一種除草劑抗性基因及其應用的制作方法

專利名稱：一種除草劑抗性基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，尤其是一種除草劑抗性基因、其所編碼的蛋白質 及利用其制備或培養的轉基因質粒、轉基因工程菌株、除草劑抗性植物和高抗逆性植物。
背景技術：
目前，開發非選擇性廣譜除草劑和其相應的抗性植物是雜草控制的主要模式 之一° 對輕苯基丙麗酸雙力口氧Bl (4-hydroxy-phenylpyruvate dioxygenase, HPPD ；EC 1. 13. 11. 27)的抑制劑是一類新近開發的白化型除草劑家族，其作用靶標酶HPPD是植物質 體醌生物合成途徑的關鍵合成酶類。其作用機理是，通過對HPPD酶的抑制，減少質體醌和 合成，進一步導致類囊體中類胡蘿卜素生物合成減少，引起葉片白化癥狀，從而達到除草的 目的。隨著HPPD酶抑制劑類除草劑的使用，人們開始研究培育抗HPPD抑制劑型除草劑 的轉基因作物。目前，主要有三種培育策略，第一種策略是將對抑制劑敏感的基因轉入植物 體中超表達(MMatringe etal.，2005)；第二種策略是繞過HPPD的通路，分別由三個酶代 替HPPD催化底物進行反應，以抵消除草劑對HPPD的抑制作用；第三種策略是在轉HPPD基 因植物中增加底物水平。以上三種策略不同程度的得到了抗除草劑轉基因植株，但是其抗 性效果均不理想，尤其是后兩種策略實施起來十分復雜，而多基因的表達水平又很難控制。為此，尋找一種更為有效和便捷的方法制備出抗HPPD抑制劑型除草劑的轉基因 作物，成為人們亟待解決的技術問題。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種除草劑抗性基因，此除草劑抗性基因為HPPD 抑制劑型除草劑的抗性基因，通過基因工程技術將其導入植物細胞，制備出的轉基因植物 對HPPD抑制劑型除草劑具有天然抗性，同時具有高抗逆性。為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案是一種除草劑抗性基因，其包含SEQ ID NO 1中的堿基序列。一種除草劑抗性蛋白質，其包含SEQ ID NO 2中的氨基酸序列。一種質粒，其包含所述除草劑抗性基因。本發明所述的質粒為植物表達質粒。本發明所述質粒中的除草劑抗性基因處于CaMV35S啟動子、NOS終止子的調控之 下。一種基因工程菌株，其包含所述除草劑抗性基因。制備本發明所述的基因工程菌株所使用的細菌為根癌農桿菌LBA4404。一種除草劑抗性植物的培養方法，首先利用Gateway技術將權利要求1所述的 除草劑抗性基因導入植物雙元表達載體PGWB2，再利用此植物表達載體轉化根癌農桿菌 LBA4404,經卡那霉素抗性和潮霉素抗性篩選獲得陽性根癌農桿菌LBA4404，利用其侵染植物無菌苗葉片，再經卡那霉素抗性篩選和植株再生，獲得轉基因除草劑抗性植株。一種具有高抗逆性的植物的培養方法，首先利用Gateway技術將權利要求1所述 的除草劑抗性基因導入植物雙元表達載體PGWB2，再利用此植物表達載體轉化根癌農桿菌 LBA4404，經卡那霉素抗性和潮霉素抗性篩選獲得陽性根癌農桿菌LBA4404，利用其侵染植 物無菌苗葉片，再經卡那霉素抗性篩選和植株再生，獲得具有高抗逆性的植物。采用上述技術方案所產生的有益效果在于利用本發明的基因可以構建對HPPD 抑制劑型除草劑具有天然抗性的作物，從而可以擴大HPPD抑制劑型除草劑的除草譜，同時 提高其使用效率，為我國的農作物田間除草提供一條有效的新途徑；同時利用本發明的基 因還可以提高作物的抗鹽等逆境脅迫能力。


