豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌二聯滅活疫苗及其制備方法

豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌二聯滅活疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發明提供了3株豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌和2株豬鏈球菌，幾種抗原配合使用，可以將抗原之間的相互干擾將至最低；基于上述發現，本發明提供了一種具有良好的免疫原性的豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌病二聯滅活疫苗；該疫苗使用了滅活的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1、5、7型與豬鏈球菌作為抗原，其具有超強毒力及免疫原性，在疫苗制備過程中可使用較少的抗原量達到較好的免疫效果，從而降低生產及使用成本，適宜大規模生產及養殖場中的應用。本發明的豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌二聯滅活疫苗，在與單苗相同生產成本及銷售價格的水平上，達到一針兩防的效果，可代替單苗使用，從而大大降低了免疫成本，具有商業上的成功潛力。
【專利說明】豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌二聯滅活疫苗及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌二聯滅活疫苗及其制備方法，屬于獸藥疫苗領域。
【背景技術】
[0002]豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌(ActionobacillusPleuropneumoniae,APP)引起的一種呼吸系統重要傳染病。本病主要引起豬的一種伴有胸膜炎的纖維素性、出血性、壞死性肺炎，多呈最急性或急性病程而迅速死亡，發病率和死亡率均在50%以上，它可發生于任何年齡的豬只，尤其是在集約化養豬場，一旦發生會造成重大經濟損失。
[0003]豬胸膜肺炎放線桿菌又稱為副溶血嗜血桿菌(H.parahaemoIyties),該病原菌生長要求嚴格，為革蘭氏陰性球桿菌，有莢膜。該病原菌血清型眾多，根據NAD依賴性，可以分為生物I型和生物II型，其中依賴NAD的豬胸膜肺炎放線桿菌劃為生物I型(Biovar I)，不依賴NAD的豬胸膜肺炎放線桿菌劃為生物II型(Biovar II)，采用傳統血清型方法，又可細分為15個血清型；其中生物I型包括血清1-12型和15型，生物II型包括血清13型和14型。豬胸膜肺炎病的病原血清型眾多，給豬胸膜肺炎病的預防與控制帶來了困難。
[0004]豬鏈球菌(Streptococcus suis)是條件致病菌,廣泛分布于自然界中，在動物的呼吸道、腸道、生殖道等處常在，可引起豬腦膜炎、關節炎、心內膜炎、敗血癥、肺炎和突然死亡，嚴重危害養豬業的發展。豬鏈球菌為革蘭氏陽性菌，可在外界環境中存活很長時間，特別是在糞便中及被污染的環境和帶菌豬是重要的傳染源，超急性死亡的豬只不出現任何癥狀。豬只不分品種、年齡和性別，一年四季都可以感染本病，哺乳和斷奶后仔豬發病死亡率高達80%以上，并有一定人畜共感染性。豬鏈球菌至少分為5種類型:急性敗血性、腦膜炎性、關節炎性、膿腫性和無乳型。
[0005]由于豬胸膜肺炎病血清型和豬鏈球菌的類型眾多，對兩種疾病共感染、同時發病的養殖場，沒有有效的應對措施，常常帶來巨大損失。

【發明內容】

[0006]有鑒于此，本發明的主要目的在于提供一種新型豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌病二聯多價滅活疫苗，包含至少一種已滅活的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原和至少一種豬鏈球菌抗原，以預防和治療豬胸膜肺炎病和豬鏈球菌引起的疾病。
[0007]豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原是指含有至少一種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原形式的任何組合物，所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原接種豬可誘導、刺激或增強抵抗豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌感染的免疫應答。豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌為包括本領域技術人員熟知的臨床分離的野毒株，包含目前已鑒定的I~15個血清型。優選地，所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原是完整的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌，優選為滅活形式，更優選，所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原是滅活的血清型為I型、5型和7型的混合抗原；最優選為滅活的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株，和滅活的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清5型YC株，和滅活的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清7型YS株。
[0008]本發明的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原還可以包含以下組合物的任一種抗原:如武漢科前動物生物制品有限責任公司的豬傳染性胸膜肺炎三價滅活疫苗(APP血清型I型、2型和7型)；中牧實業股份有限公司成都藥械廠的豬傳染性胸膜肺炎三價滅活疫苗(APP血清I型、2型和7型)。
