一種新瓊二糖水解酶及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明的目的在于提供一種新瓊二糖水解酶，其氨基酸序列為SEQ?IDNO:1；本發明的新瓊二糖水解酶能夠降解新瓊二糖產生L-3，6-內醚半乳糖(L-AHG)和D-半乳糖，因此可以用于純的L-3，6-內醚半乳糖的制備。新瓊二糖水解酶作為一種的可以生產L-AHG的生物催化劑，因其反應環境友好，催化活性高，對比化學方法有著一定優勢，其具有良好的應用潛力和前景。L-AHG作為內醚糖的一種，有很好的美白和抗炎活性，在醫藥和化妝品方面有很好的潛在應用價值。本發明的大腸桿菌重組株，pETNA/BL21所表達的重組瓊膠酶占總蛋白的28%，表達水平高，易于純化，且連續傳代后表達量未有所降低。所以可以通過本發明大量制備重組新瓊二糖水解酶和L-3，6-內醚半乳糖。
【專利說明】一種新瓊二糖水解酶及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于功能基因篩選【技術領域】，具體涉及一種新瓊二糖水解酶及應用。
技術背景
[0002]新瓊二糖水解酶是一種降解新瓊二糖的水解酶，水解斷裂新瓊二糖的α -1, 3鍵，生成L-3，6-內醚半乳糖(L-AHG)和D-半乳糖。新瓊二糖是某些瓊膠酶水解瓊膠的水解產物。L-AHG自然存在是作為瓊脂糖中L-AHG和半乳糖的更替單元的一個單體，而瓊脂糖是紅色巨藻的主要組成成分(Rhodophyta)。迄今為止，即使是以試劑的形式，L-AHG沒有市售，亦沒有化學合成的報道。L-AHG作為內醚糖的一種，有很好的美白和抗炎活性，在醫藥和化妝品方面有很好的潛在應用價值。新瓊二糖水解酶作為一種的可以生產L-AHG的生物催化劑，因其反應環境友好，催化活性高，對比化學方法有著一定優勢，其具有良好的應用潛力和iu景。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于提供一種新瓊二糖水解酶及其應用，從而彌補現有技術的不足。
[0004]本發明的新瓊二糖水解酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1 ；
[0005]編碼上述新瓊二糖水解酶的基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID NO:2 ；
[0006]本發明還提供一種重組表達載體，用于表達氨基酸序列為SEQ ID NO:1的新瓊二糖水解酶；
[0007]本發明的新瓊二糖水解酶用于降解新瓊2糖來制備L-3，6_內醚半乳糖。
[0008]本發明的新瓊二糖水解酶能夠降解新瓊二糖產生L-3，6_內醚半乳糖(L-AHG)和D-半乳糖，因此可以用于純的L-3，6-內醚半乳糖的制備。新瓊二糖水解酶作為一種可以生產L-AHG的生物催化劑，因其反應環境友好，催化活性高，對比化學方法有著較大優勢，其具有良好的應用潛力和前景；該方法不僅避免了傳統制備方法中強酸的使用帶來的環境污染，而且避免了強酸過度降解L-AHG產生5-羥基-甲基糠醛(HMF)等毒副產物，因此，具有重要的開發價值。L-AHG作為內醚糖的一種，有很好的美白和抗炎活性，在醫藥和化妝品方面有很好的潛在應用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1:本發明的新瓊二糖水解酶親和層系后的純酶SDS-PAGE電泳圖，M為Marker。
[0010]圖2:本發明的新瓊二糖水解酶水解產物TLC結果，表明新瓊二糖被水解為L-3，6-內醚半乳糖和D-半乳糖新瓊四糖被水解為L-3，6-內醚半乳糖和瓊三糖；其中I為新瓊二糖水解產物，2為新瓊四糖水解產物。
[0011]圖3:本發明的新瓊二糖水解酶，pH變化對相對酶活的影響(數據均為最少三次重復取平均值)[0012]圖4:本發明的新瓊二糖水解酶，溫度變化對相對酶活的影響(數據均為最少三次重復取平均值)，代表熱穩定性，代表最適溫度。
【具體實施方式】
