專利名稱：牛肌衛星細胞的體外分離培養及誘導分化的方法
技術領域：
本發明涉及細胞的體外分離培養及誘導分化的方法。
背景技術：
骨骼肌組織中的成肌細胞是以肌衛星細胞(satellite cell, SC)的形式而存在； 實驗表明骨胳肌中的肌衛星細胞有自我更新及成肌、成骨、成脂肪等能力，亦稱之為“肌肉 干細胞”，這種細胞是向成肌細胞系定向的一種前體細胞；肌肉再生過程主要是由肌衛星細 胞來完成的；肌衛星細胞位于肌纖維的肌膜與基底膜之間，一般為小梭形扁平的單核細胞； 當肌肉組織受到刺激時如骨骼肌受損時，衛星細胞就會被激活，大量分裂、增殖并相互融合 形成再生肌纖維；激活的衛星細胞與受損傷細胞融合以修復受損傷細胞，或幾個成肌細胞 融合形成肌管，進而生成新的肌細胞。衛星細胞的激活、增殖和分化也是骨骼肌細胞肥大、 數目增多以及肌纖維轉化的重要機制。肌衛星細胞體外分離培養成為研究肌肉分化途徑及 性狀改良的分子機制的重要技術平臺，為改良家畜肌肉品質及畜牧業生產領域奠定研究基 石出。肌細胞是肌組織的前體細胞，易培養、可塑性強，具有骨骼肌的許多重要生物特 性，對于肌衛星細胞的研究成為生物組織工程中的一個熱門領域。不同年齡、不同肌肉類型 中衛星細胞的數目不同，因此取材對于肌衛星細胞的原代培養很重要；一般來說，年幼個體 的衛星細胞含量較豐富。
目前，牛肌衛星細胞的分離培養一般均選用膠原酶XI和分散酶結合的方法，但是這兩 種酶的價格較高，導致牛肌衛星細胞的體外分離培養成本較高；且采用現有技術分離培養 的牛肌衛星細胞傳代穩定性不好，僅為1 10代。肌衛星細胞誘導分化為肌肉細胞的方法 為采用DMEM高糖培養液+2%馬血清的作用細胞，誘導分化細胞分化為肌管，以研究肌肉分 化機理，對于原代培養的肌衛星細胞，用此種方法進行誘導分化，其分化后獲得的肌管數量 少，且無法獲得具有收縮功能的肌管。
發明內容
本發明目的是為了解決現有牛肌衛星細胞的分離培養存在成本高，傳代穩定性不 好，且誘導分化存在所獲肌管數量少及不具有收縮功能的問題，而提供牛肌衛星細胞的體 外分離培養及誘導分化的方法。牛肌衛星細胞的體外分離培養方法按以下步驟實現一、用D-Hanks液清洗牛 肌肉組織并剪成Imm3的小塊，然后置于含有0. 25g胰酶的D-Hanks液中，在37°C下消化 30min，再離心棄去上清，然后加入膠原酶液，在37°C下消化2 3h，得細胞懸液；二、采用 400目孔徑的篩網過濾細胞懸液，然后離心，所得細胞沉淀用D-Hanks液重懸并離心，再 用細胞生長培養液重懸細胞，然后接種于以多聚賴氨酸包被的細胞培養瓶中，采用差速貼 壁法培養細胞PPl至PP6 ；三、將pp6中的細胞培養至匯合率為95%，然后采用質量濃度為 0. 25%的胰酶進行傳代，即完成牛肌衛星細胞的體外分離培養；其中步驟一中D-Hanks液由8g 的 NaCl、0. 6g 的 Na2HPO4. 2H20、4g 的 KC1、0. 6g 的 KH2P04、3. 5g 的 NaHC03、5g 的青鏈霉素、 1. Og的兩性霉素B和IOOOmL三蒸水組成；步驟一中膠原酶液由0. 2g的膠原酶I、100ml的 DMEM高糖培養液和Ig的青鏈霉素和Ig的兩性霉素B組成；步驟二中細胞生長培養液由 70ml的DMEM高糖培養基、20ml的FBS、IOml的馬血清、Ig的青鏈霉素和Ig的兩性霉素B組 成，pH值為7. 2;步驟三中傳代的比例為1 1。牛肌衛星細胞的誘導分化方法按以下步驟實現一、采用100 μ 1的DMEM高糖培 養液對4 μ g的pEGFP-IRES-Myf6質粒和8 μ 1的PEI轉染試劑分別進行孵育5min，然后混 合并孵育15min，得PEI-質粒復合物；二、取體外分離培養的牛肌衛星細胞并培養至匯合率 為75%，棄掉培養液，用DMEM高糖培養液清洗牛肌衛星細胞兩次，然后補加1. 8ml的DMEM高 糖培養液，再將PEI-質粒復合物逐滴滴加到牛肌衛星細胞表面并作用4h，然后更換為細胞 生長培養液A培養24h，再更換為細胞生長培養液B，在溫度為37°C并裝有5%C02的培養箱中 誘導分化48 72h，即完成牛肌衛星細胞的誘導分化；步驟二中細胞生長培養液A由70ml 的DMEM高糖培養基、20ml的FBSUOml的馬血清、Ig的青鏈霉素和Ig的兩性霉素B組成， pH值為7. 