專利名稱：一種金錢松細胞的懸浮培養方法
技術領域：
本發明涉及一種金錢松的組織培養方法，特別是涉及一種金錢松細胞的懸浮培養方法。
背景技術：
金錢松是我國特有的古老孑遺松科樹種。根據世界保護聯盟(IUCN)新制定的物種受威脅的分類系統標準和中國植物紅皮書的標準，金錢松被定為漸危種，并被列為國家二級保護植物。金錢松既是重要的園林植物，同時更是一種重要的、應用前景廣闊的藥用植物。研究發現，金錢松最主要的藥用成分是從其樹皮和根皮中提取出來的二萜類化合物土槿酸， 它具有抗腫瘤、抗真菌、抗早孕和使膽囊自截等功效，尤其是抗腫瘤的功效使得金錢松的藥用價值更加凸顯。現代藥理研究發現，土槿酸及其衍生物能作用于多種癌細胞如胃癌細胞、宮頸癌細胞、肺癌細胞、乳腺癌細胞、卵巢癌細胞等，并具有明顯的量效關系。目前金錢松人工種植主要采用有性繁殖和無性繁殖兩種方式。有性繁殖即種子繁殖，由于金錢松存在結實率低、結實間隔期較長(一般3 5年結實)、采種條件苛刻(采種母樹年齡以100年左右為最好)、種子成活率低(僅為60%-70%)、以及種子需低溫保存等因素的限制，因此目前還不可能通過有性繁殖大量種植金錢松。無性繁殖即扦插繁殖，金錢松為菌根性樹種，宜在海拔500m左右的山地建立永久性育苗基地或在土內有菌的林間育苗，植物生長周期長，并易受金錢松小卷蛾的嚴重危害，這些因素限制了金錢松的大量無性繁殖。由于人工種植金錢松存在上述問題，因此目前迫切需要利用組織培養技術來大量生產有效成分含量高的金錢松培養物，以滿足人們對金錢松的需要。目前金錢松的研究主要集中在對金錢松有效成分的提取及其內生真菌的篩選方面，極少有金錢松在植物生物技術方面研究的報道。已有的金錢松在植物生物技術方面的研究，如王躍華等人發明的“一種以金錢松葉原基為外植體的愈傷組織培養方法”(專利申請號201210104866. 8)，也只對金錢松愈傷組織的培養進行了研究。目前還未見任何有關金錢松細胞在懸浮培養方面的研究報道。
發明內容
本發明的目的是針對目前金錢松資源緊缺以及現有傳統栽培方法存在周期長、難度大的問題而提供一種金錢松細胞的懸浮培養方法，該方法可實現在短時間內快速生產出有效成分含量高的金錢松細胞培養物，以緩解當前金錢松植物資源緊缺的問題。為達到上述目的，本發明采用的解決方案由如下步驟構成(I)愈傷組織的誘導培養選取落葉后生長健康、無病蟲害的金錢松植株上的芽，剝去芽上的芽鱗片后將芽進行消毒處理，再將已消毒的芽接入固體培養基MS+6-BA1. 0 2. 0 mg L kNAAO. 5 4. 0 mg L 1 + 鹿糖 20 50 g L 1 + 瓊脂 5.0 7.0 g.L1 中進行培養，培養溫度10 30 ° C、pH值為5. 6 6. 5、每天光照4 16小時、光照強度為1000 2000 Ix ；(2)細胞的預培養將步驟(I)中獲得的愈傷組織轉接入液體培養基MS+6-BA0. 5 1. 5 mg L-1+2、4-D1. 0 4. 0 mg L-1+KT 0 2. 0 mg L-1+ 蔗糖 20 50g L-1中進行5 8天的預培養；(3)細胞的懸浮培養選取預培養后處于懸浮培養液中部和上部的金錢松單個細胞或疏松細胞小聚集體，以20 50 g L-1的接種量轉接到B5+6-BA0.1 1. 0 mg 1^+2、4-D 2. 0 5. 0 mg L :+KT 0.1 1. 0 mg L :+鹿糖20 50 g L 1的液體培養基中進行細胞的懸浮培養； (4)細胞的繼代培養在細胞懸浮培養了 30天進行第一次繼代培養，以后每隔 15 25天繼代一次；(5)細胞增殖生長計算取繼代培養的細胞在4000r/min的離心機上離心10 min
