專利名稱：Wistar大鼠胃腸ICC的分離培養方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域，特別是一種Wistar大鼠胃腸Cajal間質細胞(簡稱ICC)分離培養方法。
背景技術：
一百多年前，西班牙科學家Cajal首先在胃腸道中發現一類小的梭形或星形細胞，并對其進行了詳細描述，這些細胞具有明顯的核及多個突起，細胞間突起相互連接形成網絡，后來該細胞被命名為Cajal間質細胞(interstitial cells of Cajal，簡稱ICC)。ICC是胃腸道神經系統的一種非神經但與神經有關的特殊類型的間質細胞。研究表明，ICC在控制胃腸道運動中起著重要的作用，是胃腸慢波活動的起搏器和傳導者。近十年來，ICC的作用逐漸被闡明。其功能主要有三個①胃腸道慢波活動的起搏細胞；②有利于推進胃腸電活動的傳播；③介導神經遞質。ICC還具有產生一氧化氮(nitric oxide，NO)和放大抑制性神經遞質等作用。胃腸道的正常運動依賴于腸神經系統(enteric nervous system，ENS)、平滑肌細胞和ICC。模型動物或人類ICC缺乏或分布異常可引起多種胃腸運動障礙性疾病。關于ICC起搏電流發生的確切機制尚存在不少爭議。不同類型ICC的確切功能及它們之間的相互聯系，ICC對體內胃腸電活動和胃腸運動的影響尚不明確。目前體內、體外胃腸起搏尚處實驗階段，有待進一步探索治療胃電節律紊亂綜合癥，如胃輕癱、假性腸梗阻等胃腸功能紊亂等疾病的新方法。胃腸道具有消化食物、吸收營養等功能，人體能量的攝取有賴于胃腸道的運動、消化和吸收功能。胃腸道運動功能的好壞直接影響著人體的健康和疾病的康復。Cajal間質細胞對胃腸道運動的調節作用越來越受到人們的重視。ICC缺少或功能異常是否一定會引起臨床一系列癥狀？ICC的減少是原發或繼發？是持久性或一過性？什么因素可以引起ICC減少？ICC的異常分布可能是診斷疾病的一個有用指標。胃腸起搏和藥物干擾ICC的異常功能可能為胃腸運動功能障礙疾病的治療提供新的手段。ICC研究已成為當今消化病學的一個熱點。急需采用簡單易行的ICC分離和培養技術，為ICC的研究提供一個可靠的手段。目前國內外常用Balb/c小鼠來分離培養ICC，這種小鼠生活條件要求較高，分離和培養技術亦較復雜，嚴重制約了ICC的研究。
發明內容
本發明的目的在于，在成功分離Wistar大鼠胃腸平滑肌細胞的基礎上，通過技術改進建立Wistar大鼠胃腸ICC的分離培養方法，以達到利用Wistar大鼠大量培養、分離ICC的目的。
本發明解決其技術問題所采用的技術方案是提供一種Wistar大鼠胃腸ICC的分離培養方法，是從Wistar大鼠胃腸組織中分離Cajal間質細胞；本方法主要包括四個步驟a.Wistar大鼠胃腸肌肉組織塊的制備；b.胃腸ICC的酶解、分離和培養；c.ICC的c-Kit免疫熒光標記；d.采用倒置顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像，對分離培養的細胞進行確認；其具體方法為a.胃腸肌肉組織標本采集取Wistar大鼠胃、小腸或者結腸置于冷KRB液(Krebs-Ringer bicarbonate solutionNa+137.4mMOL，K+5.9mMOL，Ca2+2.5mMOL，Mg2+1.2mMOL，Cl-134mMOL，HCO3-15.5mMOL，H2PO4-1.2mMOL，葡萄糖11.5mMOL，37.5±0.5℃，pH7.3-7.4，97％O2-3％CO2冒泡)中。小心去除系膜，沿小彎緣剪開胃腸，并洗凈內容物后，釘固于蠟板上，銳性去除粘膜和粘膜下層，然后將分離出的肌肉組織剪成約1-2mm3小塊；b.胃腸ICC的酶解、分離和培養將新鮮分離的肌條小塊在酶解液中37℃孵育60分鐘，酶解液組成為DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，)中含有1.0mg/ml II型膠原酶(Sigma公司，USA)，并輕微攪拌，30分鐘后更換一次酶解液，吸出的上清酶液置于離心管內4℃保存；酶解消化結束后，將組織和前面的上清液一同經過100目篩網過濾，收集濾液，1000轉/分離心10分鐘；棄上清，加入含20％胎牛血清的SMGM(Smooth Muscle GrowthMedium)，吹打沉淀，使細胞懸浮，混懸液置于培養瓶中，37℃貼壁1小時后，再加入含20％胎牛血清的SMGM、2％抗菌素(含有青霉素G鈉200IU/ml，硫酸鏈霉素200mg/ml，兩性霉素B 0.5mg/ml)、2mMOL/L谷氨酰氨、5ng/ml干細胞因子(stem cell factor from