一種產油微生物的培養方法

專利名稱：一種產油微生物的培養方法
技術領域：
本發明屬于生物化工技術領域，特別涉及一種產油微生物的培養方法，可以更有效地控制微生物油脂積累過程，提高底物利用效率和油脂生產強度。
背景技術：
微生物油脂，又稱單細胞油脂，是酵母、細菌及霉菌等在一定條件下，轉化碳水化合物、甘油等有機物得到的脂類物質，其主要形式通常為甘油三酯。凡是可以在胞內油脂積累超過細胞干重20%的微生物，稱為產油微生物。與油料植物生產相比，微生物轉化碳水化合物生產油脂，不受場地、季節及氣候變化的影響，可以實現油脂規模化連續生產。微生物油脂技術可為生物能源產業發展提供新原料，具有重要應用前景。產油微生物油脂積累是一個高度依賴于生長環境，尤其是營養可得性的生物過程。早期研究表明，產油微生物在培養基中碳源過量而其它營養元素不足的條件下能將多余的碳源儲存為胞內油脂，這些限制性營養元素包括氮、磷、鋅、鐵和鎂等。文獻中一般通過控制培養基的氮源含量，使產油酵母在氮缺乏(通常碳元素與氮元素的比率(C/N比)大于 100)環境下產油(Ratledge CiWynn JP. The biochemistry and molecular biologyof lipid accumulation in oleaginous microorganisms. Adv ApplMicrobiol. 2002，51， 1-52)。生物化學研究表明，產油酵母三羧酸循環關鍵酶異檸檬酸脫氫酶活性依賴胞內腺苷酸。在氮限制環境下腺苷酸被轉化為肌苷酸，造成異檸檬酸脫氫酶缺少變構調節因子而活性降低。因此，三羧酸循環受抑制，菌體增殖減緩，碳代謝轉向脂肪酸合成，并在胞內積累油脂。基于氮限制策略的油脂發酵研究已取得了重要進展。例如在初始C/N比為315的培養基中產油紅酵母Rhodosporidium toruloides Y4細胞內油脂含量可達67% (李永紅，劉波，趙宗保，白鳳武.圓紅冬孢酵母菌發酵產油脂培養基及發酵條件的優化研究.生物工程學報，2006，22，650-656)。在高糖低氮條件下培養產油霉菌Mortierella isabellina, 當C/N比于150到340之間變化時，菌體油脂含量在50%以上(Papanikolaou S，Komaitis M, Aggelis G.Single cell oil production by Mortierellaisabellina grown on high-sugar content media. Bioresour Technol，2004，95，287-291)。早期文獻表明也有通過磷限制刺激產油酵母積累油脂的報道。培養基含30g/l葡萄糖和0. 05g/l 1^#04(初始C/P比為2720)時，連續培養Candida 107可得到油脂含量為36wt %的菌體(Gill CO, Hal1MJ, Ratledge C. Lipid accumulation in an oleaginous yeast(Candidal07) growing on glucose in single-stage cont inuous culture. ApplEnviron Microbiol, 1977，33，231-239)。而在初始C/P比為637的培養基中Rhodotorula glutinis可積累油月旨達至Ij 20wt% 以上(Granger LM, PerlotP, Goma G, Pareilleux A. Effect of various nutrient limitations onfatty acid product ion by Rhodotorula glutinis. Appl MicrobiolBiotechnol,1993，38，784-789)。大量文獻表明，產油微生物的油脂積累和菌體增殖關聯，即油脂生產具有部分生長耦聯的特征。部分生長耦聯的微生物過程通常需要有效兼顧菌體生長和產物積累，發酵過程優化難度大。目前報道的微生物油脂生產方法有批式發酵、批式補料發酵、連續發酵、部分細胞循環的連續發酵和兩階段連續發酵。以乳清濾液為原料，通過添加氯化銨調節C/N在32 40之間，進行有部分細胞循環的連續發酵，可以利用低濃度底物直接進行發酵，油脂生成速率達到0. 