下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明。圖1是轉基因煙草PCR分析的結果；圖2是在20 μ mol/L DTP脅迫下野生煙草苗的生長情況；圖3是在20 μ mol/L DTP脅迫下轉基因煙草幼苗苗高情況；圖4是在20 μ mol/L DTP脅迫下轉基因煙草幼苗根長情況；圖5是在20 μ mol/L DTP脅迫下轉基因煙草幼苗鮮重情況；圖6是在20 μ mol/L DTP脅迫下轉基因煙草幼苗葉綠素a含量變化情況；圖7是在20 μ mol/L DTP脅迫下轉基因煙草幼苗葉綠素b含量變化情況；圖8是在20 μ mol/L DTP脅迫下轉基因煙草幼苗類胡蘿卜素含量變化情況；圖9是野生煙草幼苗在含NaCl的培養基中的生長情況；圖10是轉基因煙草Q在含NaCl的培養基中的生長狀況；圖11是轉基因煙草S在含NaCl的培養基中的生長狀況；圖12是在NaCl脅迫培養下轉化苗鮮重相對增長量情況；圖13是在NaCl脅迫培養下轉化苗根長相對增長量情況；
圖14是在NaCl脅迫培養下轉化苗株高相對增長量情況；圖15是在NaCl脅迫下轉基因煙草幼苗葉綠素a含量變化情況圖16是在NaCl脅迫下轉基因煙草幼苗葉綠素b含量變化情況；圖17是在NaCl脅迫下轉基因煙草幼苗類胡蘿卜素含量變化情況；
具體實施例方式以下實施例詳細的說明了本發明。其中所使用的分子生物學和生物化學方法， 如包含啟動子、目的基因、終止子的表達構件的制備、植物轉化質粒的構建、目的基因植物 轉化技術、植株再生技術等，均為成熟的已知技術；在Ausubel編寫的、John Wiley and Sons 公司出版的《Current Protocols in Molecular Biology》禾口 J. Sambrook 等編寫的、 Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)出片反白勺〈〈Molecular Cloning :Labortory Manual)), 3rd ED.等文獻中均有詳細的說明。以下實施例所使用的部分培養基、母液配方如下(I)YEB培養基牛肉膏5g/L，酵母抽提物lg/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，MgSO42mmol/L, pH7. 2，固體培養基含瓊脂15g/L。(2)煙草分化培養基:MS 培養基 +3mg/L 6-BA+O. 2mg/L NAA。(3)煙草生根培養基1/2MS培養基(即大量元素減半的MS培養基)。(4)卡那霉素(Kan)母液100mg/ml，過濾除菌，分裝，_20°C保存。(5)羧芐青霉素(Cb)母液50mg/ml，過濾除菌，分裝，_20°C保存。(6)鏈霉素(Sm)母液100mg/ml，過濾除菌，_20°C保存。本發明的具體實施步驟如下1、對HPPD抑制劑型除草劑具有高抗性的黃連(Coptis japonica)培養細胞cDNA 文庫的獲取本發明所用黃連(Coptis japonica)培養細胞cDNA文庫來自京都大學大學院生 命科學研究科。2、黃連(Coptis japonica)HPPD 基因的克隆采用5' RACE法延伸cDNA 5'末端克隆黃連(Coptis japonica)HPPD基因，具體 步驟為，采用Gene Racer (Invitrogen)試劑盒，以試劑盒提供的引物(Gene Racer 5' ρ rimer) 5' -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3 ‘(如 SEQ ID NO 3)和基于 EST 核苷酸序列設計 的引物(Gene-specific reverse primer) 5' -CATGCGTAGCGAACAAATCGGCCGAGGT-3 ‘(如 SEQ ID NO 4)為引物，以黃連(Coptis japonica) ICT1X 5' -RACE cDNA 為模板，用 DNA 聚 合酶(Taq酶)進行5'末端擴增；PCR條件為，94°C 2min、94°C 30sec、72°C lmin，5個循 環；94°C 30sec、70°C lmin，5 個循環；94°C 30sec、64°C 30sec、72°C lmin，25 個循環；最后 延伸72°C 10min、4°C 99min 99sec ；瓊脂糖凝膠電泳分離、回收特異PCR擴增產物，連接入 pGEM-Teasy載體，轉化E. coli DH5 α感受態細胞，Colony PCR法鑒定陽性重組克隆，提取 重組質粒DNA，進行序列測定，與原質粒DNA序列進行BLAST序列比對分析，得黃連(Coptis japonica) HPPD基因的cDNA堿基序列如SEQ ID NO 1所示。