mouse，SCF)，吹打均勻，輕輕吸取出上清，平均加到帶有圓形蓋玻片的無菌六孔培養板中，在37℃、5％CO2培養箱中孵育48小時后，培養基換為含有SCF的SMGM，并加入2％抗菌素和2mMOL/L谷氨酰氨，培養基隔日更換；c.ICC的c-Kit免疫熒光標記取貼壁良好的細胞玻片，棄去培養基，用4％多聚甲醛(PBS稀釋)溶液，于4℃固定30分鐘后，標本在PBS液(0.01M、 pH7.4)中分三次沖洗共45分鐘(3×15分鐘)，然后在含10％(w/v)山羊血清的PBS液中室溫孵育60分鐘，以減少非特異性抗體的結合；標本中加入兔抗大鼠c-Kit蛋白多克隆IgG抗體(c-19，Santa Cruz，Biotech，California，USA，1∶200，PBS稀釋)于37℃溫箱孵育一小時，并在4℃冰箱孵育過夜后，用PBS液分三次沖洗共15分鐘(3×5分鐘)，加入次級抗體FITC結合山羊抗兔IgG抗體(1∶50，PBS稀釋)于37℃溫箱避光孵育60分鐘；陰性對照不加一抗，只用PBS，余操作步驟相同d.采用倒置顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像，對分離培養的細胞進行確認。
本發明所提供的Wistar大鼠胃腸Cajal間質細胞(ICC)的分離培養方法，選用很容易得到的Wistar大鼠，飼養容易，無須特殊生活條件，而且采用普通酶解法分離ICC，方法簡單、易操作。ICC的培養不僅無須特殊設備和制劑，而且在顯微鏡下觀察確認ICC的分離、培養過程時，特征明顯，圖象清晰，形態穩定。這種簡單易行的ICC分離和培養技術可為ICC的研究提供一個可靠的保證。
下面結合實施例和附圖對本發明作進一步說明。
圖1.為培養3天后的ICC形態圖(×200)。
圖2.為培養5天后的ICC形態圖(×100)。
圖3.為培養7天后的ICC形態圖(×100)。
圖4.為培養9天后的ICC形態圖(×200)。
圖5.為培養9天后經c-Kit染色陽性的ICC形態圖(×200)。
圖6.為普通光鏡下培養9天后ICC的形態圖(×200)。
具體實施例方式
實施例1.a.胃腸肌肉組織標本采集取Wistar大鼠胃、小腸或者結腸置于冷KRB液(Krebs-Ringer bicarbonate solution(mMOL)Na+137.4，K+5.9，Ca2+2.5，Mg2+1.2，Cl-134，HCO3-15.5，H2PO4-1.2，葡萄糖11.5，37.5±0.5℃，pH7.3-7.4，97％O2-3％CO2冒泡)中。小心去除系膜，沿小彎緣剪開胃腸，并洗凈內容物后釘固于蠟板上，銳性去除粘膜和粘膜下層，然后將分離出的肌肉組織剪成約1-2mm3小塊；b.胃腸ICC的酶解、分離和培養將新鮮分離的肌條小塊在酶解液中37℃孵育60分鐘，其中酶解液組成為DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，)，1.0mg/ml II型膠原酶。30分鐘后更換一次酶解液，吸出的上清酶液置于離心管內4℃保存；酶解消化結束后，將組織和前面的上清液一同經過100目篩網過濾，收集濾液，1000轉/分離心10分鐘，棄上清，加入含20％胎牛血清的SMGM(Smooth MuscleGrowth Medium)，吹打沉淀，使細胞懸浮；混懸液置于培養瓶中，37℃貼壁1小時后，再加入含20％胎牛血清的SMGM、2％抗菌素、2mMOL/L谷氨酰氨、5ng/ml SCF(stem cell factor from mouse)，吹打均勻，輕輕吸取出上清，平均加到帶有圓形蓋玻片的無菌六孔培養板中，在37℃、5％CO2培養箱中孵育48小時后，培養基換為含有SCF的SMGM，并加入2％抗菌素和2mMOL/L谷氨酰氨，培養基隔日更換。其中2％抗菌素組成為青霉素G鈉200IU/ml，硫酸鏈霉素200mg/ml，兩性霉素B 0.5mg/ml。c.ICC的c-Kit免疫熒光標記取貼壁良好的細胞玻片，棄去培養基，用4％多聚甲醛(PBS稀釋)溶液4℃固定30分鐘后，標本在PBS液(0.01M、 pH7.4)中分三次沖洗共45分鐘(3×15分鐘)，然后在含10％(w/v)山羊血清的PBS液中室溫孵育60分鐘，以減少非特異性抗體的結合；標本中加入兔抗大鼠c-Kit蛋白多克隆IgG抗體(c-19，Santa Cruz，Biotech，California，USA，1∶200，PBS稀釋)于37℃溫箱孵育一小時，并在4℃冰箱孵育過夜后，用PBS液分三次沖洗共15分鐘(3×5分鐘)，加入次級抗體FITC結合山羊抗兔IgG抗體(1∶50，PBS稀釋)于37℃溫箱避光孵育60分鐘；陰性對照不加一抗，只用PBS，余操作步驟相同d.采用倒置顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像，對分離培養的細胞進行確認。