995g/L · h，干菌體油脂含量為33wt %，油脂得率系數為0. 17g 油/g糖(Ykema A, Verbree EC, Kater MM, Smit H. Optimizationof lipid production in the oleaginous yeast Apiotrichum curvaturein wheypermeate. Appl Microbiol Biotechnol. 1988，29，211-218)。利用甘油為底物，批式補料培養產油酵母Cryptococcus curvatus,過程底物利用度高，工藝簡單，發酵密度達到118g/L，干菌體油脂含量25wt %， 油月旨生成速率 0. 59g/L (Meesters PAEP, Hui jberts GNM, Eggink G. High-cell-density cultivation of the lipid accumulating yeastCryptococcus curvatus using glycerol as a carbon source. ApplMicrobiol Biotechnol. 1996，45，575-579)。以葡萄糖為碳源，限氮培養條件下批式補料培養產油酵母R. toruloides Y4，發酵密度達到106g/L，干菌體油脂含量67wt%，油脂生成速率0. 54g/L *h(Li YH, Zhao ZB, BaiFff. High-density cultivation of oleaginous yeast Rhodosporidiumtoruloides Y4 in fed-batch culture. Enzyme Microb iTechnol. 2007，41，312-317)。文獻報道了兩階段連續培養產油酵母Candida 107的方法(Hall MJ, Ratledge C. Lipid accumulation in an oleaginous yeast Candida 107growing on glucose under various conditions in a one-and two-stagecontinuous culture.Appl Environ Microbiol. 1977，33，577-584)。該過程的特征是菌體增殖階段獲得的含菌醪液直接按 37.5% (ν/ν)的比例接種到含有30g/L葡萄糖的溶液中，進行第二階段培養，以實現油脂積累。培養結束后菌體油脂含量為觀％，油脂得率系數為0. 14g油/g糖。由于菌體增殖階段的培養物中含有較豐富的營養成份，上述操作方法將部分營養成份及發酵代謝物帶入第二階段培養體系，不利于菌體高效積累油脂。另外，菌體增殖階段的醪液全部帶入油脂積累階段，導致發酵液體積過大，底物被稀釋，最終產物濃度低。在限制氮源和鐵離子條件下批式培養產油酵母Cryptococcus curvatus,菌體油脂含量為22. 5 %，脂肪得率系數 0. 12g/g ；批式補料培養時油脂含量達到50%，脂肪得率系數0. 15g/g (Hassan Μ, Blanc PJ, Granger LM, Pareilleux A, Goma G. Influence of nitrogenand iron limitations on lipid production by Cryptococcus curvatusgrown in batch and fed-batch culture. Process Biochem. 1996,31,355-361)。上述這些產油微生物培養過程的共同特點是菌體增殖階段和油脂積累階段沒有分離，即使在培養后期甚至終點，培養體系中仍然存在一定量的營養元素維持菌體緩慢增殖，底物代謝途徑復雜。為了兼顧菌體增殖和油脂積累對培養基成份的不同要求，實際應用的培養基對菌體增殖和油脂積累都不是最優培養基。因此，產物濃度、油脂得率系數和生產強度等技術指標偏低，微生物油脂生產的技術經濟性差。因此，需要一種新的產油微生物培養方法，以進一步提高微生物油脂生產的技術指標，降低成本，改善過程的技術經濟性。

