單克隆抗體介導的豬傳染性胸膜肺炎早期感染檢測試劑盒的制作方法

專利名稱：單克隆抗體介導的豬傳染性胸膜肺炎早期感染檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物診斷試劑研制領域，具體涉及一種檢測豬傳染性胸膜肺炎早期感 染的的ELISA試劑盒及使用方法。
背景技術：
豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)引起豬的一種高度接觸傳染性疫病，到目前為止報道的APP病原血清型共有15個和2 個生物型，其中血清1 12、15型為生物I型，血清13 14型為生物II型。生物I型對豬 的致病性比生物II型強，除血清型15外的1 12血清型APP都能引起被感染豬嚴重發病 和死亡。自1957年Pattison首次報道豬傳染性胸膜肺炎以來，本病在全世界很多國家 廣泛流行，已成為國際公認的危害現代養豬業的重要傳染病(五大疾病)之一，東歐一國家 2006年APP抗體普查在93份樣品中陽性感染率達52%(VenguSt等，2006)。該病于80年 代在我國開始流行，多數為復合型感染且地域分布較廣，已有的研究報道我國流行的血清 型為1、2、3、5、7、10等型，并不斷形成廣泛的流行趨勢。。該病不斷持續流行使我國養豬業蒙受巨大損失。流行病學調查、預警預報和追蹤 監測能提高整個防疫工作的主動性和針對性，是有效防控重要疫病的核心環節。因此，為 有效地預防和控制本病，了解APP感染和傳播，準確診斷、早期預防和控制對本病來說就顯 得尤為重要，建立一種靈敏度高、特異性好、快速準確的診斷方法是保障養豬業持續健康發 展的當務之急。目前，診斷本病的方法大多是采用血清學方法和病原學方法。病原學方法主要 采用細菌分離培養，進而通過培養特性和系列生化試驗進行鑒定，細菌分離鑒定費時費 力，過程煩瑣，鑒于感染病程不一，尤其治療抗生素和藥物添加劑在豬體廣泛使用，APP感 染豬時常分離不到致病菌；傳統的血清學診斷方法包括間接凝集試驗、補體結合反應、玻片 凝集反應、常規ELISA法、乳膠凝集試驗、瓊脂擴散試驗等方法。簡便、快速，但準確性較 差，也難以對感染豬作出鑒別診斷，對亞臨床感染或帶菌狀態下易造成假陰性。加拿大豬 細菌性病原研究網絡協會研制出ELISA試劑盒用于監測APP1、9和11型感染，瑞士也成功 研制出用于監測APP2型ELISA試劑盒。上述檢測技術的敏感性很高，能夠針對對該病的 血清種特異性診斷，但由于該病原血清型眾多，且各個血清型之間沒有很好的交叉反應， 這樣勢必導致APP致病菌所有血清型難以覆蓋，出現漏檢和準確診斷的問題。分子生物學 方法和技術運用在APP病原的分子生物學研究上取得了較大的進展，加拿大蒙特利爾大學 Dr. Mjacque研究小組(2005)已成功鑒定了 APP兩種表面大分子蛋白FhuA和HgbA，它們與 該細菌在環境中攝取鐵相關，由一組操縱子基因編碼。體外重組表達的上述兩蛋白都能與 所有APP血清型菌株抗血清發生交叉反應。尤其值得注意的是，在APP中發現一種毒素， 由APX IV A基因編碼。A PX IV A基因存在APP所有血清型中，并具有種特異性，所編碼 的毒素IV蛋白不與胸膜肺炎放線桿菌親緣關系較近的種屬如Rossii放線桿菌和suis放線桿菌抗血清有任何交叉反應，也不與非致病性Porcitonsillarun放線桿菌抗血清發生 交叉反應。不同血清型的A PX IV A基因比較保守，尤其在它的5’和3’端，在分子大小上 有微小的區別。瑞士 A lain Schaller報道，以APP的1_14個血清型菌株染色體DNA做 模板，用PCR方法都能擴增出3’端保守片段，而從其它親緣關系相近的細菌中無法擴增 這一片段，說明這一片段具有很高的種特異性，且APX IV基因可在所有血清型APP中檢測 到。如將實施APX IV A基因保守片段的克隆、表達和進一步研制成抗APX IV A的單克隆抗 體(McAb)，將為建立和開發McAb介導的APP抗原和抗體監測和診斷試劑盒提供廣闊應用前本發明用PCR方法擴增出病原APP所有血清型中溶血毒素APX IV A保守基因片 段，并進行克隆，然后用原核高效誘導表達系統表達出可溶性APX IV A基因產物，以此重組 基因可溶性表達產物經提取純化作為免疫原，免疫BALB/C小鼠，研制出針對APPAPX IV A不 同抗原決定簇的特異性單克隆抗體。再以不同單克隆抗體優化組合研制出了獨特酶免疫試 驗檢測試劑盒和使用方法，以其檢測臨床豬血清。

