專利名稱：：蔗糖水解酶的突變體及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種蔗糖水解酶突變體，以及該突變體酶在蔗糖降解中的應用。技術背景蔗糖是植物中光合作用產生的可再生的碳水化合物，每年全球產量超過了5億噸(馬爾克斯·薩瓦亞·亞克，蔗糖乙醇的中巴合作，商務周刊，2009，1:72)。蔗糖水解酶(β-D-fructofuranosidefructohydrolase，EC3.2.1.洸)是一類把蔗糖水解成葡萄糖和果糖的水解酶。目前鑒定的蔗糖水解酶主要是來自植物和真菌如酵母禾口曲霉(LammensW.，etal，2008,CrystalstructuresofArabidopsisthalianacell-wallinvertasemutantsincomplexwithsucrose.J.Mol.Biol.,377378-385.)。蔴糖水角軍酶在生物體中具有不同的形式，根據最適pH值的范圍不同被分為三類，酸性、中性、堿性(Guimaraes,L.H.S.,etal.,Productionandcharacterizationofathermostableextracellular[beta]-d-fructofuranosidaseproducedbyAspergillusochraceuswithagroindustrialresiduesascarbonsources.EnzymeandMicrobialTechnology,2007.42(1)52-57.)。按照進化起源上，蔗糖水解酶可以分為兩類，酸性蔗糖水解酶是一類；中性和堿性又是一類(BocockP.N.，etal.，2008,EvolutionanddiversityofinvertasegenesinPopulustrichocarpa.Planta,227:565-576.)。酸性蔗糖水解酶是目前研究得最多的蔗糖水解酶，其中來自釀酒酵母的酸性蔗糖水解酶又是最受關注的(GoosenC.，etal.,2007，MolecularandbiochemicalcharacterizationofanovelintracellularinvertasefromAspergillusnigerwithtransfructosylatingactivity.Eukaryot.Cell，6674-681.DeLosAngelesCalixto-RomoM.,etal.，2008),Expression,purificationandimmobilizationoftheintracellularinvertaseINVA,fromZymomonasmobilisoncrystallinecelluloseandNylon-6.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.,351455-1463.)；而中、堿性蔗糖水解酶由于純化的難度以及酶蛋白不穩定，目前被研究的比較少(RoitschT.,etal.,2004,Functionandregulationofplantinvertasessweetsensations.TrendsPlantSci.,9:606-613.)。在食品工業許多產品的生產中，用于水解蔗糖的蔗糖水解酶的最適宜pH值通常是在中性的范圍內的Mema-SaldivarS.R.，etal.,2008，Productionofinvertsyruρfromsugarcanejuiceusingimmobilizedinvertase.USpatent7435564.)。目前，一些研究力、組正在尋找各種方法以提高蔗糖水解酶的最適pH值。Sanjar等人通過方式將蔗糖酶固定，成功地將酵母蔗糖水解酶的最適pH值從5.0提高到6.0(SanjarG.，etal.,2006，EnhancedpHandthermalstabilitiesofinvertaseimmobilizedonmontmorilloniteK-10.FoodChem.,94573-579.)。尋找適合于食品工業生產的新的中性蔗糖水解酶，提高水解蔗糖的速度，從而縮短發酵生產時間，對于降低利用蔗糖生產各種食品的生產成本具有十分重要的意義。