發明內容
針對油脂發酵產物濃度、油脂得率系數和生產強度等技術指標偏低的問題，本發明人認真研究了現有產油微生物的培養方法，發現存在菌體增殖階段和油脂積累階段沒有分離的共同特點。為了兼顧菌體增殖和油脂積累對培養基成份的不同要求，實際應用的培養基對菌體增殖和油脂積累都不是最優培養基，這可能是導致微生物油脂生產技術經濟性差的重要原因之一。因此，本發明人進行了大量的科學研究和創造性的工作，設計出一種新的產油微生物培養策略，即菌體增殖和油脂積累兩階段獨立培養的微生物油脂生產技術。通過收集菌體增殖階段得到的微生物細胞，接種到產油培養基中，通氣培養進行油脂生產。通過調節產油培養基組成，使細胞在產油培養基增殖受阻，但可以高效合成油脂。本發明簡單易行， 可提高油脂生產強度和底物轉化率，減少廢水排放，降低原料成本，改善微生物油脂發酵的技術經濟性。本發明通過下述技術方案予以實現1、制備產油培養基，通過下述方法的一種或它們的必要組合方法實現A.控制氮源使用量，獲得C/N比大于800的培養基，此方法適用于碳源中不含氮源的情況；或，B.控制磷源使用量，獲得C/P比大于3000的培養基，此方法適用于碳源中不含磷源的情況；或，C.使用氮源清除劑，降低氮源含量，獲得C/N比大于800的培養基，此方法適用于發酵原料同時含有碳源和磷源的情況；或，D.使用磷源清除劑，降低磷源含量，獲得C/P比大于3000的培養基，此方法適用于發酵原料同時含有碳源和磷源的情況。2、菌體增殖培養及細胞收集采用營養相對豐富的培養基，在25 37°C，pH 4. 5 7. 5，通氣培養產油微生物，實現菌體快速增殖。培養結束后，采用離心分離或過濾的方法收集產油微生物細胞。3、油脂積累培養向產油培養基中按0. 04 1. 0克干菌體/克碳源的用量接種菌體增殖階段獲得的產油微生物細胞，在25 37°C，pH 3. 0 8. 0，通氣培養，當培養基中碳源含量低于5g/L時，終止培養。4、微生物油脂的提取本發明參考文獻(Li YH, Zhao ZB, Bai Fff. High-density cultivation of oleaginous yeast Rhodosporidiumtoruloides Y4 in fed-batch culture. Enzyme Microb Technol. 2007，41，312-317)的方法，在發酵結束后，經離心、洗滌，收集菌體沉淀。菌體在105°C干燥至恒重，即得干菌體。參照文獻(李植峰，張玲，沈曉京，等.四種真菌油脂提取方法的比較研究.微生物學通報，2001，觀(6) ,72-7 使用酸熱-有機溶劑法抽提獲得油脂，計算菌體油脂含量。本發明使用產油微生物是指發酵培養后在胞內積累油脂超過其生物總量 20% (w/w)的真核或原核微生物。它們包括但不限于，產油細菌，如ArthrcAacter屬、 Rhodococcus 屬或 Mycobacterium 屬等；產油酵母菌，如 Candida 屬、Cryptococcus 屬、Hansenula 屬、Lipomyces 屬、Rhodosporidium 屬、Rhodotorula 屬、Endomyces 屬、 Schwanniomye 屬、Trichosporon 屬、Sporobolomyces 屬，Trigonopsis 屬或 Yarrowia 屬等；產油霉菌，如 Mortierella 屬、Cunninghamella 屬、Mucor 屬或 Aspergillus 屬等；產油微藻，如 Crypthecodinium 屬、Botryococcus 屬、Chlorella 屬、Nannochloropsis 屬、吧Haliphthoros屬或khizochytrium屬等。這些菌株可以直接從包括中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)、美國典型培養物保藏中心(ATCC)以及中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)等菌種保藏機構購買或從自然界中分離，也可以使用與原來菌株性狀不同的人工或自然突變菌株。