發明內容
本發明的目的就在于克服上述檢測APP病原試劑盒的缺陷和不足，提供一種可應 用臨床豬早期感染APP檢測的ELISA試劑盒及該試劑盒的使用方法。所說的檢測胸膜肺炎放線桿菌的ELISA試劑盒包括以下部分包被胸膜肺炎 放線桿菌rApx IV N蛋白單克隆抗體的酶標板、檢測用生物素標記的胸膜肺炎放線桿菌 rApx IV N蛋白單克隆抗體、洗滌液、顯色液、終止液、陽性對照、陰性對照。進一步地，上述試劑盒中所說的包被在酶標板上的單克隆抗體(一抗)為IgM亞類 單克隆抗體，檢測用生物素標記的單克隆抗體(二抗)是生物素NHS-Biotin標記的IgG亞類 單克隆抗體。本發明還公開了胸膜肺炎放線桿菌rApx IV N蛋白單克隆抗體的制備方法，其步 驟如下
(1)A PX IVA基因5’端保守片段的克隆
以下述序列為引物，胸膜肺炎放線桿菌DNA為模板進行PCR擴增， 上游引物 5，- cgccatatgaaaacggcgactttcgct -3，(27bp，下劃線為 Ndel 酶切位點)， 下游弓丨物 5，- cRRCRRCCRcattattRcccRctaRaaaatc _3，(31bp,下劃線為似 I 酶切 位點)；
(2)可溶性重組毒素APX IV A N端蛋白的表達和制備PCR擴增產物用Nde I和Not I雙酶切、鑒定、回收后插入同樣處理的表達載體pET-22b(+)中；將得到的重組載體導入 E. coli BL21(DE3)，篩選陽性克隆的重組菌；用IPTG誘導表達上述陽性重組菌，然后收集 表達產物，Protino Ni-TED親和層析法純化重組表達蛋白，得重組毒素蛋白Apx IV N ；
(3)抗APX IV A N蛋白單克隆抗體制備純化的重組毒素Apx IV N蛋白(rApx IV N) 與弗氏完全佐劑、不完全佐劑乳化，免疫原制備和免疫BALB/c小鼠；免疫鼠脾細胞與 SP2/0骨髓瘤細胞融合，間接ELISA篩選；陽性雜交瘤細胞亞克隆建株、經腹水制備與純化 得rApx IV N蛋白單克隆抗體。本發明的優點和效果在于1.基于已發表APP毒素A PXIVA基因序列，結合我們已完成測定的APP其它血清型 序列數據并進行同源比對，發現A PXIVA基因5’端相當保守片段，采用設計一對PCR擴增 用公用引物，PCR擴增出致病性APP所有血清型A PX IV A基因5 ’端保守片段DNA序列，這 是本發明的創造性組合一部分所在。2、巧妙設計和PCR擴增出致病性APP所有血清型A PX IV A基因5’端保守片段DNA 序列，并對該序列進行基因克隆和高效誘導表達，制備大量的可溶性重組蛋白(r A PXIV AN蛋白)，由于該融合標簽小，重組蛋白折疊時不易掩蓋靶蛋白的表位，融合蛋白表達后以 可溶形式存在，直接作為抗原免疫動物時，激活的B細胞產生的抗體識別構象表位和線性 表位，因此制備的單克隆抗體可以避免構象表位的缺失。依據可溶性r A PXIVA N蛋白作 為McAb制備用免疫原，這是本發明的創造性組合一部分所在。其意義在于，應用本發明可以制備大量的可溶性r A PXIVA N活性蛋白，克服常 規操作中的胞漿內表達出無生物活性的包涵體顆粒。3.高靈敏和高捕獲抗原性能的雙McAb夾心ELISA方法
捕獲抗體的一抗為IgM亞類McAb，具有高捕獲抗原性能，檢測抗體的二抗為生物素 NHS-Biotin標記的IgG亞類McAb。而且，捕獲McAb和檢測用McAb識別不同抗原表位，組 裝成的雙McAb夾心生物素-親和素ELISA法檢測具有高度靈敏性。對外源性DNA質粒標 準品的檢測具有很好的重復性和性，并可以構建標準曲線。其意義在于，應用本發明可以檢測APP感染豬血清，具有很好的重復性和
靈敏性。其意義還在于，應用本發明檢測出豬是否早期感染APP，最早能在感染后第7 天確定，因為Apx IV毒素是APP感染早期反應抗原。