發明內容本發明的目的是通過對蔗糖水解酶的改造，使之獲得新的蔗糖水解酶突變體，這個突變體酶可用于蔗糖水解。本發明所述的新的蔗糖水解酶突變體Sinv2(SEQIDNO:1)，其是通過分子改造蔗糖水解酶基因inv2(GenBank序列號HQ267532)而得到的，具體是通過缺失inv2分子上的前360個堿基，改造得到一個新的蔗糖水解酶突變體。這個蔗糖水解酶突變體和原酶相比，水解蔗糖的活性獲得了1倍的提高，同時酶反應的最適pH值由酸性4.5變為中性6.0。SEQIDNO1的蛋白質是蔗糖水解酶突變體Sinv2，由466個氨基酸組成基酸序列如下序列特征長度466氨基酸類型多肽鏈型單鏈幾何結構立體分子類型蛋白質序列描述PheArgProGlyPheHisPheThrProGluTyrGlyTrpMetAsn151015AspProAsnGlyLeuValTyrLeuAspGlyGluTyrHisLeuPhe16202530TyrGlnTyrAsnProTyrGlyAsnArgTrpGlyAsnMetHisTrp31354045GlyHisAlaValSerThrAspLeuThrSerTrpThrTyrLeuPro46505560ThrAlalieGluProAspLysLeuGlyAspliePheSerGlySer61657075AlaValValAspSerThrAsnSerAlaGlyPheGlyLysAsnAla76808590LeulieAlalieTyrThrAlaAsnGlyAlaThrGlnGlnGlnCys9195100105lieAlaTyrSerlieAspLysGlyArgThrPheThrLysTyrGlu106110115120LysAsnProValLeuProAsnProGlylieLysAspPheArgAsp121125130135ProLysValHisTrpAsnGluGlnAlaLysGlnTrpValMetAla136140145150LeuAlaThrGlnGlnThrlieThrPhePheGlySerProAspLeu151155160165LysAsnTrpThrArgLeuSerGluPheGlyLysAsnTyrGlyAla166170175180HisGlyGlyValTrpGluCysProAspLeuPheProLeuGlu181185190GluGlyLysThrLysTrpValLeuLeuValSerlieAsnPro196200205GlyProAsnGlyGlySerAlaThrGlnTyrPhelieGlyAsp211215220AspGlyLysThrPheSerAlaAspProLeuProTyrProLeu226230235ValAspTyrGlyArgAspAspTyrAlaGlyValThrPheSer241245250IleGlyLysAsnAspGlyArgArgliePheMetGlyTrpMet256260265AsnTrpAspTyrAlaAsnAspValProThrLysSerPheArg271275280AlaMetThrLeuProArgGluLeuLysLeuAlaSerAsnGly286290295HisLeulieLeuThrSerAlaProValSerGluValThrLys301305310ArgGlyLysSerGlyGluThrlieAsnlieLeuValAsnSer316320325LysSerlieThrAsnValLeuGlnAspPheAsnGlyLysPhe331335340LeuAsnMetThrlieGlnArgLysAspAlaLysValTrpGly346350355GlyLeuLysAsnGluLeuGlyAspTyrLeuAsnPheThrPhe361365370TrpGluGlnLyslieLeuLysValAspArgArgAsnThrGly376380385LysGluPheSerGlnLysPheAlaThrGluProPheAlaPro391395400AlaLysHisAspSerTyrThrlieArgLeuPheMetAspLys406410415SerSerGluliePhelieAsnAspGlyGluThrValLeuThr421425430LeuValPheProSerGlnThrTyrLysSerLeuThrPhePhe436440445AlaAsnLysProTrpAsnValGluAsnLeuLysliePheGlu451455460Lys()Phe195Gly210Phe225Trp240Asn255Ser270Asn285Gln300Leu315Glu330Glu345Phe360Asp375Ile390Leu405Ala420Asn435Thr450Ile465466本發明還涉及含有本發明蔗糖水解酶突變體的宿主。