本發明在菌體增殖階段使用營養豐富、有利于菌體快速增殖的培養基。菌體增殖階段的培養基可以是常用的酵母培養基，如YEPD培養基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L)；可以在YEPD培養基上進一步優化，如增加碳源濃度或添加其它必要的微量元素；還可以是利用成份復雜的碳源原料制成的培養基。本發明在菌體增殖階段后期，采用離心或膜過濾的方法實現從發酵醪液中分離收集產油微生物細胞。發酵醪液在800g以上的離心力作用下離心，得到菌體，用于接種產油培養基；發酵醪液也可以應用孔徑小于5um的膜過濾，得到菌體，用于接種產油培養基。本發明用于制備產油培養基的碳源為單糖、寡糖、多糖、甘油以及必要的組合，它們包括但不限于，葡萄糖、木糖、果糖、蔗糖、糖蜜、乳清、纖維二糖、淀粉、甘油以及天然有機質或工農業副產品的水解產物，其中天然有機質或工農業副產品包括但不限于，玉米、小麥、水稻、甘薯、木薯、菊芋、土豆、蔗渣、農作物秸稈及淀粉廢水。為了利用同時含有碳源和氮源的原料生產油脂，本發明按照文獻采用化學沉淀法、三氯乙酸沉淀法、鞣酸沉淀法和Sevag法等方法清除原料中的氮源，獲得C/N比大于800 的培養基，用于接種產油微生物細胞。具體參考文獻如下1.李柱，杜國勇，鐘磊.化學沉淀法去除廢水中氨氮實驗研究.天然氣化工.2009，(34),24- ;2.余華.海帶多糖中蛋白質去除方法的對比研究.成都大學學報(自然科學版).2005，24(4)，265-268。為了利用同時含有碳源和磷源的原料生產油脂，本發明按照文獻采用化學沉淀法清除原料中的磷源，獲得C/P比大于3000的培養基，用于接種產油微生物細胞。具體參考文獻如下1.湯琪.磷酸銨鎂技術中不同沉淀劑脫氮除磷效果比較.重慶交通大學學報，2008，27(1)，148-151 ;2.黃自力，肖晶晶，李密.化學沉淀-磁絮凝深度快速除磷的研究·武漢科技大學學報，2009，32(1)，102-105 ;3.徐建宇，宮宇周，潘明富.幾種混凝劑深度除磷性能的對比研究.廣西輕工業，2009，(1)，89-91。本發明所述的磷源為磷酸鹽及經水解可釋放出磷酸根的物質。本發明所述的氮源為銨鹽及經在水溶液中可釋放形成銨離子的物質。本發明的有益效果是與現有的微生物油脂生產方法相比，本發明采用菌體增殖和油脂積累兩階段分別獨立培養，并且在油脂積累階段按底物濃度設計加入定量的產油微生物細胞。其生產工藝簡單，易于規模化生產，發酵所得的微生物油脂含量和得率系數高。 由于菌體增殖階段的發酵醪液被去除，菌體增殖階段產生的副產物很少帶入到產油培養基中，有利于油脂發酵下游的菌體分離、油脂提取和廢水處理等操作。本發明對底物的濃度要求低，不需要對低濃度碳源進一步濃縮，在一些含有磷和氮的有機質中可以通過簡單的方法去除磷或氮，然后直接應用于生產，節約了生產成本和能耗。


圖1為菌體增殖和油脂積累兩階段獨立培養的油脂生產流程簡圖。
具體實施例方式以下實施例選取了一些典型的制備過程(如圖1所示)，說明應用菌體增殖和油脂積累兩階段分別獨立培養的技術轉化碳源制備微生物油脂，這將有助于了解本專利，但不以任何形式限制其它產油菌株在其它碳源上應用本發明。實施例1(1)油脂積累培養基(g/L):葡萄糖27，pH 4. 5。(2)菌體增殖階段培養及菌體細胞收集培養基組成(g/L)葡萄糖20，酵母粉 10，蛋白胨 10，pH 5.5。培養基 450mL 于 121°C 滅菌 15min 后，接入 50mL Rhodosporidium toruloides AS 2. 1389 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)種子液，30°C通氣培養 35小時，將培養液于6000轉/分鐘離心10分鐘，得到濕菌體。(3)油脂積累階段培養將步驟(2)所得的菌體取2. 86 X IO9個菌(干菌體0. 18g) 接種至50mL步驟(1)所述已滅菌的產油培養基中，在30°C下通空氣培養48小時。(4)油脂的提取步驟C3)所得發酵液離心，收集菌體，在105°C下烘干至恒重，確定干菌體含量為10.6g/L。按文獻(李植峰，張玲，沈曉京，等.四種真菌油脂提取方法的比較研究.