后，倒掉上清液進行稱重，即為鮮重；細胞增殖倍數=(收獲量鮮重一接種量鮮重)/接種量鮮重；細胞的生長速率(即每升培養液中每天生長量)=(收獲鮮重一接種量鮮重)/培養天數。上述(2)、(3)、(4)步驟中金錢松細胞的液體培養條件均為溫度15 28° C，pH值4. 0 7. 0，每天光照6 12小時，光照強度為1000 1500 lx，搖床轉速為110 140r mirf1。上述步驟(I)中所述消毒處理是指將芽鱗片先用濃度為70%的酒精消毒1(T50s，再用濃度為0.1 °/T0. 15 %的升汞消毒3 5 min，最后用無菌水沖洗2飛次。本發明通過采用對金錢松的愈傷組織進行細胞的懸浮培養，可實現大規模快速生產出有效成分含量高的金錢松細胞培養物，從而可有效解決當前金錢松植物資源和藥材資源短缺的問題。
具體實施例方式實施例1(I)愈傷組織的誘導培養選取落葉后生長健康、無病蟲害的金錢松植株上的芽，剝去芽上的芽鱗片后將芽放在超凈工作臺上，先用濃度為70%的酒精消毒40s，再用濃度為0.1 %的升汞消毒4 min，最后用無菌水沖洗4次，然后將已消毒的芽接入固體培養基MS+6-BA1. Omg L_1+NAA2. 0 mg L-1 + 蔗糖 30 g L—1 + 瓊脂 6. 0 g L-1 中進行培養，培養溫度22 ° C、pH值6、每天光照10小時、光照強度為1500 lx，培養25天后愈傷組織的誘導率為98. 2% ；(2)細胞的預培養將步驟(I)中獲得的顏色為翠綠色的愈傷組織轉接入液體培養基 MS+6-BA1. 0 mg L_1+2,4-D 3. 0 mg L_1+KT 0. 5mg L-1+ 蔗糖 25 g L-1 中進行 7 天的預培養；(3)細胞的懸浮培養選取預培養后處于懸浮培養液中部和上部、顏色為翠綠色的金錢松單個細胞或疏松細胞小聚集體，以30 g -r1的接種量轉接到B5+6-BA0. 5 mg
4-D 3. 0 mg L^+KT 0. 5 mg L—1+蔗糖25g L—1的液體培養基中進行細胞的懸浮培養；(4)細胞的繼代培養在細胞懸浮培養了 30天后進行第一次繼代培養，以后每隔20天繼代一次；(5)細胞增殖生長計算取繼代培養3代的細胞在4000r/min的離心機上離心10min后，倒掉上清液進行稱重，計算出金錢松細胞的生物量增殖倍數為2. 98倍，細胞的生長速率為 3. 97 g(d.L)-1 ；上述(2)、(3)、(4)步驟中金錢松細胞的液體培養條件均為溫度22° C，pH值6.0，每天光照8小時,光照強度為1200 Ix,搖床轉速為120r mirT1。實施例2將實施例1步驟(2)中的預培養基改為MS+6-BA1. 2 mg L_1+2,4-D 2. 0·mg L^+KT I mg L—1+蔗糖30 g L—1，其它步驟同實施例1，繼代培養3代的金錢松細胞生物量增殖倍數為1. 88倍，細胞的生長速率為2. 14 g (chL)'實施例3將實施例1步驟(2)中的預培養基改為MS+6-BA1. 0 mg ^^+2,4-0 3. 0 mg .171+蔗糖25 g L—1，其它步驟同實施例1，繼代培養3代的金錢松細胞生物量增殖倍數為2. 12倍，細胞的生長速率為2.61 S(ChL)'實施例4將實施例1步驟(3)中的懸浮培養基改為B5+6-BA1. Omg L_1+2,4-D 2. 0mg P+KT 0.1 mg L—1+蔗糖35g L—1其它步驟同實施例1，繼代培養3代的金錢松細胞生物量增殖倍數為2. 07倍，細胞的生長速率為1. 87g (Cl-L)^10實施例5將實施例1步驟(3)中金錢松細胞的接種量改為10 g L—1，并將液體培養基改為 B5+6-BA0. 5mg L_1+2,4-D 4. 0 mg L-1+KT 0. 