2 ；步驟二中細胞生長培養液B由98ml的DMEM高糖培養液、2ml的馬血清組成， pH值為7. 2。本發明體外分離培養中采用D-Hanks液配制胰蛋白酶和膠原酶I，可以避免細胞 培養過程中的污染問題，同時此操作獲得的細胞懸液非常有利于通過篩網進行快速過濾以 去除未消化的組織塊，避免粘稠的細胞消化混合物堵塞篩網；在差速貼壁法培養細胞的過 程中，每一步的轉瓶培養之前均進行了離心，能夠提高肌衛星細胞的純度；本發明選用了價 格低廉的胰蛋白酶和膠原酶I，通過延長膠原酶I的消化時間結合400目篩網網孔過濾得 方法從新生胎牛的肌肉組織中分離衛星細胞，采用差速貼壁法對衛星細胞進行純化，分離 培養的牛肌衛星細胞形態均一，增殖活力強，在分化誘導后具有融合成肌管得能力。本發明 牛肌衛星細胞的體外培養方法不但操作簡便，而且大大節省了培養成本，具有一定的經濟 意義，且可以獲得大量傳代穩定性好的細胞。牛肌衛星細胞的體外培養可以為探索肌肉分 化途徑的分子機制及改善肌肉性狀的轉基因動物生產提供豐富的細胞來源，具有一定的理 論和應用價值。本發明牛肌衛星細胞的誘導分化中，操作方法簡單，通過將pEGFP-IRES_Myf6質 粒轉染入牛肌衛星細胞，同時結合細胞生長培養液B的作用，從而極大的提升了其分化為 肌管的能力，誘導分化的肌管數量眾多，數量眾多的肌管可自發融合為更粗的肌管，并發生 功能性的收縮，同時證明了肌衛星細胞的干細胞及分化特性，且成功誘導牛肌衛星細胞分 化為功能性肌管的方法，從而為研究肌肉分化機理提供良好的理論支持和技術平臺。
圖1為具體實施方式
一中所得牛肌衛星細胞放大40倍的顯微鏡圖；圖2為具體實 施方式一中所得牛肌衛星細胞放大100倍的顯微鏡圖；圖3為具體實施方式
一中所得牛肌 衛星細胞放大200倍的顯微鏡圖；圖4為具體實施方式
一中所得牛肌衛星細胞放大400倍 的經Desmin作用的免疫熒光細胞染色圖；圖5為具體實施方式
一中所得牛肌衛星細胞放大 400倍的經CD34作用的免疫熒光細胞染色圖；圖6為具體實施方式
一中所得牛肌衛星細胞 放大400倍的經Sca-I作用的免疫熒光細胞染色圖；圖7為具體實施方式
六中牛肌衛星細
4胞在誘導分化進行24 48h時的放大40倍的顯微鏡圖；圖8為具體實施方式
六中牛肌衛 星細胞在誘導分化進行24 48h時的放大200倍的顯微鏡圖；圖9為具體實施方式
六中牛 肌衛星細胞在誘導分化進行24 48h時的放大200倍的顯微鏡圖；圖10為具體實施方式
六中牛肌衛星細胞在誘導分化進行48h后的放大40倍的顯微鏡圖；圖11為具體實施方式
六中牛肌衛星細胞在誘導分化進行48h后的放大40倍的顯微鏡圖；圖12為具體實施方式
六中牛肌衛星細胞在誘導分化進行48h后的放大200倍的顯微鏡圖；圖13為具體實施方 式六中誘導分化后所得牛肌衛星細胞放大40倍的經Desmin作用的免疫熒光細胞染色圖； 圖14為具體實施方式
六中誘導分化后所得牛肌衛星細胞放大40倍的經CD34作用的免疫 熒光細胞染色圖；圖15為具體實施方式
六中誘導分化后所得牛肌衛星細胞放大40倍的經 Sca-I作用的免疫熒光細胞染色圖。
具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的 任意組合。
具體實施方式