微生物學通報，2001，觀(6) ,72-7 使用酸熱-有機溶劑法提取油脂，確定油脂含量為66. 0%，殘糖含量為lg/L。經計算，在油脂積累階段油脂得率系數為0. 26g油/g糖。實施例2(1)油脂積累培養基(g/L):葡萄糖135，pH 4. 5。(2)菌體增殖階段培養及菌體細胞收集同實施例1，所用菌株為Iihodotorula glutinis AS 2. 499(購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)。(3)油脂積累階段培養將步驟( 所得的菌體取5. 73 X IO9個菌(干菌體0. 36g) 接種至50mL步驟(1)所述的產油培養基，在25°C下通空氣培養96小時。(4)油脂的提取同實施例1，所得干菌體含量為42. 4g/L，油脂含量為81. 0%，殘糖含量為3g/L，油脂積累階段油脂得率系數為0. 26g油/g糖。實施例3(1)油脂積累培養基(g/L):葡萄糖27，pH 4. 5。(2)菌體增殖階段培養及菌體細胞收集培養基組成(g/L)葡萄糖30g/L，酵母粉 10g/L,蛋白胨 10g/L, pH 5.5。培養基450mL 于 121 °C滅菌 15min后，接入 50mL Trichosporon cutaneum AS 2. 571 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)種子液，30°C通氣培養35小時，將培養液于6000轉/分鐘離心10分鐘，得到濕菌體。(3)油脂積累階段培養將步驟⑵所得的菌體取0. 95X 101°個菌(干菌體0. 59g) 接種至50mL步驟(1)所述的產油培養基，在37°C下通空氣培養M小時。(4)油脂的提取同實施例1，所得干菌體含量為17. 0g/L，油脂含量為30. 0%，殘糖含量為0. 2g/L，油脂積累階段油脂得率系數為0. 19g油/g糖。實施例4(1)油脂積累培養基(g/L)葡萄糖270，pH 4. 4。(2)菌體增殖階段培養及菌體細胞收集培養基組成(g/L)葡萄糖20，酵母10， 蛋白胨10，七水硫酸鎂0.3，pH 5.5。培養基450mL于121°C滅菌15min后，接入50mL Cryptococcus albidus ATCC 56四8 (購自美國典型培養物保藏中心)種子液，30°C通氣培養35小時，將培養液于6000轉/分鐘離心10分鐘，得到濕菌體。(3)油脂積累階段培養將步驟(2)所得的菌體取1. 15X101(I個菌(干菌體0. 71g) 接種至50mL步驟(1)所述的產油培養基，在30°C下通空氣培養240小時。(4)油脂的提取同實施例1，所得干菌體含量為79. Og/L，油脂含量為81. 8%，殘糖含量為0. 8g/L，油脂積累階段油脂得率系數為0. 24g油/g糖。實施例5(1)油脂積累培養基(g/L)葡萄糖270，pH 4. 6。(2)菌體增殖階段培養及菌體細胞收集同實施例1，所用菌株為Lipomyces starkeyi AS 2. 1560 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)。(3)油脂積累階段培養將步驟(2)所得的菌體取1. ^X IO11個菌(干菌體7. 9g) 接種至50mL步驟(1)所述的產油培養基，在37°C下通空氣培養95小時。(4)油脂的提取同實施例1，所得干菌體含量為218. Og/L，油脂含量為27. 1%，殘糖含量為1. 4g/L，油脂積累階段油脂得率系數為0. 22g油/g糖。實施例6(1)油脂積累培養基(g/L)葡萄糖135，pH 4. 4。(2)菌體增殖階段培養及菌體細胞收集同實施例1，所用菌株為Lipomyces kononenkoae CICC 1714 (購自中國工業微生物菌種保藏管理中心)。(3)油脂積累階段培養將步驟(2)所得的菌體取5. 70 X 101°個菌(干菌體3. 5g) 接種至50mL步驟(1)所述的產油培養基，在30°C下通空氣培養95小時。(4)油脂的提取同實施例1，所得干菌體含量為102. 6g/L，油脂含量為31. 4%，殘糖含量為0. 8g/L，油脂積累階段油脂得率系數為0. 