[0009]正如本領域技術人員所知，不同的微生物野外分離株在基因序列上有微小的變異，然而，當變異不影響其蛋白質合成、結構或者主要作用功能區時，該微生物之他種野外分離株即使基因序列無法百分之百相同，其基本的生理功能并不會有所改變。因此，目前國際上常使用16S Ribosomal RNA (16S rRNA)來進行細菌型的分辨，因此在相似性的比較上可以用16S rRNA來進行比對而得到其同源性。所以，在16S rRNA具有同源性的前提下，本發明所使用的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原并不限定于本發明所使用的野外分離株。
[0010]16s rRNA基因是細菌染色體上編碼rRNA相對應的DNA序列，存在于所有細菌的染色體基因組中。16S rRNA具有高度的保守性和特異性以及該基因序列足夠長(包含約50個功能域)。
[0011]因此，本發明包括與豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌三株菌株(LC株、YC株和YS株)16S rRNA的同源性在80%上以上的菌株，更優選與LC株或YC株或YS株16S rRNA同源性在至少90%以上，優選地至少95%以上，更優選地至少95%~99%以上的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌菌株，即不改變豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌三株菌株(LC株、YC株和YS株)16SrRNA的前提下，本領域技術人員可以通過簡單的篩選或誘變本發明的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌，獲得與本發明豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌16S rRNA高度同源的菌株，并獲得相應地具有相同或相似免疫原性的抗原組合物。
[0012]豬鏈球菌抗原是指含有至少一種豬鏈球菌抗原形式的任何組合物，所述豬鏈球菌抗原接種豬可誘導、刺激或增強抵抗豬鏈球菌感染的免疫應答。豬鏈球菌為包括本領域技術人員熟知的臨床分離的野毒株，包含目前已鑒定的I~9個起致病作用的血清型。優選地，所述豬鏈球菌抗原是完整的豬鏈球菌，優選為滅活形式，更優選，所述豬鏈球菌抗原是滅活的血清型為2型和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種的混合抗原；最優選為滅活的豬鏈球菌血清2型SC株，和滅活的豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種。
[0013]本發明的豬鏈球菌抗原還可以包含以下組合物的任一種抗原:如武漢科前動物生物制品有限責任公司的豬鏈球菌病滅活疫苗(馬鏈球菌獸疫亞種+豬鏈球菌2型+豬鏈球菌7型)；上海海利生物技術股份有限公司的豬鏈球菌病滅活疫苗(馬鏈球菌獸疫亞種+豬鏈球菌2型)；廣東永順生物制藥有限公司的豬鏈球菌2型滅活疫苗；山東濱州華宏生物制品有限責任公司的豬鏈球菌病滅活疫苗(馬鏈球菌獸疫亞種+豬鏈球菌2型)。
[0014]還包括在16S rRNA具有同源性的前提下，本發明所使用的豬鏈球菌抗原并不限定于本發明所使用的野外分離株。本發明還包括與豬鏈球菌兩株菌株(SC株和馬鏈球菌獸疫亞種)16S rRNA的同源性在80%上以上的菌株，更優選與SC株或馬鏈球菌獸疫亞種16SrRNA同源性在至少90%以上，優選地至少95%以上，更優選地至少95%~99%以上的豬鏈球菌菌株，即不改變豬鏈球菌兩株菌株(SC株和馬鏈球菌獸疫亞種)16S rRNA的前提下，本領域技術人員可以通過簡單的篩選或誘變本發明的豬鏈球菌，獲得與本發明豬鏈球菌16SrRNA高度同源的菌株，并獲得相應地具有相同或相似免疫原性的抗原組合物。
[0015]發明人通過長期的研究和大量的試驗，發現目前豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌病缺少合適治療措施，特別是缺少合適的二聯疫苗的原因在于，豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的血清型眾多，和豬鏈球菌亞型和/或亞種眾多，制備針對豬傳染性胸膜肺炎或豬鏈球菌病的單苗中多價抗原之間就會相互干擾，從而影響其疫苗的總體免疫效果。但發明人在長期的研究和大量的試驗中，意外地發現了將豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的至少三種血清型，和豬鏈球菌至少兩種亞型或亞型聯用時，會減少抗原之間的相互影響；特別是當使用豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的三種血清型1、5、7型時，會顯著地減少抗原之間的影響，在減少抗原用量的同時，獲得良好的免疫原性，可以用于同時預防和治療豬傳染性胸膜肺炎和豬鏈球菌病。
[0016]更出乎意料地，發明人還獲得了 3株豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌和I株豬鏈球菌，與保藏號ATCC35246的豬鏈球菌配合使用，可以將抗原之間的相互干擾將至最低，而獲得一種具有良好的免疫原性的豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌病二聯滅活疫苗
[0017]基于上述發現，本發明的第一方面為提供豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌病二聯滅活疫苗，其含有豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清型的抗原和豬鏈球菌亞型或亞種的抗原。
[0018]優選地，本發明所述的二聯滅活疫苗為含有至少三種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清型的抗原和至少兩種豬鏈球菌亞型或亞種的抗原。更優選地，本發明所述的二聯滅活疫苗中，含有豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型、血清5型和血清7型的抗原；以及豬鏈球菌2型的抗原。
[0019]優選地，本發明所述的二聯滅活疫苗，含有豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、豬鏈球菌2型(R群)SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種的抗原。
