專利名稱：一種發酵型健腸乳酪/粉的制造方法及其所應用的干酪乳桿菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種發酵型健腸乳酪/粉的制造方法及其所應用的干酪乳桿菌。
背景技術：
目前在乳酪/粉中，主要是以單一菌株或以數株乳桿菌發酵為主，還未見同時使用乳桿菌和雙歧桿菌進行發酵的產品，這些乳酪/粉中活菌含量太低，再加上含乳飲料國家標準設定的下限值較低，一般均在105個/毫升以下，它所使用菌株的功能性，均以一般益生菌所固有的改善腸內菌群和提高免疫力為主要健康聲稱，還未見降低牛奶蛋白抗原性的菌株。
發明內容
本發明提供了一種發酵型健腸乳酪/粉的制造方法及其所應用的干酪乳桿菌，它不但可以存活狀態到達小腸，這樣可以改善腸內菌群和提高免疫力的功效，能夠降解牛奶中抗原性以及蛋白質的抗原性，減少牛奶中容易引起過敏性抗原蛋白質含量。本發明采用了以下技術方案一種干酪乳桿菌Lactobacillus CaSeiJY68，其保藏號為 CGMCC No :3567ο本發明公開了一種發酵型健腸乳酪/粉的制造方法，它包括以下步驟步驟一，準備干酪乳桿菌 Lactobacillus casei JY68 和短雙歧桿菌 Bifidobacterium breve QQ12 菌株；步驟二，將干酪乳桿菌Lactobacilluscasei JY68的菌株培養液單獨或與干酪乳桿菌干酪亞種一起接種到MRS培養基中在恒溫下進行發酵，將短雙歧桿菌Bifidobacterium breve QQ12菌株接種到TOS培養基中發酵；步驟三，然后將步驟二中發酵后的兩種菌株冷卻，冷卻后進行離心分離，收集菌體；步驟四，在菌體內添加凍干保護劑，然后在低溫下預凍，然后冷凍干燥制得發酵型健腸乳酪/粉，最后進行包裝。本發明步驟二中的干酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的菌株培養液單獨或與干酪乳桿菌干酪亞種一起在MRS培養基中進行發酵的恒定溫度為37°C，發酵的時間為M 小時。本發明步驟二中的短雙歧桿菌BifidcAacteriumbreve QQ12菌株在TOS培養基中發酵的恒定溫度為37°C，發酵的時間為M小時。本發明步驟三中兩種菌株的冷卻溫度小于或等于4°C，離心分離時的離心速度為 6000rpm，離心時間為20min。本發明步驟四中凍干保護劑的成分為脫脂乳40% -50%、乳清粉10% -20%, Vc2% -5%、乳糖2% -5%。。本發明步驟四中預凍的溫度為_80°C，預凍的時間為2-4小時。本發明具有以下有益效果本發明的發酵型健腸乳酪/粉中含有干酪乳桿菌 Lactobacillus casei JY68和干酪乳桿菌干酪亞種，干酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68不但可以存活狀態到達小腸，這樣可以改善腸內菌群和提高免疫力的功效，而且具有很高的耐酸性，強繁殖性，并且能夠降解牛奶中抗原性以及蛋白質的抗原性，減少牛奶中容易引起過敏性抗原蛋白質含量，另外熱量降低一半，保持爽口不膩的口感，滿足了糖尿病患者或渴望低熱量食品的消費者的需求，在保質期內的活菌數能維持在108CFU/毫升以上， 大大高于現在市場上的商品含量，益生菌在保質期內能保持活菌數在108CFU/毫升以上的高數量級并且能以存活狀態到達腸內。
圖1為本發明的利用MEGA3. 1生物學軟件構建的系統發育樹
具體實施例方式本發明為一種干酪乳桿菌，分類名稱為干酪乳桿菌Lactobacilluscasei，參據的生物材料(株)JY68，該菌種保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101， 其保藏編號為CGMCC No. 3567，保藏日期為2010年1月12日，結果是存活。干酪乳桿菌 Lactobacillus caseiJY68的菌株發酵后的產品其抗原價能減低到發酵前的1/1000，它是通過以下實驗制得的一、乳酸菌株蛋白酶活性和肽酶活性試驗首先從日本購買4個菌株 lactobacillus casei subsp. casei L—14, Streptococcus lactissubsp. cremoris H—61, Streptococcus lactis subsp. Iactis 527 ；Streptococcus thermophilus 510 ；又從 Hansen 公司購買的 4 個菌株 Lactobacillus bulgaricus C2, lactobacillus helveticus Cl, lactobacilluslactis Cl, Streptococcus thermophilus Cl ；以及分離自新疆傳統發酵乳的 2 個菌株Lactobacillus casei JY68, Streptococcus diacetylactis Fl 菌株的蛋白酶活性和肽酶活性使用Forin法進行了測定。