24g油/g糖。實施例7(1)淀粉的液化將淀粉調節成質量濃度30%的淀粉乳，按文獻(林松毅，邵淑娟， 趙宇星，等.響應面法優化玉米淀粉液化工藝的研究.食品與機械，2009 (25)，14-19)使用耐高溫α-淀粉酶進行液化。(2)淀粉的糖化將液化后的料液按文獻(衣海龍，郭德軍，劉文芝，等.響應面法優化玉米淀粉糖化條件的研究.食品工業科技.2009 (30)，206-208)使用真菌淀粉酶和普魯蘭梅進行糖化，所得糖化液PH 4. 3，糖含量40g/L。(3)菌體增殖階段培養及菌體細胞收集同實施例1，所用菌種為Iihodotorula minuta AS 2. 277 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)。(4)油脂積累階段培養將步驟(3)所得的菌體取4. IlXlO9個菌(干菌體0. 26g) 接種至50mL步驟(2)所得的產油培養基中，在30°C下通空氣培養60小時。(5)油脂的提取將步驟⑷所得發酵液按實施例1(4)的油脂提取方法，所得干菌體含量為14. 4g/L，油脂含量為63. 7%，殘糖含量為0. 2g/L，油脂積累階段油脂得率系數為0. 23g油/g糖。實施例8(1)菊芋粉的制備將秋天收獲的菊芋切片干燥(含水量約8%)，然后粉碎過100 目篩，得菊芋粉。(2)將所得的菊芋粉調節成質量濃度10%的粉漿，并用2M的硫酸調節到pH 3.5，然后將其在121°C下保溫30min，冷卻。(3)將所得的菊芋粉水解液按文獻(余華.海帶多糖中蛋白質去除方法的對比研究.成都大學學報(自然科學版).2005，24 (4)，265-268)的方法去除氮源，碳元素與氮元素摩爾比率為832，然后將其調節至pH 5. 5，糖含量67g/L。(4)菌體增殖階段培養及菌體細胞收集同實施例1(5)油脂積累階段培養將步驟(4)所得的菌體取8. 72X 109個菌(干菌體0. 54g) 接種至50mL步驟(3)所得的產油培養基中，在30°C下通空氣培養96小時。(6)油脂的提取將步驟(5)所得發酵液按實施例1(4)的油脂提取方法，所得干菌體含量為27. 6g/L，油脂含量為60. 6%，殘糖含量為0. lg/L，油脂積累階段油脂得率系數為0. 25g油/g糖。實施例9(1)油脂積累培養基將制糖工業副產物糖蜜按文獻(湯琪.磷酸銨鎂技術中不同沉淀劑脫氮除磷效果比較.重慶交通大學學報，2008，27(1)，148-151)的方法去除磷源， 碳元素與磷元素摩爾比率為3180。然后將其調節至pH 4.5，糖濃度在10(^/1。(2)菌體增殖階段培養及菌體細胞收集同實施例1，所用菌種為Lipomyces starkeyi AS 2. 1560 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)。(3)油脂積累階段培養將步驟(2)所得的菌體取1. ^X 101°個菌(干菌體0. 80g) 接種至50mL步驟(1)所得的產油培養基中，在30°C下通空氣培養144小時。(4)油脂的提取將步驟(3)所得發酵液按實施例1(4)的油脂提取方法，所得干菌體含量為39. 4g/L，油脂含量為59. 4%，殘糖含量為2. 4g/L，油脂積累階段油脂得率系數為0. 24g油/g糖。實施例10(1)油脂積累培養基將乳酪工業的副產物乳清按文獻(黃自力，肖晶晶，李密.化學沉淀-磁絮凝深度快速除磷的研究.武漢科技大學學報，2009，32(1)，102-105)的方法去除磷源，碳元素與磷元素摩爾比率為3159，調節濃度至30g/L，pH 5. 2(2)菌體增殖階段培養及菌體細胞收集同實施例1，所用菌種為cryptococcus curvatus ATCC 20509 (購自美國典型培養物保藏中心)。(3)油脂積累階段培養將步驟(2)所得的菌體取4. 43 X IO9個菌(干菌體0. 27g) 接種至50mL步驟(1)所得的產油培養基中，在30°C下通空氣培養96小時。(4)油脂的提取將步驟(3)所得發酵液按實施例1(4)的油脂提取方法，所得干菌體含量為13. Og/L，油脂含量為58. 5%，殘糖含量為3. Og/L，油脂積累階段油脂得率系數為0. 