本發明所述的新的蔗糖水解酶突變體，該突變體酶在蔗糖的降解中具有廣泛的用途。其特殊在于它的最適pH變為中性同時水解蔗糖的能力提高1倍，該突變體蛋白質可用于蔗糖的降解。本發明所述的新的蔗糖水解酶突變體的制備方法包括蔗糖水解酶基因的克隆、蔗糖水解酶突變體基因的獲得、蔗糖水解酶突變體基因的表達和純化以及蔗糖水解酶突變體水解蔗糖酶活的測定等步驟，具體如下1)蔗糖水解酶基因inv2的克隆使用上游引物inv-Ι5，-CACTCATGATGCACCACCACCACCACCACAATAGACAGATGAATCCAGGTC-3’(包含一個PagI酶切位點和一個6xHis標簽在5’末端)和下游引物inv-25，-CACCTGCAGACGATGATTTCACAGATGCAAGC-3，(包含一個PstI酶切位點)，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增蔗糖水解酶基因inv2，用限制性內切酶PagI和PstI酶切蔗糖水解酶基因inv2后，插入到經NcoI和PstI酶切的表達載體pSE380進行連接。獲得的重組質粒命名為pSE-inv2。2)蔗糖水解酶突變體基因Sinv2的獲得Sinv2基因是根據inv2基因序列信息從inv2基因的361位堿基開始設計引物來進行改造。以1)中構建的pSE-inv2為模板，使用上游引物Sinv:5，-CACTCATGATGCACCACCACCACCACCACTTTCGACCTGGATTTCATTTC-3，(包含一個PiigI酶切位點和一個6xHis標簽在5’末端)和下游引物inv-2進行PCR，PCR反應程序第一步950C2分鐘；第二步進行30個循環，循環為98°C10秒，15秒，72°C1.5分鐘；第三步72°C10分鐘。PCR產物用限制性內切酶PagI和PstI酶切后，插入到經NcoI和PstI酶切的表達載體pSE380，轉化到XLl-Blue感受態細胞(CaC12化學法轉化)。然后進行DNA測序分析確定正確的轉化子。3)蔗糖水解酶突變體基因Sinv2的表達和表達產物的純化將含有質粒pSE-Sinv2的重組大腸桿菌菌株接種、培養基、超聲波破胞、離心、純化、層析、洗脫，收集洗脫的蛋白質溶液，驗證，發現有一條目的大小的蛋白質條市ο4)蔗糖水解酶突變體Sinv2水解蔗糖酶活的測定將蔗糖水解酶突變體Sinv2純化物，加入DNS溶液溶解，加入試劑混合，放置沸水中反應，室溫冷卻，用分光光度計測吸光度OD_。利用吸光度測定值來計算酶活。將獲得的突變前的Inv2和突變后的Sinv2的酶活和最適pH的實驗數據作圖。結果發現蔗糖水解酶突變體Sinv2的最適pH值由4.5提高到6.0，同時水解蔗糖的酶活提高1倍。具體實施方式下述實施方法是為了更好的解釋本發明，而不應該被解釋為限制本發明的目的。在本發明的實施例中所用到的材料包括大腸桿菌CEscherichiacoli)株系XLl-Blue(購自TaKaRa公司)；載體為購自bitrivogen公司的表達載體pSE380；購自Intrivogen公司的Ni-NTA蛋白質組氨酸純化介質；購自TaKaRa、MBI的限制性內切酶、修飾酶。下面將通過實施例對本發明作詳細描述1)蔗糖水解酶基因inv2的克隆使用上游引物inv-15，-CACTCATGATGCACCACCACCACCACCACAATAGACAGATGAATCCAGGTC-3，(包含一個PiigI酶切位點和一個6xHis標簽在5，末端)和下游引物inv-25，-CACCTGCAGACGATGATTTCACAGATGCAAGC-3，(包含一個PstI酶切位點)，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增蔗糖水解酶基因inv2，用限制性內切酶PagI和PstI酶切蔗糖水解酶基因inv2后，插入到經NcoI和PstI酶切的表達載體pSE380進行連接。獲得的重組質粒命名為pSE-inv2。