以對Glu-pNA等8種合成基質及酪蛋白的分解程度作為活性判斷指標，發現Lactobacillus casei JY68和Sti^ptococcus diacetylactis Fl菌株有較大的蛋白酶活性和肽酶活性。二、降低β乳球蛋白抗原性試驗接著將蛋白酶活性和肽酶活性較高的兩個菌株接種至10%的滅菌脫脂乳中，對培養液中β乳球蛋白的抗原性利用ELISA法進行測試。酵液脫苦效果的感官評價試驗。三、然后將具有β乳球蛋白抗原性低減效果的2個菌株lactobacilluscasei JY68, Streptococcus diacetylactis Fl添加到10%脫脂乳蛋白酶水解液中，以0. 04%咖啡因的苦度為對照，對其脫苦效果進行了感官評價試驗。通過以上試驗，優選出不但具有較強的蛋白酶和肽酶活性，而且可以降低β乳球蛋白抗原性以及其發酵液不呈現苦味的干酪乳桿菌 Lactobacillus caseiJY68 菌株。干酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的分離方法以新疆采取的傳統發酵乳分離樣品，取ImL上述樣品放入滅菌小試管中，接種于IOmL石蕊牛乳培養基中，置于37°C 恒溫培養箱中增菌培養至酸化凝固并呈現粉紅色時取出，用滅菌接種環挑取劃線接種于含有IOppm放線菌酮和IOppm硫酸粘菌素的BL瓊脂培養基中，將其放入厭氧培養罐中，置于 37°C條件下培養48小時，形成菌落后，用接種環挑取菌落，接種于MRS培養液中，置于37°C 條件下培養M小時，待菌株生長好后，再次劃線接種于BL瓊脂培養集中，37°C下厭氧培養 48小時，記錄觀察菌落形態和革蘭氏染色細胞形態特征，并進行過氧化氫酶試驗，分離出在所述試驗中呈陰性的桿菌，所述桿菌為乳桿菌。將所述乳桿菌進一步純化培養，并進行低溫保存。干酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的鑒定方法一、生理生化鑒定參照伯爵氏細菌鑒定系統，對被試菌體的形態以及生理生化特性進行鑒定，采用梅里埃API 50CHL鑒定試劑盒對其生理生化特性進行鑒定。二、16S rRNA 序列鑒定1、采用的試劑Taq酶、dNTP、DNAmarker、溶菌酶、蛋白酶K、CTAB, SDS(購自北京寶杰羅生物科技有限公司)GoldVieW(購自北京塞百盛基因技術有限公司)。2、PCR引物16S rRNA序列擴增引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列如下Ll :5，-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，L2 :5， -CGGCTACCTTGTTACGACTT-3，3、菌體培養將送檢樣品在平板上劃線分離，培養M_30h后挑取單菌落接種到 20ml液體培養基中，30°C 200rpm培養20_24h。4、基因組DNA提取基因組DNA提取參照文獻。用SDS-蛋白酶K裂解，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)沉淀細胞碎片和多糖，再用異丙醇沉淀來提取總DNA (Wilson，1987)。(1)取單菌落接種于5ml相應的培養基中，在30°C 下培養Mh ； (2)取1.0ml菌液于1.5ml離心管中，13，OOOrpm離心anin，棄上清；(3)沉淀重懸于l.Oml 0.85% NaCl中。(4)室溫13，OOOrpm離心2min，棄上清；(5)沉淀重懸于550 μ 1 IXTE 中；(6)力口 17 μ 1 溶菌酶(35mg/ml)，37°C 溫育 30min ； (7)加 3 μ 1 蛋白酶 K (20mg/ ml)，37°C溫育 30min ； (8)加 30 μ 1 10% SDS，37°C溫育 30min ； (9)加 100 μ 1 5Μ NaCl 充分混勻；(10)加 80 μ 1 CTAB/NaCl 溶液，混勻，65°C水浴 IOmin ； (11)加等體積(0. 7-0. 8ml) 氯仿/異戊醇04 1)，輕輕振蕩混勻；(12)室溫，13，OOOrpm離心IOmin ； (13)將上清液轉移到一新1.5ml離心管中，加入等體積酚/氯仿/異戊醇05 24 1)輕輕振蕩混勻； (14)重復第1 步；(1 將上清液轉移到一新1. 5ml離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇 (24 1)輕輕振蕩混勻；(16)重復第12)步；(17)將上清液轉移到一新1. 5ml離心管中， 加入0.6體積異丙醇，混勻后4°C靜置30min ;(18)20°C 13，OOOrpm離心7min ； (19)棄上清， 加500 μ 1 70%乙醇，輕輕顛倒數次(洗鹽)；(20) 40C 15，OOOrpm離心7min ； (21)重復洗鹽兩次；02)倒置離心管，干燥DNA沉淀7min。