專利名稱：一種枯草芽孢桿菌抗菌脂肽的生產方法及其在飼料中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種枯草芽孢桿菌抗菌脂肽的生產方法及其在肉雞飼料中的應用，屬 于農業領域中的畜牧養殖技術領域和生物技術領域。涉及利用抗菌肽替代飼料中抗生素的 添加，減少雞肉中抗生素的殘留和保障食品的安全。
背景技術：
飼料安全即食品安全的概念在世界范圍內已成為共識。食品和飼料在美國屬于同 一管理范圍，適用于同一部法律；丹麥政府為了保證食品安全，制定了飼料生產中禁止使用 抗生素的規定；歐盟已禁止在動物飼養中使用抗生素作為飼料促進劑。隨著人民生活水平 的提高，對動物產品的需求量越來越大，對綠色食品的呼聲越來越高。我國是養殖生產大 國，但畜產品的出口比例相當低下，與我國作為一個畜產品生產大國的地位極不相稱。我國 的一些農副產品由于農藥、抗生素等藥物殘留，重金屬含量等技術指標超過歐盟及主要進 口國的質量標準，被拒收、扣留和終止合同等。近年來，畜產品中的抗生素藥物殘留問題越 來越受到人們的重視，我國已嚴格限制將某些抗生素作為保健和促生長劑用于飼料。2002 年，農業部發布了《動物性食品中獸藥最高殘留限量》公告，這表明傳統抗生素必將逐漸淡 出歷史舞臺，尋找安全高效的抗生素替代品就顯得十分重要，鑒于抗生素的不利影響，開發 通過調整動物胃腸道平衡而達到促進生長、維持動物健康、無毒副作用的綠色飼料添加劑 已成為人們研究的熱點。特別是在我國未來養殖業的發展中，政府將進一步加大對飼料、獸 藥與畜產品衛生安全的監管力度，積極推動發展綠色養殖業。因此，應用現代高科技手段研 究和開發安全、高效、環保的抗菌添加劑，保障動物和人類自身的健康與安全，才能使我國 由養殖生產大國成為養殖生產強國，實現養殖業的現代化。國外對抗菌肽已有較多研究，在動物生產實際中也已開始應用，其作為飼料添加 劑的使用效果已被實驗證實，并已形成一定的市場需求。但一般抗菌肽的抗菌譜窄，通常只 能抑制革蘭氏陽性菌。動物源抗菌肽天然資源有限，限制了在飼料中的大規模使用。微生物 抗菌制肽由10個以下的氨基酸和一個脂肪酸組成一個環形的多肽分子，它和動物源抗菌 肽相比，具有廣譜高效抗菌的優勢。利用微生物發酵生產抗菌肽脂，可大規模工業化生產， 生產周期短，生產成本大大降低，且不受季節和氣候變化等外在環境的影響，是克服抗菌肽 實際應用技術瓶頸的最佳途徑。
發明內容
技術問題針對飼料中抗生素的使用導致導致食品安全的問題和動物源抗菌肽生產量低的 問題。本發明利用枯草芽孢桿菌生產抗菌肽的方法及其產品在雞飼料中的應用。發明目的 之一抗菌肽生產方法及產品。發明目的之二 在雞飼料中的添加方法。技術方案
—種來自枯草芽孢桿菌的抗菌脂肽的生產方法，包括以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) fmbj，種子培養基擴大培養，種子培養基 胰蛋白胨10. 0g，酵母膏5. 0g，NaCl 5. 0g，蒸餾水1000ml，pH7. 2 ；體積比2 5 %接種， 28 35°C，5000L發酵罐液體深層發酵30 48h，液體發酵培養基葡萄糖20. Og/L，胰蛋 白胨 5. Og/L,谷氨酸鈉 2 5%，MgSO4O. 5g/L，KCl 0. 5g/L，KH2PO4lg/L, FeSO4O. 15mg/L， MnS045. Omg/L, CuSO4O. 16mg/L, pH7. 0 ；發酵工藝參數為溫度 28 35°C，攪拌轉速 180" min，通氣量80m7h，罐壓0. 10 0. 12Mpa，ρΗ7· 0，消泡劑0. 3% ；發酵液經離心去除菌體， 然后在上清液中加入HCl調整ρΗ至2. 0，靜置后離心，沉淀按發酵液體積分數25 30%加 乙醇并調PH至7. 0，進一步提取，提取物經賦型劑(麥芽糊精多孔淀粉=6 9 1)吸 附、干燥，或直接進行吸附、干燥，得抗菌肽成品，產品抗菌效價為20000 300000IU/g。消 泡劑為聚醚、硅油或大豆油，優選大豆油。所述的枯草芽孢桿菌fmbj抗菌脂肽在肉雞飼料中的應用，其特征為在肉雞基礎 日糧中按照4000U/kg添加所述的抗菌脂肽，提高雞的飼料利用率，并能夠在一定程度上促 進肉雞中樞免疫器官的發育，并通過提高三碘甲狀腺氨酸(T3)和血清中的促甲狀腺激素釋 放激素(TSH)水平，降低甲狀腺素(T4)水平而提高機體免疫力。添加抗菌脂肽對肉雞的生 長發育和免疫機能具有較好的調節和促進作用。有益效果本發明的主要優點和積極效果如下1.本發明首次將枯草芽孢桿菌抗菌脂肽用于肉雞飼料中，對提高雞的飼料利用 率、免疫指數和免疫功能有積極的意義。2.本發明與目前肉雞飼料中使用的黃霉素相比，具有更好的促進生產和調節免疫 的效果，對取代飼料抗生素添加和保障食品的安全具有重要意義。