2)蔗糖水解酶突變體基因Sinv2的獲得Sinv2基因是根據inv2基因序列信息從inv2基因的361位堿基開始設計引物來進行改造。以1)中構建的pSE_inv2為模板，使用上游引物Sinv:5，-CACTCATGATGCACCACCACCACCACCACTTTCGACCTGGATTTCATTTC-3，(包含一個PiigI酶切位點和一個6xHis標簽在5’末端)和下游引物inv-2進行PCR，PCR反應程序第一步95°C2分鐘；第二步進行30個循環，循環為98°C10秒，M°C15秒，72°C1.5分鐘；第三步720C10分鐘。PCR產物用限制性內切酶PiigI和PstI酶切后，插入到經NcoI和PstI酶切的表達載體pSE380，轉化到XLl-Blue感受態細胞(CaC12化學法轉化)。轉化產物克隆送交上海生物工程有限公司進行DNA測序分析確定正確的轉化子。3)蔗糖水解酶突變體基因Sinv2的表達和表達產物的純化將含有質粒pSE-Sinv2的重組大腸桿菌XLl-Blue菌株接種到20mL含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB培養基中，37°C振蕩培養，待OD6tltl為0.6時，加入IPTG(終濃度為lmmol/L)30°C誘導10小時。11000轉離心3ηι，收集菌體，用4mL裂解緩沖液(50mmol/LNaH2P04,300mmol/LNaCl,10mmol/L咪唑，pH8.0)重懸菌體，超聲波破胞9ηι。12000轉離心ΙΟηι，取上清進行后面的蛋白質純化。按每4ml上清液加入ImL50%的鎳親和層析膠體，在4°C用200轉搖60分鐘，把混合物灌注到柱子，收集流出物。力ΠIml沖洗緩沖液(50mmol/LNaH2PO4,300mmol/LNaCl,20mmol/L咪唑，pH8.0)到柱子里，緩慢攪拌，收集流出物。重復沖洗步驟4次。加入洗脫緩沖液(50mmol/LNaH2PO4,300mmol/LNaCl,250mmol/L咪唑，pH8.0)洗脫蛋白質。收集洗脫的蛋白質溶液，用變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳MDS-PAG^驗證，發現有一條目的大小的蛋白質條帶。4)蔗糖水解酶突變體Sinv2水解蔗糖酶活的測定取5μL蔗糖水解酶突變體Sinv2純化物，加入500μL1%(w/v)蔗糖(溶于pH7.0、100mmol/L的磷酸緩沖液中)溶液混合，在45°C作用30分鐘后，加入ImLDNS溶液[DNS試劑配制稱取1克氫氧化鈉用約40mL雙蒸水溶解，再稱取1克二硝基水楊酸、0.2克苯酚、0.05克無水亞硫酸鈉、20克四水酒石酸鉀鈉，將其溶解于約30mL雙蒸水中，兩種溶液混合，定容到lOOmL。]，放置沸水中反應5分鐘，室溫冷卻，用分光光度計測吸光度OD600。利用吸光度測定值來計算酶活。將獲得的突變前的Inv2和突變后的Sinv2的酶活和最適pH的實驗數據作圖。結果發現蔗糖水解酶突變體Sinv2的最適pH值由4.5提高到6.0，同時水解蔗糖的酶活提高1倍。圖1是蔗糖水解酶突變體Sinv2純化物的SDS-PAGE圖。圖2是蔗糖水解酶突變前后(Inv2和Sinv2)酶活及最適pH的比較圖。從圖1了解到，蔗糖水解酶突變體Sinv2純化物的分子量為51kDa。從圖2了解到，蔗糖水解酶突變前后(Inv2和SiiiW)酶活發生了顯著的變化突變后Sinv2的酶活是突變前Inv2的2倍；突變前最適pH為酸性4.5，突變后最適pH為中性6。提高水解蔗糖的速度，從而縮短發酵生產時間，對于降低利用蔗糖生產各種食品的生產成本具有十分重要的意義。權利要求1.一種蔗糖水解酶突變體，(1)序列特征i.長度466氨基酸ii.類型多肽iii.鏈型單鏈iv.