DNA沉淀溶于100 μ 1 1 X TE緩沖液，_20°C保存備用。5、PCR 擴增反應體系為ΙΟΟμΙ:Taq (5U/ μ 1) 0. 8 μ 1 ； 10 X PCR Buffer (Mg2+Plus) 10 μ 1 ；dNTP Mixture (2. 5mM/ each) 8 μ 1 ；模板 DNA 2. 5ng ；引物 27F(10y 1 mol/L)2y 1，引物 1541R(10 μ mol/L) 2 μ 1 ； ddH20 補足到 100 μ 1。PCR反應條件94 0C for4min ；94 °C for lmin，58°C for lmin，72°C for lmin30sec, 30cycles ； 72°C for 5min ；4°C save, end。6、電泳檢測用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA，用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。顯色劑為GoldView。7、序列測定純化后的PCR產物采用ABI3730基因測序儀測序。測序工作由上海生工技術有限公司完成。8、序列分析與系統樹的構建采用序列圖譜軟件Chromas，參照正、反向序列圖譜，對序列入工校對。從GenBank 核酸序列數據庫中下載戈登氏菌屬相關模式菌株的16S rRNA基因序列，與所測的RR和RY 菌株序列一起，用Clustal X軟件進行序列比對(alignment)；然后利用MEGA3. 1生物學軟件構建系統發育樹，MEGA3. 1生物學軟件構建系統發育樹見圖1，采用Neighbor-Joining法進行系統發育分析，并進行1000次重復的Bootstraps統計學檢驗。三結果與分析1生理生化鑒定結果經生理生化試驗初步鑒定，JY68細胞呈桿狀，革蘭氏染色陽性，接觸酶陰性能在 15°C和45°C條件下生長，能利用葡萄糖和果糖，初步鑒定為干酪乳桿菌(LactcAaciIlus casei)其生理生化特性見表1。表1生理生化特征
權利要求
1.一種干酪乳桿菌 Lactobacillus casei JY68，其保藏號為 CGMCCNo :3567。
2.一種發酵型健腸乳酪/粉的制造方法，它包括以下步驟步驟一，準備干酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68和短雙歧桿菌Bifidobacterium breve QQ12 菌株；步驟二，將干酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的菌株培養液單獨或與干酪乳桿菌干酪亞種一起接種到MRS培養基中在恒溫下進行發酵，將短雙歧桿菌Bifidobacterium breve QQ12菌株接種到TOS培養基中發酵；步驟三，然后將步驟二中發酵后的兩種菌株冷卻，冷卻后進行離心分離，收集菌體；步驟四，在菌體內添加凍干保護劑，然后在低溫下預凍，然后冷凍干燥制得發酵型健腸乳酪/粉，最后進行包裝。
3.根據權利要求2所述的發酵型健腸乳酪/粉的制造方法，其特征是步驟二中的干酪乳桿菌Lactobacillus casei JY68的菌株培養液單獨或與干酪乳桿菌干酪亞種一起在MRS 培養基中進行發酵的恒定溫度為37°C，發酵的時間為M小時。
4.根據權利要求2所述的發酵型健腸乳酪/粉的制造方法，其特征是步驟二中的短雙歧桿菌BifidcAacterium breve QQ12菌株在TOS培養基中發酵的恒定溫度為37°C，發酵的時間為M小時。
5.根據權利要求2所述的發酵型健腸乳酪/粉的制造方法，其特征是步驟三中兩種菌株的冷卻溫度小于或等于4°C，離心分離時的離心速度為6000rpm，離心時間為20min。
6.根據權利要求2所述的發酵型健腸乳酪/粉的制造方法，其特征是步驟四中凍干保護劑的成分為脫脂乳40% -50%、乳清粉10% -20%,Vc2% _5%、乳糖2% _5%。
7.根據權利要求2所述的發酵型健腸乳酪/粉的制造方法，其特征是步驟四中預凍的溫度為-80°C，預凍的時間為2-4小時。
全文摘要
本發明公開了一種干酪乳桿菌Lc JY68，其保藏號為CGMCC No.3567。本發明還公開了一種發酵型健腸乳酪/粉的制造方法，一，準備干酪乳桿菌Lc JY68和短雙歧桿菌BbQQ12菌株；二，將干酪乳桿菌Lc JY68的菌株培養液單獨或與干酪乳桿菌干酪亞種一起接種到MRS培養基中在恒溫下進行發酵，將短雙歧桿菌BbQQ12菌株接種到TOS培養基中發酵；三，然后將步驟二中發酵后的兩種菌株冷卻，冷卻后進行離心分離，收集菌體；四，在菌體內添加凍干保護劑，然后在低溫下預凍，然后冷凍干燥制得發酵型健腸乳酪/粉，最后進行包裝。
文檔編號A23C9/127GK102337231SQ201010238880
公開日2012年2月1日 申請日期2010年7月28日 優先權日2010年7月28日
發明者趙景陽 申請人:泰州市科星生物技術有限公司