5 mg I71+ 蔗糖 25 g L—1，其它步驟同實施例1，繼代培養3代的金錢松細胞生物量增殖倍數為3. 04倍，細胞的生長速率為1. 29g(d.L)'實施例6將實施例1步驟(3)中金錢松細胞的接種量改為50 g L—1，并將液體培養基改為B5+6-BA0. 5mg *1^+2,4-D 4. 0 mg .171+KT 0. 5 mg .171+蔗糖25 g .L'其它步驟同實施例 1，繼代培養3代的金錢松細胞生物量增殖倍數為1. 89倍，細胞的生長速率為3. 91 g (chL)'比較實施例1將實施例1步驟(2)(細胞的預培養)取消，其它步驟同實施例1，繼代培養3代的金錢松細胞生物量增殖倍數為1. 46倍，細胞的生長速率為1.03 g (Cl-L)^10比較實施例2將實施例1步驟(3)改為選用處于懸浮培養液下部、顏色為綠黃色、質地較緊密的金錢松細胞團塊進行細胞的懸浮培養，其它步驟同實施例1，繼代培養3代的金錢松細胞生物量增殖倍數為1. 56倍，細胞的生長速率為1. 86 g(chL)-1。
權利要求
1.一種金錢松細胞的懸浮培養方法，其特征在于包括如下步驟(1)愈傷組織的誘導培養選取落葉后生長健康、無病蟲害的金錢松植株上的芽，剝去芽上的芽鱗片后將芽進行消毒處理，再將已消毒的芽接入固體培養基MS+6-BA1. O 2. O mg · L i+NAAO. 5 4· O mg · L 1 + 鹿糖 20 50 g · L 1 + 瓊脂 5. O 7. O g · L 1 中進行培養，培養溫度10 30 ° C、pH值為5. 6 6. 5、每天光照4 16小時、光照強度為1000 2000 Ix ；(2)細胞的預培養將步驟(I)中獲得的愈傷組織轉接入液體培養基MS+6-BA0.5 1. 5 mg · L :+2>4~01. O 4. O mg · L :+KT O 2· O mg · L :+ 鹿糖 20 50 g · L 1 中進行 5 8天的預培養；(3)細胞的懸浮培養選取預培養后處于懸浮培養液中部和上部的金錢松單個細胞或疏松細胞小聚集體，以20 50 g · L-1的接種量轉接到B5+6-BA0.1 1. O mg · L^+2,4-D 2· O 5· O mg · L_1+KT 0.1 1. 0 mg · I71+鹿糖20 50 g · L-1的液體培養基中進行細胞的懸浮培養；(4)細胞的繼代培養在細胞懸浮培養了28 32天進行第一次繼代培養，以后每隔 15 25天繼代一次；上述(2)、(3)、(4)步驟中金錢松細胞的液體培養條件均為溫度15 28° C，pH 值4. (Γ7. 0，每天光照6 12小時，光照強度為1000 1500 lx，搖床轉速為110 140r · mirf1。
2.根據權利要求1所述的一種金錢松細胞的懸浮培養方法，其特征在于步驟(I)中所述消毒處理是指將芽鱗片先用濃度為70%的酒精消毒l(T50s，再用濃度為O.1 9Π). 15 % 的升萊消毒3 5 min,最后用無菌水沖洗2、次。
全文摘要
本發明公開了一種金錢松細胞的懸浮培養方法，該方法包括如下步驟愈傷組織的誘導培養→細胞的預培養→細胞的懸浮培養→細胞的繼代培養。本發明通過采用對金錢松的愈傷組織進行細胞的懸浮培養，可實現大規模快速生產出有效成分含量高的金錢松細胞培養物。
文檔編號C12N5/04GK102994444SQ20121047229
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月20日 優先權日2012年11月20日
發明者王躍華, 楊小萍, 袁暢, 王強, 黃興, 王丹, 宋超, 覃澤嬌, 王朝君, 吳佳靚, 熊云翔, 江明殊 申請人:成都大學