幾何結構立體⑵分子類型蛋白質(3)序列描述PheArgProGly其特征在于具有SEQIDNO1氨基酸序列Asp16Tyr31Gly46Thr61Ala76Leu91Ile106Lys121Pro136Leu151Lys166His181Glu196Gly211AspProGlnHisAlaVallieAlaAsnLysAlaAsnGlyGlyProGlyAsnTyrAlalieValAlaTyrProValGlyAsnValGluAsplieSerValThrTrpGlyLysAsnLysHisGlnThrValThrGlyThrPhe5Leu20Pro35Ser50Pro65Ser80Tyr95lie110Leu125Trp140Gln155Arg170Trp185Lys200Gly215PheHisValTyrThrAspThrThrAspProAsnThrPheTyrGlyAspLysAsnAlaLysAsnGlulieGluTrpSerSerThrProLeuAspLeuSerCysValAlaAlaAsnLeuLeuSerAsnGlyProGlnThrGluProArgThrGlyAlaGlyArgGlyAlaPhePheAspLeuLeuThrAspGlnPro2Glu10Gly25Trp40Ser55Asp70Gly85Ala100Thr115lie130Lys145Phe160Gly175Leu190Val205Tyr220LeuTyrGluGlyTrpliePheThrPheLysGlnGlyLysPheSerGlyTyrAsnThrPheGlyGlnThrAspTrpTrpMetHisLeuMetHisTyrLeuGlySerLysGlnLysPheValSerProAsnTyrProLeuAsnGlnTyrArgMetAspGlyGluProlieAsnPhelieGlyAspProTyrProLeuAsn15Phe30Trp45Pro60Ser75Ala90Cys105Glu120Asp135Ala150Leu165Ala180Phe195Gly210Phe225Trp226230235240ValAspTyrGlyArgAspAspTyrAlaGlyValThrPheSerAsn241245250255lieGlyLysAsnAspGlyArgArgliePheMetGlyTrpMetSer256260265270AsnTrpAspTyrAlaAsnAspValProThrLysSerPheArgAsn271275280285AlaMetThrLeuProArgGluLeuLysLeuAlaSerAsnGlyGln286290295300HisLeulieLeuThrSerAlaProValSerGluValThrLysLeu301305310315ArgGlyLysSerGlyGluThrlieAsnlieLeuValAsnSerGlu316320325330LysSerlieThrAsnValLeuGlnAspPheAsnGlyLysPheGlu331335340345LeuAsnMetThrlieGlnArgLysAspAlaLysValTrpGlyPhe346350355360GlyLeuLysAsnGluLeuGlyAspTyrLeuAsnPheThrPheAsp361365370375TrpGluGlnLyslieLeuLysValAspArgArgAsnThrGlylie376380385390LysGluPheSerGlnLysPheAlaThrGluProPheAlaProLeu391395400405AlaLysHisAspSerTyrThrlieArgLeuPheMetAspLysAla406410415420SerSerGluliePhelieAsnAspGlyGluThrValLeuThrAsn421425430435LeuValPheProSerGlnThrTyrLysSerLeuThrPhePheThr436440445450AlaAsnLysProTrpAsnValGluAsnLeuLysliePheGlulie451455460465Lys04662.一種宿主細胞，其是含有權利要求1所述蔗糖水解酶突變體的原核細胞或真核細胞。3.權利要求1所述的突變體蛋白質在蔗糖降解和對含蔗糖材料的處理中的應用。全文摘要本發明涉及一種蔗糖水解酶的突變體Sinv2，其特征在于含有SEQIDNO1的氨基酸序列。這個突變體酶相對于突變前的酶具有中性的最適pH值和更高的水解蔗糖的功能。本發明含涉及該蔗糖水解酶突變體(SEQIDNO1)在降解蔗糖中的應用。文檔編號C12N15/56GK102021156SQ20101050690公開日2011年4月20日申請日期2010年10月14日優先權日2010年10月14日發明者左文樸,龐浩,裴建新,黃志民,黃日波,黎貞崇申請人:廣西科學院