28g油/g糖。實施例11步驟( 采用膜濃縮過濾，將得到菌體接種到產油培養基中(干菌體3. 5g)，接種后1)_= 110。其他條件均同實施例6，干菌體含量為102. 8g/L，油脂含量為31.3%，殘糖含量為0. 8g/L，油脂積累階段油脂得率系數為0. 24g油/g糖。實施例12步驟(1)油脂積累培養基pH值用硫酸調節到3.0。其他條件均同實施例1，培養 72小時后，干菌體含量為8. 6g/L，油脂含量為58. 1 %，殘糖含量為2. Og/L,油脂積累階段油脂得率系數為0. 20g油/g糖。實施例13步驟⑴油脂積累培養基pH值用NaOH調節到8. 0。其他條件均同實施例1，培養 84小時后，干菌體含量為8. 8g/L，油脂含量為57. 8 %，殘糖含量為1. 6g/L，油脂積累階段油脂得率系數為0. 20g油/g糖。實施例14(1)油脂積累培養基(g/L):葡萄糖90，pH 4. 5(2)菌體增殖階段培養及菌體細胞收集培養基組成(g/L)葡萄糖40，酵母粉 10，蛋白胨 10，pH 5.5。培養基 1800mL 于 121°C滅菌 15min 后，接入 200mL Rhodosporidium toruloides AS 2. 1389 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)種子液。在pH 5.6， 300C，通空氣量1. Ovvm,攪拌500rpm條件下培養18h，將培養液于6000轉/分鐘離心10分鐘，得到濕菌體。(3)油脂積累階段培養將步驟⑵所得的菌體取2. ^XlO11個菌(干菌體14. 2g) 接種至1900mL步驟(1)所述的產油培養基。在pH 5. 6，30°C，通空氣量1. Ovvm，攪拌500rpm 條件下培養20h。(4)油脂的提取同實施例1，所得干菌體含量為30. 9g/L，油脂含量為77. 6%，殘糖含量為1. 2g/L，油脂積累階段油脂得率系數為0. 27g油/g糖，生產強度為1. 20g/L h。實施例15(1)油脂積累培養基(g/L):葡萄糖30，pH 4. 5(2)菌體增殖階段培養及菌體細胞收集培養基組成(g/L)葡萄糖20，酵母粉 10，蛋白胨 10，pH 5.5。培養基 1800mL 于 121°C滅菌 15min 后，接入 200mL Rhodosporidium toruloides AS 2. 1389 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)種子液。在pH 5.6， 300C，通空氣量1. Ovvm,攪拌500rpm條件下培養18h，將培養液于6000轉/分鐘離心10分鐘，得到濕菌體。(3)油脂積累階段培養將步驟( 所得的菌體取3. 48 X 101°個菌(干菌體2. 2g) 接種至1900mL步驟(1)所述的產油培養基。在pH 5. 6，30°C，通空氣量1. Ovvm，攪拌500rpm 條件下培養10h。(4)油脂的提取同實施例1，所得干菌體含量為10. 2g/L，油脂含量為88. 1%，殘糖含量為0. lg/L，油脂積累階段油脂得率系數為0. 30g油/g糖，生產強度為0. 90g/L h。實施例16(1)油脂積累培養基(g/L)葡萄糖50，pH 4. 5(2)菌體增殖階段培養及菌體細胞收集培養基組成(g/L)葡萄糖40，酵母粉 20，蛋白胨 20，pH 5.5。培養基 1800mL 于 121°C滅菌 15min 后，接入 200mL Rhodosporidium toruloides AS 2. 1389 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)種子液。在pH 5.6， 300C，通空氣量1. Ovvm,攪拌500rpm條件下培養18h，將培養液于6000轉/分鐘離心10分鐘，得到濕菌體。(3)油脂積累階段培養將步驟⑵所得的菌體取1. 03X1013個菌(干菌體90. Og) 接種至1900mL步驟(1)所述的產油培養基。在pH 5. 6，30°C，通空氣量1. Ovvm，攪拌500rpm 條件下培養他。
10