一本實施方式牛肌衛星細胞的體外分離培養方法按以下步驟實 現一、用D-HankS液清洗牛肌肉組織并剪成Imm3的小塊，然后置于含有0. 25g胰酶的 D-Hanks液中，在37°C下消化30min，再離心棄去上清，然后加入膠原酶液，在37°C下消化 2 3h，得細胞懸液；二、采用400目孔徑的篩網過濾細胞懸液，然后離心，所得細胞沉淀用 D-Hanks液重懸并離心，再用細胞生長培養液重懸細胞，然后接種于以多聚賴氨酸包被的 細胞培養瓶中，采用差速貼壁法培養細胞PPl至PP6 ；三、將pp6中的細胞培養至匯合率為 95%，然后采用質量濃度為0. 25%的胰酶進行傳代，即完成牛肌衛星細胞的體外分離培養； 其中步驟一中 D-Hanks 液由 8g 的 NaCl、0. 6g 的 Na2HPO4. 2H20、4g 的 KC1、0. 6g 的 KH2P04、3. 5g 的NaHC03、5g的青鏈霉素、1. Og的兩性霉素B和IOOOmL三蒸水組成；步驟一中膠原酶液由 0. 2g的膠原酶I、100ml的DMEM高糖培養液和Ig的青鏈霉素和Ig的兩性霉素B組成；步 驟二中細胞生長培養液由70ml的DMEM高糖培養基、20ml的FBSUOml的馬血清、Ig的青鏈 霉素和Ig的兩性霉素B組成，pH值為7. 2;步驟三中傳代的比例為1 1。本實施方式中FBS和DMEM高糖培養液購買自Gibco公司；多聚賴氨酸和膠原酶I 購買自Sigma公司。本實施方式步驟一中牛肌肉組織來源于健康的新生胎牛的骨骼肌組織。本實施方式步驟一中消化的目的是使結締組織充分消化。本實施方式步驟一中膠原酶液的作用是去除細胞間的膠原蛋白成分，使細胞分散 為單個細胞。本實施方式步驟二中篩網過濾細胞懸液的目的是去除未消化的組織塊。本實施方式步驟二中差速貼壁法培養細胞ppl至pp6的培養的過程中，每一次轉 瓶之前均以lOOOr/min離心5min并收集細胞，然后采用D-Hanks液對細胞沉淀進行清洗， 再以lOOOr/min離心5min后用細胞生長培養液重懸細胞并接種；上述這種反復清洗可以避 免細胞污染，同時提高肌衛星細胞的純度。本實施方式步驟二中采用差速貼壁法培養細胞的目的是純化肌衛星細胞，排除其 他細胞對肌衛星細胞生長的影響；過程為接種于以多聚賴氨酸包被的細胞培養瓶中的細胞培養2h，貼壁細胞為ppl ；未貼壁細胞懸液轉瓶培養24h，貼壁的細胞為pp2 ；未貼壁細胞 懸液再轉瓶培養24h，貼壁的細胞為pp3 ；未貼壁細胞懸液轉瓶培養24h，貼壁的細胞為pp4 ； 未貼壁細胞懸液轉瓶培養24h，貼壁細胞為pp5 ；未貼壁細胞懸液轉瓶培養24h，貼壁細胞為 pp60本實施方式可獲得高純度(純度達96 99%)、可持續傳代且穩定性好的牛肌衛星 細胞。本實施方式中體外分離培養所得牛肌衛星細胞，通過相差顯微鏡觀察，由圖1、圖 2和圖3中，可知，牛肌衛星細胞在pp6轉瓶培養后約48h后呈貼壁生長，絕大多數細胞為梭 形，少數有突起，為不規則狀，細胞間的連接緊密；本實施方式中體外分離培養的牛肌衛星 細胞形態完整，折光率好，且保持較強的增殖活力，24h即可傳代1次。本實施方式中體外分離培養所得牛肌衛星細胞在細胞生長培養液中能夠保持較 好的增殖活力。本實施方式中體外分離培養所得牛肌衛星細胞，應用免疫熒光細胞染色法進行檢 測取普通潔凈的蓋玻片，接種細胞，制作肌衛星細胞爬片；待細胞長成80%匯合單層時， 倒掉培養液，用預冷的D-Hanks液沖洗細胞兩次；用冰浴的Iml甲醇于4°C固定IOmin ；用 TBSTx沖洗細胞3次，每次5min ；用含5%BSA的TBSTx封閉60min，可以用搖床輕輕搖動；去 封閉液，用含5%BSA的TBSTx稀釋的特定一抗(分別為Desmin、CD34、Sca-l)作用60min ；去 除一抗，用TBSTx沖洗細胞3次，每次5min ；用含5%BSA的TBSTx稀釋的特定二抗(FITC標 記，可與特異性的一抗結合)作用60min ；去除二抗，用TBSTx沖洗細胞3次，每次5min ；滴加 DAPI (細胞核熒光染料)，染色5min后，用TBSTx沖洗細胞3次，每次5min ；采用抗熒光淬滅 劑DABCO (防熒光淬滅封片劑)封片，于激光掃描共聚焦顯微鏡下分別觀察細胞中Desmin、 ⑶34、Sca-I的特異性表達情況；