3、植物表達載體的構建利用Gateway技術快速構建植物表達載體，具體步驟為，向黃連(Coptis japonica)HPPD基因開放閱讀框架上游5'末端起始密碼子ATG之前引入定向克隆所必須 的包含4個堿基對(CACC)的序列，設計正向引物為Topo Fw(24nt) 5' CAC CAT GGT TCC CAG CAC AGC CTC 3'(如 SEQ ID NO 5)，
反向引物為ORF的3 ‘端序列Topo Rv(30nt) 5' CTA TGC AGC AAC AAC ATT AGC TTT GGC CTC 3'(如 SEQ ID NO 6)，PCR擴增黃連(Coptis japonica)HPPD基因開放閱讀框架的平末端產物(PCR擴增 條件為 94°C 2min、94°C 15sec、58°C 30sec、68°C 1. 5min，30 個循環，68°C 5min)，之后轉化大 腸桿菌獲得含有黃連(Coptis jap0niCa)HPPD基因開放閱讀框架的入門克隆，選擇適用于 Gateway技術的植物雙元表達載體pGWB2作為目的載體，利用LR重組反應將入門克隆中的 黃連(Coptis japonica)HPPD基因開放閱讀框架引入表達載體。4、根癌農桿菌LBA4404的轉化(1)根癌農桿菌LBA4404感受態細胞的制備①挑取根癌農桿菌LBA4404單菌落于3ml的YEB液體培養基(含鏈霉素125 μ g/
5ml)中，28°C過夜培養；②取過夜培養的菌液500 μ 1接種于YEB(含鏈霉素125 μ g/ml)液體培養基中 28 °C振蕩培養至0D600為0. 5 ；③ 5000rpm，離心 5min ；④加IOml 0. 15M NaCl懸浮農桿菌細胞，5000rpm，離心5min ；⑤Iml預冷的20mM CaCl2懸浮細胞，冰浴，24h內使用，或分裝成每管200 μ 1，液 氮中速凍lmin，-70°C保存備用。(2)植物表達載體向根癌農桿菌LBA4404感受態細胞的轉化取200 μ 1感受態細胞，加入Iyg構建好的植物表達載體質粒DNA，液氮中速 凍lmin，37°C水浴5min，然后加入Iml YEB培養基，28°C慢速振蕩培養4h ；IOOOrpm離心 30sec，棄上清，加入0. Iml YEB培養基重新懸浮細胞，涂布于含有50 μ g/ml Kan,50y g/ml 潮霉素和125 μ g/ml Sm的YEB平板上，28°C培養約48h。(3)陽性克隆的鑒定挑取平板上長出的單菌落，接種于YEB液體培養基中，28°C振蕩過夜培養；小量提 取質粒DNA，以植物表達載體質粒DNA為模板進行PCR擴增鑒定(PCR擴增條件為94°C 2min、 94°C 40sec、50°C 50sec、72°C 1. 5min，30 個循環，72°C IOmin)，陽性克隆 _80°C保存菌種。5、轉基因煙草植株的獲得與篩選(1)根癌農桿菌LBA4404的培養①挑取攜帶植物表達載體質粒的農桿菌單菌落，接種在20ml含125mg/L Sm和 50mg/L Kan+50mg/L潮霉素的YEB液體培養基中，28°C，180rpm振蕩培養過夜；②活化過夜的農桿菌按1 50的比例接種在相同的YEB液體培養基中，繼續培養 至對數生長期；③5000rpm離心5min，收集菌體，用1/2MS液體培養基(即大量元素減半的MS培 養基)懸浮至0D600 = 0. 2 0. 5，準備感染用。(2)外植體的侵染及共培養①取煙草無菌葉片，切成4 6mm的葉盤(或用打孔器制取)，葉盤外植體浸入農 桿菌菌液中，感染IOmin 20min，取出外植體用無菌濾紙吸去附著的菌液；②將浸染過的外植體接種在MS培養基上，暗培養3d。