專利名稱：棘孢曲霉的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物技術領域，特別是涉及一種具有廣譜的高抗菌活性的微生物菌 株。
背景技術：
印楝(Azadirachta indica A. Juss)為一種熱帶樹種，原產于印度和緬甸，不僅 具有昆蟲拒食和殺蟲活性，還有抑制致病真菌和細菌生長、消炎、抗腫瘤、免疫調節等生理 活性，具有較高的生物農藥和醫藥價值。大多數活性物質為四降三萜類化合物，此外還包 括一些二萜、三萜、五降三萜及少量的非萜類化合物。印度研究人員曾經從生長在印度的印 楝植物中分離和鑒定了內生真菌(Rajagopal K et al，Current Science, 2000，78，1375 ； Mahesh B et al, Current Science,2005,88, 218 ；Verma VC et al, Microbial Ecology, 2007，54，119)。
發明內容
本發明的目的在于提供一種分離自中國云南省元江縣印楝(Azadirachtaindica A. Juss)植物活體中具有廣譜的高抗菌活性的微生物菌株_棘孢曲霉。本發明所述的棘孢曲霉系從中國云南省元江縣印楝植物活體中分離獲得。現在 國家知識產權局認可的保藏單位保藏，保藏單位名稱中國典型培養物保藏中心，簡稱 CCTCC，保藏單位地址中國，武漢大學，郵政編碼430072。保藏日期為2010年3月25日， 保藏編號為 CCTCC NO :M2010062o本發明所述的棘孢曲霉命名為棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus) YM311498，現 保藏在國家知識產權局認可的保藏單位，保藏編號為CCTCC NO :M2010062。該微生物屬于內生真菌，經形態觀察、培養特征以及分子生物學ITS rDNA基因序 列分析，確定其分類學地位屬于半知菌類(Deuteromycotina)曲霉屬(Aspergillus)的棘 孢曲霉(Aspergillus aculeatus)，菌株編號為 YM311498。棘孢曲霉Aspergillus aculeatus YM 311498在察氏培養基上，28°C培養7d后， 菌落直徑達4. 4cm，質地致密，菌落平坦，中央部分土黃色，周圍顏色白黃色背面顏色黃色， 形狀呈不規則圓形，有溝深陷培養基中。分生孢子結構較多，初為微黃色，老后變深呈土黃 褐色。在PDA培養基上，28°C培養7d后，菌落直徑達4. 7cm, IOd達4. 8cm,質地較薄，中央為 土黃色，四周近白黃色，老后菌落呈土褐色，氣生菌絲較多，背面淡黃色至黃褐色。在麥芽汁 培養基上28°C培養7d，菌落長滿整個培養皿，質地致密略呈絮狀，中央部分黃色略帶紅色， 有溝和放射紋出現。以ITS rDNA基因序列同源性為基礎構建形成包括菌株YM 311498在內的19株 相關真菌的系統發育樹，可知棘孢曲霉YM311498堿基序列相似性為100%，與本屬菌種 Aspergillus aculeatus 無差異。菌株YM 311498的培養基培養特征
①察氏培養基28°C培養7d，菌落直徑達4. 4cm,質地致密，菌落平坦，中央部分土 黃色，周圍顏色白黃色背面顏色黃色，形狀呈不規則圓形，有溝深陷培養基中。分生孢子結 構較多，初為微黃色，老后變深呈土黃褐色。②PDA培養基28°C培養7d，菌落直徑達4. 7cm, IOd達4. 8cm,質地較薄，中央為土 黃色，四周近白黃色，老后菌落呈土褐色，氣生菌絲較多，背面淡黃色至黃褐色。③麥芽汁培養基28°C培養7d，菌落長滿整個培養皿，質地致密略呈絮狀，中央部 分黃色略帶紅色，有溝和放射紋出現。菌株YM 311498的形態特征(見
圖1、圖2、圖3、圖4)①無性世代分生孢子梗長，具有足細胞；分生孢子梗頂端膨大成近球形，頂囊稍 大，半球形，約2/3表面可育，直徑10 14 μ m ；孢囊上生小梗，梗基1 2μπιΧ2 3μπι， 分生孢子頭致密直柱狀，顏色顯橙褐色，直徑90 110 μ mX 25 50 μ m ；分生孢子球形，大 小約2. 5 μ m，壁周圍長滿刺，刺長0. 4 0. 5 μ m。分生孢子梗壁在光學顯微鏡及電鏡下近平滑。②有性世代未發現。菌株YM 311498的分子生物學特征采用分子生物學PCR技術，DNA序列測定分析，YM 311498菌株ITS rDNA基因組 由543個堿基(bp)組成。