圖1是PCR電泳圖； 圖2是SDS-PAGE檢測圖。
具體實施例方式以下實施例中涉及到的由申請人保存的微生物材料，均自申請日起向公眾提供20年。實施例一
1. APP所有血清型標準菌株模板DNA和陰性對照模板制備
APP血清型1 12標準菌株、APP血清型1型、3型、5型和7型臨床分離株和副豬嗜 血桿菌1 15型、豬霍亂沙門氏菌、奇異變形桿菌、支氣管敗血波氏菌、豬丹毒桿菌、豬放線 桿菌、豬源多殺性巴氏桿菌由申請人研究室提供，上述各細菌基因組DNA提取按已有報道 的方法進行。具體為取細菌過夜培養物1 mL室溫8，000 r/min離心5min，1 mL PBS懸浮 沉淀，加6 uL 50 mg/mL溶菌酶，37°C作用2 h，加50 y L蛋白酶K，50°C作用3 h或37°C 過夜。加等體積的苯酚氯仿異戊醇抽提，0. 6倍體積的異丙醇沉淀0. 5h以上，12，000 r/min離心lOmin后用75%乙醇洗滌，沉淀晾干后溶于500 u L超純水，瓊脂糖凝膠電泳鑒 定基因組DNA和分光光度計測定其濃度。2.聚合酶鏈反應(PCR)
5(1)引物設計與合成擴增及檢測Apx IV毒素基因5’端保守片段的的序列引物為 上游引物 5，- cgccatatgaaaacggcgactttcgct _3，(27bp，下劃線為 Ndel 酶切位點) 下游弓丨物 5，- cRRCRRCCRcattattRcccRctaRaaaatc _3，(31bp,下劃線為似 I 酶切 位點)
(2)PCR反應體系組成50 ii L的PCR反應體系中含0. 8 u L Ex Taq DNA聚合酶、 5u L lOXEx Taq PCR Buffer (15 mmol/L MgC12)、0. 8 u L 0. 25 ii mol/L 正反向引物、2 U L dNTPs Mixture (each 2.5 mmol/L)、5 u L DNA 模板及 35. 6 yL 超純水。(3)擴增循環參數第一步94°C 4min ；第二步94°C 45s, 53°C 45s, 25 個循 環；第三步-.irC 8min。(4) PCR特異性將APP血清型1 12標準菌株、副豬嗜血桿菌1 15型(除8型 外)、豬放線桿菌、豬源多殺性巴氏桿菌、豬霍亂沙門氏菌、奇異變形桿菌、支氣管敗血波氏 菌和豬丹毒桿菌的DNA模板進行擴增，檢測并確定該PCR擴增片段的特異性(圖1)。分別對 APP1、3、5和7型共5株臨床分離株作了雙盲試驗的PCR檢測和特異性驗證。(5)PCR 敏感性制備含量分別為 900 pg、90 pg、9 pg、0. 9 pg、0. 09 pg
的APP標準菌株基因組DNA，檢測最低DNA模板的PCR檢出量為9 pg ；同時將APP血清 各標準菌株菌懸液系列稀釋成適量的濃度，平板菌落計數后(每個濃度做三個重復)，提取 基因組DNA作為DNA模板進行PCR擴增，檢測PCR最低活菌為2 X 102 cfu/mL檢出量。3.可溶性重組毒素A PX IV A N端蛋白的表達和制備
(1)克隆將步驟2中PCR擴增產物(px IV毒素基因5’端保守片段)用限制性內切酶 Ndel和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳并結合DNA回收試劑盒純化PCR產物，插入同樣處 理的表達載體pET-22b(+)中，制備DH5ci感受態細胞，將含目的DNA片段與載體質粒連 接反應后，得到的重組質粒pET-22b(+)全量轉入200 yl的感受態細胞中；經氨芐青霉素 (Amp+)平板篩選、挑取單個菌落培養和提取質粒進行雙酶切鑒定，陽性克隆提取含目的片 段的質粒DNA經測序驗證，將陽性質粒命名為pETapx IV N。(2)表達和檢測進一步將含pET apx IV N陽性重組宿主菌E. coli BL21(DE3) 在LB (Amp+)液體培養基中經適當培養條件和IPTG誘導表達，收集不同時段的菌液超聲 波破碎菌體，分離上清和沉淀，SDS-PAGE檢測確定表達蛋白存在的狀態，并進行免疫轉印， 以小鼠單克隆抗體Anti-his為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗作免疫檢測，加DAB顯 色。