結果如圖4、圖5和圖6所示，Desmin呈陽性表明此細胞為肌肉來源的細胞，而⑶34和 Sca-I呈陽性表達表明此細胞為具有干細胞性質的衛星細胞，證明本實施方式中體外分離 培養所得牛肌衛星細胞為具有干細胞特性的肌衛星細胞。本實施方式中Desmin (結蛋白)一抗、⑶34 —抗、Sca-I 一抗購買自博奧森公司； 特定二抗購買自中杉金橋公司；DAPI購買自碧云天公司；DABCO購買自Sigma公司。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一和二中離心均是 以lOOOr/min的轉速離心5min。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中加入膠原酶 液，在37°C下消化2h，得細胞懸液。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中加入膠原酶 液，在37°C下消化3h，得細胞懸液。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中加入膠原酶 液，在37°C下消化2.5h，得細胞懸液。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
六本實施方式牛肌衛星細胞的誘導分化方法按以下步驟實現 一、采用100 μ 1的DMEM高糖培養液對4 μ g的pEGFP-IRES_Myf6質粒和8 μ 1的PEI轉染 試劑分別進行孵育5min，然后混合并孵育15min，得PEI-質粒復合物；二、取體外分離培養 的牛肌衛星細胞并培養至匯合率為75%，棄掉培養液，用DMEM高糖培養液清洗牛肌衛星細胞兩次，然后補加1. 8ml的DMEM高糖培養液，再將PEI-質粒復合物逐滴滴加到牛肌衛星細胞表面并作用4h，然后更換為細胞生長培養液A培養24h，再更換為細胞生長培養液B，在溫 度為37°C并裝有5%C02的培養箱中誘導分化48 72h，即完成牛肌衛星細胞的誘導分化；步 驟二中細胞生長培養液A由70ml的DMEM高糖培養基、20ml的FBSUOml的馬血清、Ig的青 鏈霉素和Ig的兩性霉素B組成，pH值為7. 2 ；步驟二中細胞生長培養液B由98ml的DMEM 高糖培養液、2ml的馬血清組成，pH值為7. 2。本實施方式中pEGFP-IRES_Myf6質粒為購買得到；PEI轉染試劑購買自Sigma公司。本實施方式步驟二滴加過程中要輕晃細胞培養板。本實施方式中牛肌衛星細胞在誘導分化進行24 48h時，由圖7、圖8和圖9可觀 察到相鄰的衛星細胞可以自發融合形成肌管，表明具體實施方式
一中體外分離培養所得牛 肌衛星細胞具有分化為肌細胞的潛能。本實施方式中牛肌衛星細胞在誘導分化進行48h后，由圖10、圖11和圖12可觀察 到相鄰的衛星細胞可以自發融合形成大量的肌管，數量眾多的肌管可自發融合為更粗的肌 管；誘導分化進行至72h，融合率達到頂峰，之后融合率變化不明顯；其肌管形態區別于僅 用DMEM高糖培養液+2%馬血清誘導分化形成的肌管，且在肌管形成數量上具有明顯優勢。本實施方式中誘導分化后所得牛肌衛星細胞，應用免疫熒光細胞染色法進行檢 測由圖13、圖14和圖15中可見，誘導分化后的肌管其Desmin、⑶34和Sca-I呈陽性表達， 保持了其由干細胞分化而來的特性；且分化后的肌管可發生功能性收縮；本實施方式中通 過對體外分離培養的牛肌衛星細胞進行Myf6基因的轉染，證明了牛肌衛星細胞的干細胞 及分化特性，且得到了成功誘導牛肌衛星細胞分化為功能性肌管的方法，從而為研究肌肉 分化機理提供良好的理論支持和技術平臺。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中在溫度為 37°C并裝有5%C02的培養箱中誘導分化48h。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中在溫度為 37°C并裝有5%C02的培養箱中誘導分化72h。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中在溫度為 37°C并裝有5%C02的培養箱中誘導分化50 70h。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中在溫度為 37°C并裝有5%C02的培養箱中誘導分化60h。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
