專利名稱：一種枯草芽孢桿菌及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株枯草芽孢桿菌及其用途。
背景技術：
食物是人類生存和社會發展的第一物質基礎，而食品(農產品)安全是全世界共 同關注的問題，其中，食品防腐保鮮則是食品安全的一個關鍵。目前普遍使用的化學食品 防腐劑潛在的安全隱患不容忽視，但經長期的研究，發現一些合成防腐劑有誘癌性、致畸性 和易引起食物中毒等問題。隨著社會生活水平的不斷提高和消費者對健康的日益關注，人 們對防腐劑之類的食品添加劑在安全性能上提出了更高的要求，高效安全的天然食品防腐 保鮮劑的開發與應用是食品科學研究的發展趨勢。至今，國內外已從動物、植物和微生物等 各種生物資源開發溶菌酶、乳酸鏈球菌素(Nisin)、納他霉素(Natamycin)、ε -聚賴氨酸、 茶多酚、香精油、大蒜素、魚精蛋白、蜂膠、殼聚糖等一系列可作為天然食品防腐保鮮劑的產 品；但由于原料來源、本身的產品性能、制備工藝和價格等多種因素的限制，目前僅乳酸鏈 球菌(Lactococcus lactis)菌株產生的乳酸鏈球菌素等少數微生物源品種獲得了市場的 廣泛認可，得到了較大規模的使用。乳酸鏈球菌素是由部分乳酸鏈球菌菌株產生的細菌素， 由34個氨基酸組成，可抑制多種革蘭氏陽性細菌的生長繁殖，并對人體安全無毒。但nisin 在生產應用中存在其局限性，如它的最適活性PH值為3，在堿性條件下溶解度很少，穩定性 也差；食品的化學組成和物理性質也可顯著影響Msin的活性，如新鮮肉中含有的谷胱甘 肽能顯著降低乳酸鏈球菌素的活性，而且肉本身較高PH和磷脂等成分也降低了它的抗菌 效果；此外，國際上已發現李斯特菌等多種食品腐敗革蘭氏陽性細菌誘變后可對nisin具 有較大的抗性。因此，開發新的高效安全的天然食品防腐保鮮劑是保證食品(農產品)安 全的一項重要的任務。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種枯草芽孢桿菌，該枯草芽孢桿菌的發酵液具 有抗菌功能。為了解決上述技術問題，本發明提供一種枯草芽孢桿菌，保藏名稱為=Bacillus subtilisZJU15，保藏單位中國典型培養物保藏中心，保藏地址中國武漢武漢大學；保藏 日期2010 年 4 月 2 日，保藏號CCTCC No :M2010074。本發明還同時提供了上述枯草芽孢桿菌的用途用于抑制革蘭氏陽性病原細菌、 食品污染霉菌或植物病原真菌水稻紋枯病菌。本發明以ZJU15菌株(枯草芽孢桿菌CCTCC :M2010074)總DNA為模板，使用通用上 游引物(5，-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3 ’)，通用下游引物(5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ’) 進行PCR擴增獲得1455bp的16s rDNA部分序列(SEQ ID NO :1)。通過Blast與GenBank 收錄的細菌16s rDNA基因序列比對，發現ZJU15菌株與枯草芽孢桿菌的同源性為99%。用 MEGA4. 0作進化樹(圖1)，鑒定菌株(ZJU15)與一株枯草芽孢桿菌(AB301009)的同源性達到 100%。
下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1是本發明的ZJU15的16sDNA構建系統進化樹。
具體實施例方式實施例1、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ZJU15的獲得2007年6月9日在浙大生物技術研究所采集水稻葉片，用稀釋平板法從中分離細 菌(1)、制備稀釋液稱取水稻葉片10g，放入IOOml無菌水中，用高速組織搗碎機搗 碎。無菌操作吸取搗碎組織液1. Oml加入9. Oml無菌水中，再用無菌水稀釋為10人10_2， 10_3、10_4、10_5、10_6、10_7 共七個濃度梯度。(2)培養取各濃度的稀釋液IOOul分別涂布于LB培養基平板(蛋白胨10g/L， NaCllOg/L，酵母浸出物5g/L，瓊脂16g/L，其余為水；pH7. 0，121°C滅菌20分鐘)，涼干后倒 置恒溫箱內30°C培養。(3)取單菌落等平板上長出菌落后，根據形態挑取單菌落于IOml滅菌的LB液體 培養基(蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母浸出物5g/L，其余為水；pH7.0，121°C滅菌20分 鐘)中，搖床上30°C恒溫振蕩培養24小時；得細菌培養液。