經優化確定最佳誘導條件為0. 1 mmol/L IPTG，37°C誘導4 h，表達的重組蛋白rApx IV N 經SDS-PAGE檢測，在約35. 3 kDa處可見明顯的蛋白條帶(圖2)，與預期結果相符，且表達 產物呈現可溶性狀態。(3)重組蛋白純化和制備 Protino Ni-TED親和層析，經固定化鎳離子親和層 析試劑盒純化重組蛋白rApx IV N后，SDS-PAGE鑒定其為單一蛋白條帶，配成濃度為lmg/ mL04. McAb 制備
陽性雜交瘤細胞制備純化的重組毒素Apx IV N蛋白(rApx IV N)與等體積弗氏完全 佐劑乳化后，背部皮下多點注射免疫6-8周齡BALB/c雌性小鼠，免疫劑量為50 u g/只。初 次免疫后第14 d和第28 d，取純化抗原與弗氏不完全佐劑等量混勻乳化，分別進行二免和 三免。在三免后第10 d采血檢測抗體效價，當間接ELISA抗體效價達1:104以上時，以純化裸露抗原加強免疫，3 d后將免疫鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按常規方法進行融合，于96 孔培養板中37°C 5%C02飽和濕度的培養箱中培養。以純化rApxIVN為檢測抗原包被酶標 板，通過間接ELISA法對融合后14天的雜交瘤細胞上清液進行篩選。挑選間接ELISA檢測 結果為陽性，0D490值>1.0且連續兩次檢測為陽性的雜交瘤細胞進行克隆、亞克隆。采用 有限稀釋法，連續克隆化三次至0D490值穩定后一直比較穩定的建株，分別進行擴大培養 并凍存。最終獲得穩定分泌抗體且效價高的雜交瘤細胞株4株。McAb亞類鑒定為IgGl和 IgM兩種，分別各為2株。5.雙McAb夾心ELISA方法的建立及應用
(1) McAb腹水制備、純化與生物素標記選用10-12周齡BALB/c小鼠，接種陽性雜交 瘤細胞5天后，每日觀察小鼠腹水的生成情況，待小鼠腹部膨脹明顯時收集腹水，離心10 min去除細胞碎片等雜質，間接ELISA測定上清效價達1:6. 4X104以上。以33%飽和度的 (NH4)2S04鹽析法純化腹水，核酸蛋白檢測儀測得腹水單抗濃度為2 mg/mL。于1 mL McAb2 5B7 腹水 IgG 純化物(2 mg/mL)中加入 26. 6 u L NHS-Biotin 溶液(2. 0 mg NHS-Biotin 溶于590 u L DMSO)，反應產物透析后用間接ELISA測得Biotin標記效價可達106。(2)雙McAb夾心ELISA法的建立基于競爭ELISA方法分析鑒定McAb的抗原表 位，在包被純化rApx IV N蛋白的ELISA板中，加入已知飽和工作濃度的McAbl (IgM亞類)， 37°C濕盒作用1 h，PBST洗3次后加入另一種飽和工作濃度的McAb2 (IgGl亞類)，37°C濕 盒作用1 h，同前洗滌，加入羊抗鼠HRP-IgG，37°C濕盒作用1 h后同前洗滌，0PD底物顯色 液37°C避光作用20 30 min;以2 mol/L H2S04終止反應，讀取0D49(1值，計算增值指數 (AI)。按如下公式計算AKAm-A^/^X 100%，其中A,為McAbl不疊加McAb2的0D徹，A2 為McAb2不疊加McAbl的0D徹，A1+2為McAbl疊加McAb2的0D徹。由競爭ELISA結果得出 單克隆抗體McAb2疊加McAbl時增殖指數(AI)值為32%，McAbl疊加McAb2時AI值為 15%。根據試驗結果和判斷標準說明這兩株單抗識別不同的抗原表位，以期建立雙抗體夾 心ELISA方法和進一步應用。基于篩選出針對不同抗原表位的上述兩株單抗，分別為檢測 抗體和捕獲抗體，建立夾心ELISA。確定最佳捕獲抗體McAb包被濃度為4 u g/mL、檢測抗 體Biotin-McAb的工作濃度為0. 8 ii g/mL,rApx IV最低檢出量為60 pg/mL、陽性和陰性對 照的最佳稀釋濃度。(3)雙McAb夾心ELISA法的特異性、臨界值確定經上述建立的雙McAb夾心ELISA 檢測，上述兩株雜交瘤細胞株分泌的McAb只與檢測的APP rApx IV N發生反應，而不與豬瘟 病毒、豬圓環病毒、豬呼吸道繁殖障礙綜合征病毒、豬黃痢、白痢產腸毒素大腸桿菌和豬肺 疫多殺性巴氏桿菌感染陽性血清反應，表明該McAb只特異性識別和結合APP中rApx IV。實施例二