[0020]優選地，本發明所述的二聯滅活疫苗，所述二聯滅活疫苗中抗原比例為:豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株:血清5型YC株:血清7型YS株:豬鏈球菌2型SC株:豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種=2:2:2:1:1。
[0021]優選地，本發明所述的二聯滅活疫苗，據權利要求4所述的二聯滅活疫苗，其特征在于，所述二聯滅活疫苗中抗原的含量為:滅活前豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型、血清5型、血清7型活菌數各自均不少于5.0XlO7CFU / mL，豬鏈球菌2型和馬鏈球菌獸疫亞種活菌數各自均不少于5X IO9CFU / mL ;或上述抗原總體積為所述疫苗總體積的75%~90%。
[0022]其次，目前在用于預防和治療豬傳染性胸膜肺炎或豬鏈球菌病的疫苗中，所用的佐劑為油性疫苗，這也是因為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的血清型眾多，和豬鏈球菌亞型和/或亞種眾多，在使用水性佐劑時，多價抗原之間就會相互干擾，從而影響其疫苗的總體免疫效果；而發明人通過大量實驗，意外地發現在本發明的上述二聯滅活疫苗中，加入水性佐劑并不會降低疫苗的免疫原性。
[0023]因此，本發明的第二方面在于提供含上述抗原的二聯滅活疫苗水性佐劑；即本發明所述的二聯滅活疫苗，還含有佐劑；更優選地，所述佐劑為水性佐劑；最優選地，所述水性佐劑選自Montanide GEL PR聚合物及其同系物的一種或幾種。
[0024]此外，本發 明的疫苗還可以含有防腐劑、免疫增強劑等公知的疫苗佐劑；優選地，本發明所述的二聯滅活疫苗，還含有疫苗總量0.01%的硫柳汞。
[0025]本發明的第三方面為提供上述發現中的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌和豬鏈球菌，其具有超強毒力及免疫原性，在疫苗制備過程中可使用較少的抗原量達到較好的免疫效果，從而降低生產及使用成本，具體為:
[0026]豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株，由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國典型培養物中心(簡稱CCTCC)進行保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏號為:CCTCC M 2011458，地址為中國武漢?武漢大學；豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清5型YC株，由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國典型培養物中心進行保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏號為=CCTCCM 2011459 ;豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清7型YS株，由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國典型培養物中心進行保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏號為=CCTCC M 2011460。
[0027]豬鏈球菌2型SC株，由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國典型培養物中心進行保藏，保藏日期:2011年10月12日，保藏號為:CCTCC M 2011351。
[0028]本發明的第三方面為提供了上述豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌病二聯滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟:
[0029]I)分別繁殖培養豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、豬鏈球菌；
[0030]2)滅活并以一定 比例混合；
[0031]3)加入佐劑和/或防腐劑；和/或免疫提高劑，既得豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌病二聯滅活疫苗的成品。
[0032]優選地，本發明的二聯滅活疫苗的制備方法，進一步包括以下步驟:
[0033]1.根據權利要求13所述的二聯滅活疫苗，其特征在于，所述步驟為:
[0034]⑴分別將豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、豬鏈球菌2型(R群)SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種菌種繁殖培養，得到豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、豬鏈球菌2型(R群)SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種菌液；
[0035]⑵分別將步驟⑴培養得到的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、豬鏈球菌2型(R群)SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種菌液中按各自總量加入0.2%的甲醛溶液，放置37°C滅活24h，期間攪拌3~5次，根據計數結果濃縮菌液；
[0036]⑶將上述已滅活、濃縮的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、豬鏈球菌2型(R群)SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種菌液，按2:2:2:1:1比例混合，并加入疫苗總量0.01%的硫柳汞，然后和佐劑進行乳化，佐劑含量為10%~25% ;成品豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌病二聯滅活疫苗抗原含量為滅活前豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型、血清5型、血清7型活菌數均不少于5.0X IO7CFU / mL，豬鏈球菌2型和馬鏈球菌獸疫亞種活菌數均不少于5 X IO9CFU / mL。