具體實施例方式實施例1采用5000L的發酵罐，以500L放大后的最佳發酵工藝條件對枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) fmbj (保藏日期:2003 年 6 月 6 日，保藏號=CGMCC No. 0943，見專利公 開號CN1477189)進行發酵生產。最佳發酵工藝參數為溫度28 35°C，攪拌轉速180r/ min，通氣量 80m3/h，罐壓 0. 10 0. 12Mpa, ρΗ7· 0，大豆油 0. 3%0以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌種fmbj，種子培養基擴大培養，種子培 養基胰蛋白胨10. 0g，酵母膏5. 0g, NaCl 5. 0g，蒸餾水1000ml，pH7. 2 ；體積比2 5%接 種，28 35°C，5000L發酵罐液體深層發酵30 48h，液體發酵培養基葡萄糖20. 0g/L,胰 蛋白胨 5. 0g/L，谷氨酸鈉 2 5%, MgSO4O. 5g/L，KCl 0. 5g/L，KH2PO4lg/L, FeSO4O. 15mg/L， MnS045. Omg/L, CuSO4O. 16mg/L, pH7. 0 ；發酵工藝參數為溫度 28 35°C，攪拌轉速 180" min，通氣量80m3/h，罐壓0. 10 0. 12Mpa，pH7. 0，消泡劑大豆油0. 3% ；發酵液采用的工業離心機為碟片式離心機(江蘇巨能機械有限公司生產，DBY211 型)，轉速為6000r/min，去除菌體，然后將離心所得清液用6N HCl調ρΗ至2. 0、靜置24h， 過濾除濾液得沉淀，沉淀按發酵液體積分數25 30%加乙醇并調ρΗ至7. 0，進一步提取， 提取物經賦型劑[麥芽糊精(山東西王淀粉有限公司)多孔淀粉(重慶泰威生物工程股份有限公司)=6 9 1]吸附、干燥，或直接進行干燥，得抗菌肽成品。抗菌肽的回收率 為48. 4%，純度為58. 5%，抑菌效價為50000 300000IU/g。實施例2采用5000L的發酵罐，以1000L放大后的最佳發酵工藝條件對Bacillus subtilis fmbj進行發酵生產。最佳發酵工藝參數為溫度32°C，攪拌轉速180r/min，通氣量80m3/h， 罐壓 0. 10 0. 12Mpa, pH7. 0，大豆油 0. 3%。采用的工業離心機為碟片式離心機，轉速為6000r/min，去除菌體，然后采用噴霧 干燥方式進行干燥。其工藝為溫度210°C、風機轉速70轉/s、賦形劑麥芽糊精多孔淀 粉=6 9 1，此時抗菌肽的回收率達54%，抑菌效價為20000 70000IU/g干粉。實施例3選用1日齡健康AA肉雞600只(體重差異不顯著，P > 0. 05)，采用單因子完全隨 機試驗設計，隨機分為5個處理組，每個處理組設6個重復，每個重復20只雞。空白對照組 (C組)飼喂基礎日糧(基礎日糧中不含抗生素和抗菌脂肽)，抗生素對照組(AC)在基礎日 糧中添加5mg/kg的黃霉素，試驗I在基礎日糧中添加抗菌脂肽4000U/kg。添加4000U/kg的I組平均日增重最高，較AC組提高3. 77%;1組的平均日采食較 C組和AC組也有下降趨勢，但差異不顯著。I組的料重比F/G較AC組降低4. 94%，較C組 也降低3. 14%。21天法氏囊指數I組較C組提高41. 48%,45天胸腺指數I組較C組分別提高 69. 91%。21天血清總蛋白含量I組較C組、AC組增加19. 00%，球蛋白水平21天時I組較 C組、AC組分別升高64. 63%，32. 76%。45天時分別升高55. 98%、6. 39%。I組較C組、AC 組T3和TSH水平提高，但T4水平下降。抗菌脂肽對21天及45天肉雞血清溶菌酶含量的影 響不顯著。實施例4選用1日齡健康AA肉雞600只(體重差異不顯著，P > 0. 05)，采用單因子完全隨 機試驗設計，隨機分為5個處理組，每個處理組設6個重復，每個重復20只雞。空白對照組 (C組)飼喂基礎日糧(基礎日糧中不含抗生素和抗菌脂肽)，抗生素對照組(AC)在基礎日 糧中添加5mg/kg的黃霉素，試驗II組在基礎日糧中添加抗菌脂肽8000U/kg。添加8000U/kg的II組平均日增重較AC組和C組差異不顯著；II組的平均日采 食較C組和AC組分另|J降低4. 