ELISA檢測試劑盒包括包被APP rApx IV N蛋白單克隆抗體的酶標板、檢測用生物素 標記的單克隆抗體(Biotin-McAb)、洗滌液、顯色液、終止液、陽性對照、陰性對照。上述試劑盒的使用方法是
10份來自江蘇3個豬場疑似APP感染病豬血清及其病變肺組織樣品，病變肺組織進行 細菌的分離鑒定，不同病程的病豬血清用上述建立的雙抗體夾心ELISA法進行檢測。經綿羊鮮血瓊脂平板培養，革蘭氏染色鏡檢后，10份可疑APP病變肺組織樣品中 有6份(樣品2、5、6、8、9和10)分離到可疑菌落。可疑菌落生化鑒定結果都為CAMP陽性，脲酶陽性，甘露醇發酵陰性，進一步通過PCR (人？乂1乂人基因5’端保守片段的？0 擴增) 判定為APP。建立的雙McAb夾心ELISA檢測10份病豬血清，0D490平均值0D490彡0. 326的 有樣品2、5、6、8、9和10，判定為陽性。雙McAb夾心ELISA檢測結果與細菌分離鑒定、PCR 檢測相符合。并以此可以分別對不同血清型APP病原在不同病程階段的快速和靈敏檢測，從而 加強對臨床疾病的診斷、治療，跟蹤觀察治療效果，進行病情預后分析等。本發明的保護范圍并不僅僅局限于本實施例的描述。
權利要求
一種檢測胸膜肺炎放線桿菌的ELISA試劑盒，包括洗滌液、顯色液、終止液、陽性對照、陰性對照，包被一抗的酶標板，檢測用的二抗，其特征在于所說的一抗是胸膜肺炎放線桿菌 rApxⅣN蛋白單克隆抗體，二抗是生物素標記的胸膜肺炎放線桿菌 rApxⅣN蛋白單克隆抗體。
2.根據權利要求1所述的ELISA試劑盒，其特征在于，所說的一抗為胸膜肺炎放線桿 菌rApx IV N蛋白IgM亞類單克隆抗體；二抗是生物素NHS-Biotin標記的胸膜肺炎放線桿 菌rApx IV N蛋白IgG亞類單克隆抗體。
3.根據權利要求1所述的ELISA試劑盒，其特征在于，其中所說的rApxIVN蛋白單克 隆抗體是通過以下制備方法(1)APXIVA基因5’端保守片段的克隆以下述序列為引物，以胸膜肺炎放線桿菌DNA為模板進行PCR擴增，上游引物 5，- cgccatatgaaaacggcgactttcgct _3，，下游引物 5，- cRRCRRCCRcattattRcccRctaRaaaatc _3，；(2)可溶性重組毒素APXIVA N端蛋白的表達和制備PCR擴增產物用Nde I和Not I雙酶切、鑒定、回收后插入同樣處理的表達載體pET-22b(+)中；將得到的重組載體導入 E. coli BL21(DE3)，篩選陽性克隆的重組菌；用IPTG誘導表達上述陽性重組菌，然后收集 表達產物，Protino Ni-TED親和層析法純化重組表達蛋白，得重組毒素蛋白Apx IV N ；(3)抗APXIVA N蛋白單克隆抗體制備純化的重組毒素Apx IV N蛋白(rApx IV N) 與弗氏完全佐劑、不完全佐劑乳化，免疫原制備和免疫BALB/c小鼠；免疫鼠脾細胞與 SP2/0骨髓瘤細胞融合，間接ELISA篩選；陽性雜交瘤細胞亞克隆建株、經腹水制備與純化 得rApx IV N蛋白單克隆抗體。
全文摘要
本發明涉及生物診斷試劑研制領域，具體是一種檢測胸膜肺炎放線桿菌的ELISA試劑盒，該試劑盒包括洗滌液、顯色液、終止液、陽性對照、陰性對照，包被一抗的酶標板，檢測用的二抗，所說的一抗是胸膜肺炎放線桿菌rApxⅣN蛋白單克隆抗體，二抗是生物素標記的胸膜肺炎放線桿菌rApxⅣN蛋白單克隆抗體。應用本發明可以檢測APP感染豬血清，具有很好的重復性和靈敏性。
文檔編號C12N15/31GK101949934SQ20101027436
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月4日 優先權日2010年9月4日
發明者姚豐華, 張志妮, 朱軍, 朱國強, 朱曉芳, 王建業, 舒燕 申請人:揚州大學