[0037]由上可見，本發明的二聯滅活疫苗可以用于預防和治療豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌病。
[0038]技術效果
[0039]本發明的至少有以下優點:[0040]1.本發明第一次解決了同時預防和治療豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌病的難題，克服了豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌和豬鏈球菌類型眾多引起相互配合的困難，提供了能夠具有良好免疫原性的抗原組合物；
[0041]2.本發明發現了 3株豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌和I株豬鏈球菌，幾種抗原配合使用，可以將抗原之間的相互干擾將至最低，而獲得一種具有良好的免疫原性的豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌病二聯滅活疫苗；
[0042]3.本發明使用了滅活的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1、5、7型與豬鏈球菌作為抗原，其具有超強毒力及免疫原性，在疫苗制備過程中可使用較少的抗原量達到較好的免疫效果，從而降低生產及使用成本，適宜大規模生產及養殖場中的應用；
[0043]4.本發明在疫苗的制備中，使用了中空纖維超濾器濃縮、生理鹽水懸浮的配苗菌液大大減少了毒素，優化工藝的同時，提高了疫苗的安全性。
[0044]5.本發明首先在豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌二聯滅活疫苗使用了水性佐劑，減少了使用油性佐劑免疫豬只而發生的應激反應，不僅符合當今豬用疫苗水性佐劑發展趨勢，減少了配苗過程中繁瑣的程序，并降低了人力物力的需求。代表了當今豬用疫苗新的發展趨勢，具有推廣潛力。
[0045]6.本發明的豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌二聯滅活疫苗，在與單苗相同生產成本及銷售價格的水平上，達到一針兩防的效果，可代替單苗使用，從而大大降低了免疫成本，具有商業上的成功潛力。
【具體實施方式】
[0046]本發明實施例中的具體實驗方法可參見《中華人民共和國獸藥典(二〇一〇年版)》及附錄。其他未注明的試劑或原料均可由本領域技術人員根據現有技術獲得。
[0047]下面結合具體實·施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0048]實施例1豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌二聯滅活疫苗的制備
[0049]1.菌種
[0050]豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株，由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國典型培養物中心進行保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏號為:CCTCC M 2011458。
[0051]豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清2型XT株，公開于中國專利CN102391975A，保藏號為:CCTCC NO M 2011410。
[0052]豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清5型YC株，由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國典型培養物中心進行保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏號為:CCTCC M2011459。
[0053]豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清7型YS株，由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國典型培養物中心進行保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏號為:CCTCC M2011460。[0054]豬鏈球菌2型SC株，由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國典型培養物中心進行保藏，保藏日期:2011年10月12日，保藏號為=CCTCC M2011351。
[0055]豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種，來自美國菌種保藏中心，保藏號ATCC35246。
[0056]為獲得免疫性強的菌種，各菌種經敏感豬體復壯鑒定合格后凍干保存并包藏。
[0057]2.豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌二聯滅活疫苗的制備
[0058]2.1.生產用種子的制備
[0059]豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、2型XT株、5型YC株、7型YS株凍干菌種，分別劃線接種于TSA/NAD (含5%小牛血清)平板上，置37°C培養16~24小時，選取符合要求的菌落，接種于TSB/NAD (含5%小牛血清)液體培養基中，37°C培養12~16小時，作為一級種子；豬鏈球菌2型SC株、C群馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株凍干菌種，分別劃線接種于Clumbia羊血平板上，置37°C培養18~24小時作為一級種子。