28%和3. 82%。II組的料重比F/G和較11組相同較AC組降 低4. 94%，較C組也降低3. 14%。該組的法氏囊指數、II組與C組、AC組無顯著差異；該組各組肉雞脾臟指數無顯 著變化。但45天胸腺指數較C組提高61. 95%，較AC組也提高37. 59%。該組的T3和TSH 水平與C組和AC組相比有不同程度的提高，但T4水平下降。該組的白蛋白比C組低，和AC 組類似，但球蛋白較C組有所增加。該組肉雞血清溶菌酶含量有增加。實施例5選用1日齡健康AA肉雞600只(體重差異不顯著，P > 0. 05)，采用單因子完全隨 機試驗設計，隨機分為5個處理組，每個處理組設6個重復，每個重復20只雞。空白對照組 (C組)飼喂基礎日糧(基礎日糧中不含抗生素和抗菌脂肽)，抗生素對照組(AC)在基礎日 糧中添加5mg/kg的黃霉素，試驗III組分別在基礎日糧中添加抗菌脂肽12000U/kg。
添加12000U/kg的III組平均日增重較AC組和C組差異不顯著；該組平均日采食 最低，較AC組和C組分別降低6. 23 %和5. 77 %，該組的料重比最低，較AC組和C組分別降 低 6. 79%禾口 5. 03%。該組胸腺指數，該組較C組和AC組均顯著提高；21天的法氏囊指數比C組高，與 AC組類似，45天法氏囊指數與AC和C組略有下降；21天該組T3較C組和AC組顯著提高， T4與AC組相同，TSH比AC組有所增加，但45天T3水平接近，而T4與C組類似，TSH比C 組和AC組增加。該組的溶菌酶21天與AC組相同，明顯高于C組，45天與C組、AC組類似； 該組總蛋白與C組、AC組差異不顯著，但21天和45天的白蛋白高于AC組，低于C組，球蛋 白高于C組。
權利要求
一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)fmbJ抗菌脂肽的生產方法，其特征為以枯草芽孢桿菌fmbJ菌種，種子培養基擴大培養，種子培養基胰蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，NaCl 5.0g，蒸餾水1000ml，pH7.2；體積比2～5％接種，28～35℃，5000L發酵罐液體深層發酵30～48h，液體發酵培養基葡萄糖20.0g/L，胰蛋白胨5.0g/L，谷氨酸鈉2～5％，MgSO40.5g/L，KCl 0.5g/L，KH2PO41g/L，FeSO40.15mg/L，MnSO45.0mg/L，CuSO40.16mg/L，pH7.0；發酵工藝參數為溫度28～35℃，攪拌轉速180r/min，通氣量80m3/h，罐壓0.10～0.12Mpa，pH7.0，消泡劑0.3％；發酵液經離心去除菌體，然后在上清液中加入HCl調整pH至2.0，靜置后離心，沉淀按發酵液體積分數25～30％加乙醇并調pH至7.0，進一步提取，提取物經賦型劑吸附、干燥，或直接進行吸附、干燥，得抗菌肽產品，產品抗菌效價為20000～300000IU/g。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，消泡劑為聚醚、硅油或大豆油，優選大豆油。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，賦型劑為體積比麥芽糊精多孔淀粉 =6 9 1。
4.權利要求1-3之一所述的枯草芽孢桿菌fmbj抗菌脂肽在肉雞飼料中的應用，其特征 為在肉雞基礎日糧中按照4000U/kg添加所述的抗菌脂肽。
全文摘要
本發明涉及一種枯草芽孢桿菌抗菌脂肽的生產方法及其在飼料中的應用，屬于飼料添加劑和生物技術領域。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)fmbJ種子培養基擴大培養后，2～5％接種，28～35℃，5000L發酵罐液體深層發酵30～48h，然后提取，濃縮后噴霧干燥，或直接噴霧干燥，生產一種抗菌肽產品。這種抗菌脂肽以一定的效價添加至肉雞基礎日料中，提高了飼料利用率，并對肉雞的生長發育和免疫力增強均有較好的效果。本發明菌株枯草芽孢桿菌為安全的微生物，其抗菌產物安全性高。另外與目前肉雞飼料中使用的黃霉素相比，具有更好的效果，對取代飼料抗生素添加和保障食品安全具有重要意義。
文檔編號C12P21/00GK101974586SQ20101025624
公開日2011年2月16日 申請日期2010年8月18日 優先權日2010年8月18日
發明者別小妹, 呂鳳霞, 王恬, 王昱灃, 都海明, 陸兆新 申請人:南京農業大學