(4)油脂的提取同實施例1，所得干菌體含量為57. Og/L，油脂含量為25. 3%，殘糖含量為0. 25g/L，油脂積累階段油脂得率系數為0. 29g油/g糖，生產強度為1. 80g/L h。實施例17(1)油脂積累培養基(g/L)葡萄糖120，pH 4. 5。(2)菌體增殖階段培養及菌體細胞收集培養基組成(g/L)葡萄糖20，酵母粉 10，蛋白胨 10，PH 5.5。培養基 9000mL 于 121°C 滅菌 15min 后，接入 IOOOmL Lipomyces starkeyi AS 2. 1560 (購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)種子液。在pH 5.6，30°C， 通空氣量1. Ovvm,攪拌500rpm條件下培養30h，將培養液于6000轉/分鐘離心10分鐘，得到濕菌體。(3)油脂積累階段培養將步驟(2)所得的菌體取3. 39X1011個菌(干菌體21. Ig) 接種至3500mL步驟(1)所述的產油培養基中(接種后體積約4000mL)。在pH 5. 6，30°C， 通空氣量1. Ovvm，攪拌500rpm條件下培養16h，培養基中的殘糖小于0. 9g/L，補加480g葡萄糖(未滅菌)，45小時后終止培養。(4)油脂的提取同實施例1，所得干菌體含量為104. 6g/L，油脂含量為64. 2%，殘糖含量為0. 2g/L，油脂積累階段油脂得率系數為0. 28g油/g糖，生產強度為1. 49g/L h。實施例18步驟C3)油脂積累培養基未經過滅菌，直接利用。其他條件均同實施例1，培養18 小時后，干菌體含量為11. 4g/L，油脂含量為68. 4%，殘糖含量為0. 2g/L，油脂積累階段油脂得率系數為0. 29g油/g糖。本發明優勢綜合評述本發明將菌體增殖和油脂積累兩部分進行解偶聯，采用兩階段的培養方法，便于實現高密度培養，油脂積累階段的得率系數和生產強度可分別達到0. 30g油/g糖和1. 80g/ L h，較常規培養模式可分別提高20%和80%以上，降低了生產成本，并減少廢水排放量。在油脂積累階段培養中，可對含有氮元素和磷元素的底物通過化學或物理的方法去除氮元素和磷元素，使底物中的碳流向油脂合成，提高油脂得率。采用兩階段的培養方法，菌體增殖和油脂積累可分別實現最優化，節省時間，經濟效益顯著。
權利要求
1.一種產油微生物的培養方法，其特征在于培養過程包括菌體增殖和油脂積累兩個獨立的階段，菌體增殖培養結束后，收集產油微生物細胞，將菌體增殖階段獲得的產油微生物細胞按0. 04 1. 0克干菌體/克碳源的用量接種到產油培養基中，進行油脂積累階段的培養。
2.按照權利要求1所述產油微生物的培養方法，其特征在于所述的產油培養基的碳源為單糖、寡糖、多糖以及甘油中的一種或幾種的混合。
3.按照權利要求1或2所述的培養方法，其特征在于所述產油培養基的碳元素與氮元素的摩爾比率大于800或碳元素與磷元素的摩爾比率大于3000。
4.按照權利要求1所述的培養方法，其特征在于所述的產油微生物細胞在菌體增殖階段結束后，采用離心分離或過濾濃縮技術予以收集，用于接種產油培養基。
5.按照權利要求1所述的培養方法，其特征在于所述產油微生物為在胞內積累油脂超過其生物總量20% (w/w)的真核或原核微生物。
6.按照權利要求1所述的培養方法，其特征在于產油微生物培養條件為通氣培養， 溫度25 37°C，pH 3 8，轉速40 800rpm。
全文摘要
本發明涉及一種產油微生物的培養方法。具體地講就是采用菌體增殖和油脂積累兩階段分別獨立培養，將菌體增殖培養得到的產油微生物細胞接種到產油培養基中，接種量為0.04～1.0克干菌體/克碳源，在pH 3～8，25～37℃通氣培養12～360小時，然后分離收集菌體，提取油脂。按本發明的方法進行微生物油脂生產，有利于實現高密度培養，提高菌體增殖和油脂積累的速度，節省時間，降低成本，并減少廢水排放量，取得顯著的經濟效益。
文檔編號C12P7/64GK102286375SQ20101020221
公開日2011年12月21日 申請日期2010年6月18日 優先權日2010年6月18日
發明者吳思國, 林金濤, 沈宏偉, 趙宗保 申請人:中國科學院大連化學物理研究所