[0060]豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、2型XT株、5型YC株、7型YS株取一級種子的培養物，按0.1%的量加入TSB/NAD(含5%小牛血清)液體培養基中，37°C培養12~16小時，經檢驗純粹后作為二級種子；豬鏈球菌2型SC株、C群馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株分別選取符合要求的菌落，接種于含有15ml/L犢牛血清的改良馬丁肉湯培養基中，37°C靜置培養12~16小時，經羊血平板純粹檢驗合格后作為二級種子。
[0061]采用商售的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌培養基、豬鏈球菌培養基。
[0062]2.2.菌液的培養
[0063]在豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌培養基(商售TSB)中，加入0.01%~0.05%NAD、5%~10%的血清，將豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、2型XT株、5型YC株、7型YS株菌液分別按0.1%的量加進培養基中分別培養，混勻后置37°C培養16~18小時，當菌液的濃度0D600達到2.5以上、DO值開始上升、PH值降低到6.5以下時停止培養。
[0064]在豬鏈球菌培養基(商售改良馬丁肉湯)中，加入1.5%的L犢牛血清、0.1%~5%的葡萄糖，將豬鏈球菌2型SC株、C群馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株菌液分別按5%的量加進培養基中培養，混勻后置37°C培養16~18小時，當菌液濃度0D600達到2.5以上、DO值開始上升、PH值降低到6.0以下時停止培養。
[0065]2.3.滅活
[0066]向上述六種培養好的菌液中，按總量的0.2% (V/V)分別加入甲醛溶液，放置于37°C滅活24h，期間攪拌3~5次。
[0067]2.4.檢驗
[0068]取已經滅活的4種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌菌液分別取5mL接種于IOOmL含0.01%~0.05%NAD、5%~10%的血清的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌TSB培養基中，37°C培養24小時，再移植于上述IOOmL培養基中37°C培養24小時；取滅活的3種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌菌液0.5mL劃線接種于TSA/NAD平板培養基，37°C培養24小時。兩種方法培養后，均無菌生長。
[0069]取已經滅活的2種豬鏈球菌菌液分別5mL接種于IOOmL加入1.5%的L犢牛血清、0.1%~5%的葡萄糖改良馬丁肉湯培養基，37°C培養24小時，再移植于上述IOOmL培養基中37°C培養24小時；取已經 滅活的2種豬鏈球菌菌液0.5mL劃線接種于羊血瓊脂平板培養基，37°C培養24小時。兩種方法培養后，均無菌生長。[0070]取上述六種已滅活的菌液分別靜脈注射18~22g的Balb/C小鼠5只，每只0.2mL，三天內5/5健活，方為滅活徹底。[0071]3.豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌二聯滅活疫苗的配制
[0072]3.1.疫苗具體成分配比
[0073]現有的6種抗原成分(豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、2型XT株、5型YC株、7型YS株、豬鏈球菌2型SC株和C群馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株)可按照不同的搭配方式制成以下45種豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌二聯滅活疫苗。抗原總含量體積百分比在75%~90%，Montanide GEL PR佐劑占10%~25%，此處我們選擇抗原總含量最優體積百分比90% ,Montanide GEL PR佐劑最優體積百分比10%。豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、2型XT株、5型YC株和7型YS株各占總體積20%，豬鏈球菌2型SC株和C群馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株各占總體積10% ,Montanide GEL PR佐劑占總體積10%,抗原成分不足90%部分以PBS補足。
[0074]本次配苗使用的抗原滅活前活菌數分別為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株5.0X 109CFU/ml、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清2型XT株3.0X 109CFU/ml、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清5型YC株2.0X 109CFU/ml、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清7型YS株3.7X 109CFU/ml、豬鏈球菌2型SC株7.0 X 109CFU/ml和C群馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株8.0 X 109CFU/ml。配苗時疫苗中所含滅活前豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、血清2型XT株、血清5型YC株、血清7型YS株活菌數均調整為5.0X IO7CFU /mL，豬鏈球菌2型SC株和馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株活菌數均調整為5 X IO9CFU / mL。
[0075]表1疫苗具體成分配比
[0076]
【權利要求】