(3)選擇培養將共培養的外植體轉移到含500mg/L Cb和100mg/L Kan分化培養基上，25°C，光 照培養。(4)繼代培養每隔2-3周繼代一次，并逐漸降低Cb的濃度至200mg/L。(5)生根培養待培養篩選的抗性芽長至1 1. 5cm時，切下并轉入含有200mg/LCb和100mg/L Kan的生根培養基上誘導生根，獲得具有卡那霉素抗性的轉基因植株。6、轉基因煙草PCR分析采用SDS法小量提取煙草基因組DNA，具體步驟為，將煙草組織0.5g放于研缽中， 液氮研磨至粉末狀，將粉末轉入Eppendorf管中，向管中加入800 μ L SDS裂解緩沖液，震蕩混勻，65°C水浴20min，向上述Eppendorf管中加入250 μ L 5mol/L的乙酸鉀，震蕩混勻，冰 浴5min, 12000rpm，4°C離心15min，將上清液置于新的Eppendorf管中，12000rpm，4°C離心 5min，將上清液置于新的Eppendorf管中，加入600 μ L異丙醇，12000rpm離心5min，棄上清 液，沉淀用70%乙醇漂洗2次(每次加70%乙醇600 μ L)，12000rpm離心5min，提取的DNA 干燥后溶于200 μ L TE緩沖液或40 μ L無菌雙蒸水中，_20°C保存備用，取5 μ L提取的基因 組DNA進行電泳檢測基因組完整性。以重組質粒DNA為模板進行PCR擴增作為陽性對照，以野生型煙草基因組DNA為 模板進行PCR擴增作為陰性對照；按照下表在12. 5μ L體系下依次加以下成分表1轉基因煙草PCR分析的反應體系 按以下程序進行PCR擴增94°C預變性5min ；94°C變性15s ；60°C退火30s ；72°C延 伸1. 5min ；循環30次；72°C延伸5min ；4°C保溫。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，結果參看附圖1，攜帶有外源基因的轉基因 煙草可以擴增出與質粒擴增產物大小一致的約1.3kb的目的條帶，而作為對照的未轉化野 生型煙草中沒有相應大小的產物，轉化率達到80%。7、轉基因煙草除草劑抗性分析取轉基因煙草種子分裝于1. 5mL Eppendorf管中，按表2方法消毒表2種子消毒方法 消毒后，用無菌水反復沖洗3次，種植于1/2MS培養基(即大量元素減半的MS培 養基)中，封口膜封口，28°C光照培養。取20d的生長狀態均一的轉基因煙草小苗帶根種植到HPPD抑制劑型除草劑DTP 濃度為20 μ mol/L的1/2MS培養基(即大量元素減半的MS培養基)中，光照培養45d后觀 察煙草苗生長情況，并測定煙草苗跟長、苗高、苗重、丙二醛和類胡蘿卜素含量變化。本實驗以野生煙草做對照實驗，結果如下在20 μ mol/L DTP脅迫45d后，野生煙草苗生長情況如附圖2所示，野生幼苗生長 緩慢，苗的根部幾乎未生長且呈現褐色，有部分苗的根出現褐色愈傷組織，葉片小而嚴重白 化，部分葉片已經枯萎；轉化煙草幼苗能夠保持基本正常生長，根、莖、葉生長基本未受太大 影響，整體狀況明顯優于野生；經測量，轉化煙草苗平均株高達到未轉化煙草苗株高的2倍左右(如圖3)，根長達 到未轉化煙草苗的6倍(如圖4)，鮮重約達到未轉化煙草苗的2倍(如圖5)；經檢測，轉化苗Q和S葉綠素a含量分別達到野生苗的9. 5倍和18倍，見圖6 ；葉 綠素b含量達到4. 8倍和8. 8倍，見圖7 ；類胡蘿卜素含量達到5倍和8. 4倍，見圖8。8、鹽脅迫對轉基因煙草幼苗生長影響將經常規消毒萌發的轉基因煙草幼苗轉接到含NaCl濃度分別為0，0. 3%,0. 5%, 0.8%，1.0%的1/21^培養基(即大量元素減半的MS培養基)中，一月后觀察幼苗生長情 況并測定鮮重、苗高、根長等生理指標。