAACTATCTGATAACACCGGCATTGGATTTGCCTAACGGAGGTAAGTTGACTTTCTGGGTATGCGCACAGGATGCTAATTATGCATCCGAGCACTATGCGGTGTATGCATCTTCGACCGGTAACGATGCATCCAACTTCACGAATGCTTTGTTGGAAGAGACGATTACGGCACTCGAGCAATCTCCAGAGGATCGCCGGGAACCGAGGACGAGTCGTAATCATGT實施例3，pET22b-Hgp44 質粒構建，重組菌 Hgp44_pET22b_BL21 (DE3)本實施例描述了原核表達質粒pET22b_Hgp44的構建過程及在大腸桿菌中的蛋白 表達，包括以下步驟1、pMD_Hgp44質粒、pET22b載體的酶切及回收pMD_Hgp44 質粒、pET22b 載體(pET Expression System 22b 美國 Novagen 公司)分別經Xho I、Nde I雙酶切后，進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，回收Hgp44、pET22b片段。2、Hgp44片段與pET22b表達載體的連接通過瓊脂糖凝膠電泳對Hgp44片段和pET22b載體大致定量。3、連接產物轉化大腸桿菌BL21(DE3)，涂板(LBamp+)，37 °C過夜。4、原核表達質粒pET22b_Hgp44篩選第二天確定陰性對照無菌落長出后，長出的菌落即為重組菌落。標記為 Hgp44-pET22b-BL21(DE3)。5、誘導表達1)、取1-2個重組菌菌落，接入Iml含氨芐青霉素(50 μ g/ml)的LB培養液，37C培 養過夜。2)、取50 μ 1過夜培養物接入5ml含氨芐青霉素(50 μ g/ml)的LB培養液，37°C震 蕩培養2小時。3)、吸出Iml未經誘導的培養物放在一個微量離心管中，標記為 HGP44-pET22b (0)。4)、在剩余培養物中加入IPTG至終濃度為lmmol/L，37°C繼續通氣培養。在誘導的 不同時間，(1，2，3，4小時)，取Iml樣品放于微量離心管中，室溫高速離心1分鐘。5)、沉淀懸于100 μ 1 IX SDS凝膠加樣緩沖液，100°C加熱3分鐘，室溫高速離心1 分鐘，冰上放置，待全部樣品處理完后上樣。6)、樣品加熱至室溫，取20 μ 1懸液上樣于10% SDS聚丙烯酰胺凝膠。7)、60V恒壓電泳，至溴酚藍遷移到濃縮膠底部，進入分離膠后將電壓加至120V， 恒壓電泳直至溴酚藍遷移到分離膠底部。8)、考馬斯亮藍染色，觀察表達產物條帶。通過Xho I、Nde I雙酶切含Hgp44基因的重組質粒pMD_Hgp44和表達質粒 pET22b，回收獲得目的基因Hgp44和pET22b載體進行連接，轉化感受態細胞BL21 (DE3)， 涂皿LBAmp+培養，挑取陽性菌落進行增菌，提取質粒，PCR初步鑒定，獲得重組表達質粒 pET22b-Hgp44。pET22b_Hgp44 的 PCR 鑒定結果見圖 3。圖 3 中，M :DL2000DNA Marker ；1， 2 :pET22b-Hgp44PCR 鑒定結果；3 :Hgp44 基因。再經酶切鑒定正確后，獲得重組表達質粒pET22b_Hgp44。載體構建流程見圖4。其 中LacZ, Lacl β -半乳糖苷酶基因z, Amp, Ap 氨芐抗性基因，Ori，Π origin 復制起始原 點，LacZ, Lacl β -半乳糖苷酶基因。6. pET22b-Hgp44 原核表達蛋白的 SDS-PAGE 分析挑取單個陽性重組菌進行增菌，經IPTG方法誘導表達，對細菌總蛋白加熱變性后 進行SDS-PAGE電泳。圖5示誘導后出現一條明顯區別于誘導前細菌的表達蛋白條帶，分子 量在44KD左右，與預期蛋白分子量大小相符。圖中，M 中分子量Marker ；1 誘導前對照； 2,3,4 誘導后表達蛋白。
權利要求
牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis，P.g)促血凝功能結構域Hgp44基因的克隆重組菌，它是Hgp44 pET22b BL21(DE3)大腸埃希氏菌，其保藏編號為CGMCC NO.3799，其拉丁學名為Escherichia coli。
2.權利要求1所述的克隆重組菌的構建方法，其特征在于它包括以下步驟1)、通過PCR方法克隆得到Hgp44基因；所述Hgp44基因序列如序列表中SEQID NO 1 所示，PCR擴增的引物為上游 -CCATATGAGCGGTCAGGCCGAG-3“ 下游 5:GCTCGAGTGCCGTAATCGTCTCTTC-3~，2)、通過酶切連接方法將Hgp44基因連接到表達載體pET22b，形成質粒 Hgp44-pET22b ；3)、將構建的Hgp44-pET22b載體轉化到受體菌coli.BL21 (DE3)中，獲得克隆重組菌 Hgp44-pET22b-BL21(DE3)。
全文摘要
本發明提供一種牙齦卟啉單胞菌促血凝功能結構域Hgp44基因的克隆重組菌，它是Hgp44-pET22b-BL21(DE3)大腸埃希氏菌，其保藏編號為CGMCC NO.3799，其拉丁學名為Escherichia coli。本發明成功克隆了牙齦卟啉單胞菌的促血凝功能結構域Hgp44基因，并構建了Hgp44原核表達系統，為繼續研究Hgp44的特性及其促進血小板聚集的具體機制奠定基礎。Hgp44蛋白的成功表達為取得相應抗體，制備預防性疫苗的提供了前提條件，為建立敏感、特異的牙齦素免疫檢測方法奠定了基礎，也為進一步阻斷牙周病致病途徑提供良好的分子工具，為進一步明確牙周病和冠心病之間的相互關系奠定基礎。
文檔編號C12N15/70GK101942410SQ201010202399
公開日2011年1月12日 申請日期2010年6月13日 優先權日2010年6月13日
發明者崔紅花, 張衛東, 張琦霞, 朱海華, 鄧淑麗, 陳暉 , 鮑建芳 申請人:浙江大學