1.一種豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌病的二聯滅活疫苗，其特征在于，含有至少一種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗原和至少一種豬鏈球菌抗原。
2.根據權利要求1所述的二聯滅活疫苗，其特征在于，含有三種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清型抗原和兩種豬鏈球菌亞型或亞種抗原。
3.根據權利要求1所述的二聯滅活疫苗，其特征在于，所述二聯滅活疫苗含有豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型、血清5型和血清7型的抗原；以及豬鏈球菌2型和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種的抗原。
4.根據權利要求3所述的二聯滅活疫苗，其特征在于，所述二聯滅活疫苗含有豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、豬鏈球菌2型SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種的抗原。
5.根據權利要求4所述的二聯滅活疫苗，其特征在于，所述二聯滅活疫苗中抗原比例為:豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株:血清5型YC株:血清7型YS株:豬鏈球菌2型SC株:豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種=2:2:2:1:1。
6.根據權利要求4所述的二聯滅活疫苗，其特征在于，所述二聯滅活疫苗中抗原的含量為:滅活前的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型、血清5型、血清7型活菌數各自均不少于5.0X IO7CFU / mL，豬鏈球菌2型和馬鏈球菌獸疫亞種活菌數各自均不少于5 X IO9CFU / mL ;或上述抗原總體積為所述疫苗總體積的75%~90%。
7.根據權利要求1~6任意一項所述的二聯滅活疫苗，其特征在于，所述二聯滅活疫苗中含有佐劑。
8.根據權利要求7所述的二聯滅活疫苗，其特征在于，所述佐劑為水性佐劑。
9.根據權利要求8所述的二聯滅活疫苗,其特征在于,所述水性佐劑選自MontanideGEL PR聚合物及其同系物的一種或幾種。
10.一種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌，其特征在于，所述豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌分別為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株，保藏號為CCTCC M2011458 ;豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清5型YC株，保藏號為:CCTCC M 2011459 ;豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清7型YS株，保藏號為=CCTCC M 2011460。
11.一種豬鏈球菌，其特征在于，所述豬鏈球菌分別為豬鏈球菌2型SC株，保藏號為:CCTCC M 2011351。
12.—種豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌病的二聯滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟: O分別繁殖培養豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、豬鏈球菌； 2)滅活并以一定比例混合； 3)加入佐劑和/或防腐劑；和/或免疫提高劑，即得豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌病的二聯滅活疫苗的成品； 更優選地，所述步驟為: ⑴分別將豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、豬鏈球菌2型(R群)SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種菌種繁殖培養，得到豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、豬鏈球菌2型(R群)SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種菌液； ⑵分別將步驟⑴培養得到的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、豬鏈球菌2型(R群)SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種菌液中按各自總量加入0.2%的甲醛溶液，放置37°C滅活24h，期間攪拌3~5次，根據計數結果濃縮菌液； ⑶將上述已滅活、濃縮的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、豬鏈球菌2型(R群)SC株和豬鏈球菌C群馬鏈球菌獸疫亞種菌液，按2:2:2:1:1比例混合，并加入疫苗總量0.01%的硫柳汞，然后和佐劑進行乳化，佐劑含量為10%~25% ;成品豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌病二聯滅活疫苗抗原含量為滅活前豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清I型、血清5型、血清7型活菌數均不少于5.0X 1O7CFU / mL，豬鏈球菌2型和馬鏈球菌獸疫亞種活菌數均不少于5 X IO9CFU / mL。
13.如權利要求1-9任意一項所述的二聯滅活疫苗在制備預防和治療豬傳染性胸膜肺炎、豬鏈球菌病中藥物的應用。
【文檔編號】A61K39/116GK103566364SQ201210256034
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月23日 優先權日:2012年7月23日
【發明者】張許科, 孫進忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司