以ITS rDNA序列為基礎構建的系統發育樹，該菌與Aspergillus aculeatus的進化距離最近(圖4)。菌株YM 311498的發酵培養特征①培養基PDB培養基。②培養溫度28 士 2 °C。③發酵時間5-7天。④發酵培養特征培養第1天，有零星的淡黃色菌絲點出現；培養第3天，發酵液 中出現黃色的小菌絲球；培養第5天，黃色菌絲球增多且體積增大，有少量菌絲帖壁，發酵 液顏色變為黃色；培養第7天，出現大量的菌絲球，體積也繼續增大，發酵液顏色為黃色。菌株YM 311498的發酵工藝如下菌種一活化一一級種子(PDA培養基)一培養(28士2°C，4-5天)一接種一二級種 子(PDB培養基，搖床200r/min，28士2°C，3-4天)一接種(按5%接種量)一發酵(PDB培 養基，搖床200r/min，28 士 2 °C，6-7天)一發酵物。上述發酵工藝中的發酵條件如下①發酵方式液體發酵。②種子培養基馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PDB)。馬鈴薯葡萄糖液體培養基的制備取新鮮馬鈴薯200克，去皮切成小塊，加水1升 煮沸30分鐘，過濾，濾液加水補足至1升，加入葡萄糖20克，pH自然。上述培養基中加入15克瓊脂，即為PDA培養基。③發酵培養基馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PDB)。④培養時間菌種活化培養4-5天，種子搖床培養3-4天，發酵搖床培養6-7天。⑤培養溫度種子和發酵培養溫度均為28士2°C。⑥發酵完畢，加入等體積95%乙醇浸提48小時，過濾，將濾液濃縮至干，加入無菌水制得抗菌發酵液制品。本發明所述的菌株YM311498的抗菌活性試驗1.病原指示菌見表1。表1抗菌試驗指示菌
權利要求
一種棘孢曲霉，其特征在于命名為棘孢曲霉Aspergillus aculeatusYM311498，現保藏在國家知識產權局指定的保藏單位，保藏編號為CCTCC M2010062。
2.按照權利要求1所述的棘孢曲霉，其特征是其ITSrDNA基因組由543個堿基組成， 序列如下1CtgggtccttcggggcccaacctcccacccgtgcttaccgtaccctgttgCttCggCggg61cccgccttcgggcggcccggggcctgcccccgggaccgcgcccgccggagaccccaatgg121aacactgtctgaaagcgtgcagtctgagtcgattgataccaatcagtcaaaactttcaac181aatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataactaatgtga241attgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccg301gggggcatgcctgtccgagcgtcatttctcccctccagccCCgCtggttgttgggccgcg361CCCCCCCgggggcgggcctcgagagaaacggcggcaccgtccggtcctcgagcgtatggg421gctctgtcacccgctctatgggcccggccggggcttgcctcgacccccaatcttctcaga481ttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggatt5413-CC ο
全文摘要
本發明涉及微生物技術領域，特別是涉及一種具有廣譜的高抗菌活性的微生物菌株。本發明所述的棘孢曲霉命名為棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)YM311498，現保藏在國家知識產權局認可的保藏單位，保藏編號為CCTCC NOM2010062。本發明首次從印楝植物(Azadirachta indica)中分離獲得棘孢曲霉類型的內生真菌，在明確具有廣譜抗菌活性的棘孢曲霉YM311498的微生物學地位的同時，發現該菌對5種植物病原真菌、3種人體致病真菌、2種革蘭氏陰性細菌和1種革蘭氏陽性細菌，共11種病原微生物具有比較明顯的抑制生長作用。本發明利用植物內生真菌資源，通過發酵獲得農用或醫用新型天然抗菌藥物活性成分。
文檔編號C12N1/14GK101942395SQ20101022850
公開日2011年1月12日 申請日期2010年7月16日 優先權日2010年7月16日
發明者吳少華, 苗翠蘋, 陳有為 申請人:云南省微生物研究所