(4)采用甘油保藏法，在滅菌的菌種管中，加入1.0ml細菌培養液，0.5ml 50% (體 積濃度)的甘油，混勻后于-70°C冰箱保存。(5)以單增李斯特菌(Listeriae monocytogenes)為指示菌，進行拮抗菌的篩選 LB固體培養基加熱融化，冷卻到45-50°C時按(V/V)接指示菌培養液，混勻，制備平板。 在平板上接各分離菌株(步驟(4)所得)，恒溫箱內30°C培養，觀察抑菌狀況。結果從中篩 選出一株對李斯特菌具明顯抑菌效果的菌株，定名為ZJU15。菌落形態特征在LB培養基平板上培養初期菌落半透明膿狀隆起，邊緣整齊，表 面有皺摺；培養后期菌落乳白色，表面干燥，周圍粗糙。將該菌株ZJU15進行了保藏，保藏名稱為Bacillus subtilis ZJU15，保藏單位 中國典型培養物保藏中心，保藏地址中國武漢武漢大學；保藏日期2010年4月2日，保藏 號=CCTCC No :M2010074o實施例2、枯草芽孢桿菌菌株ZJU15產生的抗菌物，其制備過程具體如下1)、枯草芽孢桿菌菌株ZJU15種子液制備取一環保存于_70°C冰箱的枯草芽孢桿 菌菌株 ZJU15 (Bacillus subtilis ZJU15CCTCC No :M2010074)菌種接種于 LB 液體培養基 中，30°C下，200rpm/min振蕩培養12小時，作為種子培養液。2)、菌株抗菌代謝產物發酵將上述種子培養液以5% (V/V)濃度接種于LB液體 培養液中，在30°C下，200rpm/min振蕩培養18小時，獲得發酵液。3)、抗菌物的獲得將發酵液以6000 8000rpm/min離心lOmin，在所得上清液中 按照每100ml上清液加入Ilg固體硫酸銨的比例添加硫酸銨，從而使硫酸銨的飽和度約為 20%。4°C下放置4小時，然后再以12000rpm/min離心20min，收集沉淀。所得沉淀用占上清液1/15體積的滅菌蒸餾水懸浮，獲得抗菌物。實施例3、抗菌物(實施例2所得)對細菌的抑菌作用采用瓊脂擴散法(Agar Diffiution Assay)檢測抗菌物的拮抗活性。將各指示菌 接種于相應的培養基平板(見表1)，37°C培養18-24小時，挑取3-5個菌落，用滅菌生理鹽 水制成濁度約為0. 5麥氏比濁標準的懸液中。然后將相應的固體培養基(見表1)加熱融 化后，冷卻到45-50°C時按(V/V)接對數生長期的指示菌培養液，混勻，制備平板。用孔 徑為5mm的打孔器打孔，每孔加10 μ 1 ZJU15菌株抗菌物的二倍稀釋液(抗菌物用相同體 積的蒸餾水逐步稀釋)，37°C下培養過夜，觀察抑菌作用。抑菌活性的計算方式如果稀釋 2n倍具有最小抑菌圈，那么抑菌活性大小為2nX 1000 μι/ΙΟ μ L，η是指具有最小抑菌濃度 的稀釋倍數(Apolonio, Carvalho et al. 2008)，重復兩次。結果如表1，由表1可知枯草芽孢桿菌菌株ZJU15產生的抗菌物能夠有效抑制多種 食品污染禾口人體致病革蘭氏陽性細菌如Listeriae monocytogenes、Micrococcus luteus、 Enterococcus feacalis、Staphylococcus aureaus、Streptococcus pyogenes 等，但該抗 菌物對革蘭氏陰性細菌沒有抑制作用。表1、ZJU15菌株抗菌物對細菌的抑菌作用
權利要求
一種枯草芽孢桿菌，其特征是保藏名稱為Bacillus subtilis ZJU15，保藏單位中國典型培養物保藏中心，保藏地址中國武漢武漢大學；保藏日期2010年4月2日，保藏號CCTCC NoM2010074。
2.如權利要求1所述的枯草芽孢桿菌的用途，其特征是用于抑制革蘭氏陽性病原細 菌、食品污染霉菌或植物病原真菌水稻紋枯病菌。
全文摘要
本發明公開了一種枯草芽孢桿菌，其保藏名稱為Bacillus subtilis ZJU15，保藏單位中國典型培養物保藏中心，保藏地址中國武漢武漢大學；保藏日期2010年4月8日，保藏號CCTCC NoM2010074。本發明還同時公開了上述枯草芽孢桿菌的用途用于抑制革蘭氏陽性病原細菌、食品污染霉菌或植物病原真菌水稻紋枯病菌。
文檔編號C12N1/20GK101935628SQ20101020237
公開日2011年1月5日 申請日期2010年6月13日 優先權日2010年6月13日
發明者林文憑, 陳衛良 申請人:浙江大學