從圖1可以看出培養3天后的ICC(×200)，細胞胞體呈三角形，突起伸展；從圖2可以看出培養5天后的ICC(×100)，細胞突起伸出，周圍有平滑肌細胞；從圖3可以看出培養7天后的ICC(×100)，細胞突起向不同方向伸出，相鄰ICC突起間有連接；從圖4可以看出培養9天后的ICC(×200)，細胞突起向各方向伸出，與相鄰ICC突起及鄰近平滑肌細胞間有連接；從圖5、6也可以看出培養9天后ICC細胞間相互聯系，突起交織，呈網絡狀。說明Cajal間質細胞(ICC)的分離、培養效果達到預期的效果。
權利要求
1.一種Wistar大鼠胃腸Cajal間質細胞(簡稱ICC)的分離培養方法，其特征是從Wistar大鼠胃腸組織中分離、培養Cajal間質細胞；本方法主要包括四個步驟a.Wistar大鼠胃腸肌肉組織塊的制備；b.胃腸ICC的酶解、分離和培養；c.ICC的c-Kit免疫熒光標記；d.采用倒置顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像，對分離培養的細胞進行確認。
2.根據權利要求1所述的Cajal間質細胞的分離培養方法，其特征在于具體分離培養方法為a.胃腸肌肉組織標本采集取Wistar大鼠胃、小腸或結腸置于冷KRB液(Krebs-Ringer bicarbonate solutionNa+137.4mMOL，K+5.9mMOL，Ca2+2.5mMOL，Mg2+1.2mMOL，Cl-134mMOL，HCO3-15.5mMOL，H2PO4-1.2mMOL，葡萄糖11.5mMOL，37.5±0.5℃，pH7.3-7.4，97％O2-3％CO2冒泡)中。小心去除系膜，沿小彎緣剪開胃腸，并洗凈內容物后，釘固于蠟板上，銳性去除粘膜和粘膜下層，然后將分離出的肌肉組織剪成約1-2mm3小塊；b.胃腸ICC的酶解、分離和培養將新鮮分離的肌條小塊在酶解液中37℃孵育60分鐘，酶解液組成為DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’smedium，)中含有1.0mg/ml II型膠原酶(Sigma公司，USA)，并輕微攪拌，30分鐘后更換一次酶解液，吸出的上清酶液置于離心管內4℃保存；酶解消化結束后，將組織和前面的上清液一同經過100目篩網過濾，收集濾液，1000轉/分離心10分鐘；棄上清，加入含20％胎牛血清的SMGM(Smooth MuscleGrowth Medium)，吹打沉淀，使細胞懸浮，混懸液置于培養瓶中，37℃貼壁1小時后，再加入含20％胎牛血清的SMGM、2％抗菌素(含有青霉素G鈉200IU/ml，硫酸鏈霉素200mg/ml，兩性霉素B 0.5mg/ml)、2mMOL/L谷氨酰氨、5ng/ml干細胞因子(stem cell factor from mouse，SCF)，吹打均勻，輕輕吸取出上清，平均加到帶有圓形蓋玻片的無菌六孔培養板中，在37℃、5％CO2培養箱中孵育48小時后，培養基換為含有SCF的SMGM，并加入2％抗菌素和2mMOL/L谷氨酰氨，培養基隔日更換；c.ICC的c-Kit免疫熒光標記取貼壁良好的細胞玻片，棄去培養基，用4％多聚甲醛(PBS稀釋)溶液，于4℃固定30分鐘后，標本在PBS液(0.01M、pH7.4)中分三次沖洗共45分鐘(3×15分鐘)，然后在含10％(w/v)山羊血清的PBS液中室溫孵育60分鐘，以減少非特異性抗體的結合；標本中加入兔抗大鼠c-Kit蛋白多克隆IgG抗體(c-19，Santa Cruz，Biotech，California，USA，1∶200，PBS稀釋)于37℃溫箱孵育一小時，并在4℃冰箱孵育過夜后，用PBS液分三次沖洗共15分鐘(3×5分鐘)，加入次級抗體FITC結合山羊抗兔IgG抗體(1∶50，PBS稀釋)于37℃溫箱避光孵育60分鐘；陰性對照不加一抗，只用PBS，余操作步驟相同；d.采用倒置顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像，對分離培養的細胞進行確認。
全文摘要
一種利用Wistar大鼠，分離培養胃腸Cajal間質細胞(簡稱ICC)的方法，包括四個步驟a.Wistar大鼠胃腸肌肉組織塊的制備；b.胃腸ICC的酶解、分離和培養；c.ICC的c－Kit免疫熒光標記；d.采用倒置顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像，對分離培養的細胞進行確認。具有以下特點①選用Wistar大鼠易得到，易飼養；②采用普通酶解法分離ICC，方法簡單；③ICC的培養無須特殊設備和制劑；④分離、培養的ICC特征明顯，圖象清晰，形態穩定。
文檔編號C12N5/06GK1587389SQ200410056118
公開日2005年3月2日 申請日期2004年8月12日 優先權日2004年8月12日
發明者齊清會, 劉勇 申請人:大連醫科大學附屬第一醫院