本實驗以以野生煙草幼苗做對照實驗，結果如下煙草種子在鹽脅迫下萌發結果表明，轉基因煙草種子萌發及生長情況在各個鹽 濃度梯度下均好于相應條件下野生煙草種子；當鹽濃度升高到時，轉化種子發芽率為 50%以上，而野生煙草種子發芽率低于20% ；野生煙草幼苗在含NaCl的1/2MS培養基(即大量元素減半的MS培養基)中生長 情況如附圖9所示，在生長過程中，野生幼苗根系生長受到抑制，并且幼苗隨鹽濃度的增加 和培養時間延長而逐漸變黃直至枯萎死亡；參看附圖10和附圖11，圖中，A-E為轉基因煙草1在NaCl濃度分別為0，0.3%， 0.5%,0.8%,1.0%的培養基中的生長狀況；F-J為轉基因煙草苗2在NaCl濃度分別為0， 0.3%,0. 5%，0. 8%，1. 0%的培養基中的生長狀況；可見，在NaCl濃度低于0. 5%情況下， 轉化苗根系發達、葉片綠色、生長狀態正常；鹽濃度提高到時，轉化苗出現生長緩慢現 象但是依然保持綠色；在NaCl脅迫培養下的轉化苗鮮重相對增長量明顯高于是野生苗相對增長(如圖12)；同樣，在NaCl脅迫條件下的轉化苗根長(如圖13)和株高(如圖14)相對增長也明顯 高于野生苗相對增長；在鹽脅迫下，轉化煙草苗葉綠素a和b的含量隨著鹽濃度的增高而略有降低，但幅 度很小；而對照野生苗葉綠素a和b的含量在鹽濃度為0. 3%時已經降到很低，約為轉化苗 的1/60和1/220，見圖15和16 ；鹽脅迫下，類胡蘿卜素含量野生型低至檢測不到，而轉化型 基本能夠保持不變，見圖17 ；結果證明轉基因煙草具有優良的抗鹽脅迫性。本發明采用煙草為樣本進行了試驗，其對于水稻、玉米、大豆、小麥等作物同樣適 用。本發明所述的HPPD抑制劑型除草劑主要包括吡唑類、異噁唑類和三酮類除草劑。上述描述僅作為本發明可實施的技術方案提出，不作為對其技術方案本身的單一 限制條件。
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權利要求
一種除草劑抗性基因，其特征在于包含SEQ ID NO1中的堿基序列。
2.—種權利要求1所述的除草劑抗性基因編碼的除草劑抗性蛋白質，其特征在于包含 SEQ ID NO 2中的氨基酸序列。
3.一種質粒，其特征在于包含權利要求1所述的除草劑抗性基因。
4.根據權利要求3所述的質粒，其特征在于其為植物表達質粒。
5.根據權利要求3所述的質粒，其特征在于其除草劑抗性基因處于CaMV35S啟動子、 NOS終止子的調控之下。
6.一種基因工程菌株，其特征在于包含權利要求1所述的除草劑抗性基因。
7.根據權利要求6所述的基因工程菌株，其特征在于制備此基因工程菌株所使用的 細菌為根癌農桿菌LBA4404。
8.一種除草劑抗性植物的培養方法，其特征在于首先利用Gateway技術將權利要求1 所述的除草劑抗性基因導入植物雙元表達載體PGWB2，再利用此植物表達載體轉化根癌農 桿菌LBA4404，經卡那霉素抗性和潮霉素抗性篩選獲得陽性根癌農桿菌LBA4404，利用其侵 染植物無菌苗葉片，再經卡那霉素抗性篩選和植株再生，獲得轉基因除草劑抗性植株。
9.一種具有高抗逆性的植物的培養方法，其特征在于首先利用Gateway技術將權利 要求1所述的除草劑抗性基因導入植物雙元表達載體PGWB2，再利用此植物表達載體轉化 根癌農桿菌LBA4404，經卡那霉素抗性和潮霉素抗性篩選獲得陽性根癌農桿菌LBA4404，利 用其侵染植物無菌苗葉片，再經卡那霉素抗性篩選和植株再生，獲得具有高抗逆性的植物。
全文摘要
本發明公開了一種除草劑抗性基因及其應用，包括SEQ ID NO1中的堿基序列；還包括一種除草劑抗性蛋白質，其包含SEQ ID NO2中的氨基酸序列；還包括一種植物表達質粒，其包含所述除草劑抗性基因。此除草劑抗性基因為HPPD抑制劑型除草劑的抗性基因，通過基因工程技術將其導入植物細胞，制備出的轉基因植物對HPPD抑制劑型除草劑具有天然抗性，同時具有抗鹽等高抗逆性。
文檔編號C12N15/29GK101892247SQ20101023862
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月21日 優先權日2010年7月21日
發明者于靜娟, 吳科瀛, 梁玉玲, 管延英 申請人:河北大學