權利要求
牛肌衛星細胞的體外分離培養方法，其特征在于牛肌衛星細胞的體外分離培養方法按以下步驟實現一、用D-Hanks液清洗牛肌肉組織并剪成1mm3的小塊，然后置于含有0.25g胰酶的D-Hanks液中，在37℃下消化30min，再離心棄去上清，然后加入膠原酶液，在37℃下消化2～3h，得細胞懸液；二、采用400目孔徑的篩網過濾細胞懸液，然后離心，所得細胞沉淀用D-Hanks液重懸并離心，再用細胞生長培養液重懸細胞，然后接種于以多聚賴氨酸包被的細胞培養瓶中，采用差速貼壁法培養細胞ppl至pp6；三、將pp6中的細胞培養至匯合率為95%，然后采用質量濃度為0.25%的胰酶進行傳代，即完成牛肌衛星細胞的體外分離培養；其中步驟一中D-Hanks液由8g的NaCl、0.6g的Na2HPO4.2H2O、4g的KCl、0.6g的KH2PO4、3.5g的NaHCO3、5g的青鏈霉素、1.0g的兩性霉素B和1000mL三蒸水組成；步驟一中膠原酶液由0.2g的膠原酶Ⅰ、100ml的DMEM高糖培養液和1g的青鏈霉素和1g的兩性霉素B組成；步驟二中細胞生長培養液由70ml的DMEM高糖培養基、20ml的FBS、10ml的馬血清、1g的青鏈霉素和1g的兩性霉素B組成，pH值為7.2；步驟三中傳代的比例為1∶1。
2.根據權利要求1所述的牛肌衛星細胞的體外分離培養方法，其特征在于步驟一中加 入膠原酶液，在37°C下消化2. 5h，得細胞懸液。
3.誘導分化權利要求1所述方法培養的牛肌衛星細胞，其特征在于牛肌衛星細 胞的誘導分化方法按以下步驟實現一、采用ΙΟΟμΙ的DMEM高糖培養液對4yg的 pEGFP-IRES-Myf6質粒和8 μ 1的PEI轉染試劑分別進行孵育5min，然后混合并孵育15min， 得PEI-質粒復合物；二、取體外分離培養的牛肌衛星細胞并培養至匯合率為75%，棄掉培養 液，用DMEM高糖培養液清洗牛肌衛星細胞兩次，然后補加1. 8ml的DMEM高糖培養液，再將 PEI-質粒復合物逐滴滴加到牛肌衛星細胞表面并作用4h，然后更換為細胞生長培養液A培 養24h，再更換為細胞生長培養液B，在溫度為37°C并裝有5%C02的培養箱中誘導分化48 72h，即完成牛肌衛星細胞的誘導分化；步驟二中細胞生長培養液A由70ml的DMEM高糖培 養基、20ml的FBSUOml的馬血清、Ig的青鏈霉素和Ig的兩性霉素B組成，pH值為7. 2 ；步 驟二中細胞生長培養液B由98ml的DMEM高糖培養液、2ml的馬血清組成，pH值為7. 2。
4.根據權利要求3所述的牛肌衛星細胞的誘導分化方法，其特征在于在溫度為37°C并 裝有5%C02的培養箱中誘導分化50 70h。
5.根據權利要求3所述的牛肌衛星細胞的誘導分化方法，其特征在于在溫度為37°C并 裝有5%C02的培養箱中誘導分化60h。
全文摘要
牛肌衛星細胞的體外分離培養及誘導分化的方法，它涉及細胞的體外分離培養及誘導分化的方法。它解決了現有牛肌衛星細胞的分離培養存在成本高，傳代穩定性不好，且誘導分化存在所獲肌管數量少及不具有收縮功能的問題。方法清洗組織，用胰蛋白酶和膠原酶液消化；過濾后離心，重懸細胞，接種后用差速貼壁法培養細胞；培養至匯合率為95%，用胰酶進行傳代即完成。方法獲得PEI-質粒復合物；牛肌衛星細胞培養至匯合率為75%，清洗后加DMEM高糖培養液，將PEI-質粒復合物加到細胞表面，更換培養液A培養，再更換培養B誘導分化即完成。本發明牛肌衛星細胞的分離培養成本低，傳代穩定性好，誘導分化所獲肌管數量大且具有收縮功能。
文檔編號C12N5/10GK101886060SQ20101023136
公開日2010年11月17日 申請日期2010年7月20日 優先權日2010年7月20日
發明者嚴云勤, 佟慧麗, 興孝友, 李光鵬, 李樹峰, 金慧然, 陸黎敏, 高學軍 申請人:東北農業大學