[0013]下面結合實例對本發明的方法做進一步說明。但實施例中所用到的實驗條件可以根據已有技術進行選擇。對于實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常可按常規條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運行。
[0014]對于本發明中的術語解釋如下:
[0015]1、新瓊二糖水解酶:糖苷水解酶，以新瓊二糖為底物水解，產物為L-3，6_內醚半乳糖(L-AHG)和D-半乳糖兩種單糖。
[0016]2、新瓊2糖:兩種單糖L-3，6_內醚半乳糖(AHG)和D-半乳糖(D-Gal) α-1，3鍵連接形成的二糖 。
[0017]3、L-3，6_內醚半乳糖:3，6位羥基脫水形成內醚鍵的L型半乳糖。
[0018]實施例1新瓊二糖水解酶基因的克隆
[0019]用簡并引物PCR以及巢式PCR克隆淡黃色噬瓊膠菌WH0801(=NRRLB-59247(T)=CGMCC1.10131 (T))中的新瓊二糖水解酶基因。具體操作:在2216E海水培養基中培養淡黃色噬瓊膠菌WH0801直到對數末期，提取DNA基因組。利用特定簡并引物來進行擴增，簡并引物的序列如下:5’ -GGYDCSTAYGATGATCGYAGCGTKTTYACC-3’ ； 5’ -GGTRTITTKTTCCGGRCCATCGGTG-3’，以基因組為模板，條件為:94°C 5分鐘，然后94°C 30秒，55°C 30秒，72°C I分鐘3個步驟進行30個循環，進行PCR，得到了產物為新瓊二糖水解酶基因的片段，再以片段末端序列設計引物，進行一次三輪的巢式PCR回收其中大小在500Kb-2000Kb的PCR產物片段(利用takara公司染色體步移試劑盒)。其中各步驟中的PCR產物均連接T-A克隆載體后轉化DH5a挑去單克隆測序。最后拼接最初的片段和巢式PCR所得基因片段，得到新瓊二糖水解酶基因的全長序列，其核苷酸序列為SEQ ID NO:2，編碼的新瓊二糖水解酶的氨基酸序列為SEQ ID NO:1。用全長序列以全長序列上游引物和下游引物(5’-CCGGAATTCATGACATTTACTAAAAGC-3’ ； 5’ -CGAGCTCTITTTGTAACGCAGATTATATAGATC-3’)從 DNA 中進行擴增，多次測序結果表明全長片段測序確定序列無誤。新瓊二糖水解酶基因和NCBI中已知表征的基因相比對，和已結晶來源于Saccharophagus Degradans2_40的新瓊二糖水解酶基因相似性為74%。說明在序列上此新瓊二糖水解酶基因為一個全新的基因。
[0020]實施例2含新瓊二糖水解酶基因表達質粒pETNA的構建
[0021]根據新瓊二糖水解酶基因的全長序列設計基因的上游引物和下游引物(見實施例
1)，以淡黃色噬瓊膠菌WH0801的基因組為模板，利用PCR擴增得到新瓊二糖水解酶基因的全長序列。條件為94°C 2分鐘，然后94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 1.5分鐘，30個循環最后72°C延伸10分鐘。瓊脂糖凝膠電泳顯示在1.0kb的位置有明顯單一條帶，將單一條帶切膠回收，并用Xhol和BamHl雙酶切，將表達載體pET21a也用Xhol和BamHl雙酶切，然后PCR產物和酶切載體都利用試劑盒進行DNA純化。然后按一定摩爾比例進行DNA連接反應。連接結束后，按照標準的氯化鈣法熱激轉化將重組質粒轉入DH5 α，篩選具有氨芐青霉素抗性的陽性轉化子。用標準堿裂解法提取質粒，將質粒用Xhol和BamHl雙酶切，凝膠電泳條帶顯示為1.0Kb和5.3Kb兩條清晰條帶和新瓊二糖水解酶基因全長和質粒長度相對應。證明新瓊二糖水解酶基因全長序列已經克隆到表達載體中，將此重組質粒命名為PETNA。 [0022]實施例3高效表達新瓊二糖水解酶基因NABHwh的工程菌pETNA/BL21的構建
[0023]將表達載體質粒pETna按照標準氯化鈣熱激轉化轉入BL21 (DE3)中，篩選具有氨芐青霉素抗性的陽性轉化子。用標準堿裂解法提取質粒，將質粒用Xhol和BamHl雙酶切，凝膠電泳條帶顯示為1.0Kb和5.3Kb兩條清晰條帶和新瓊二糖水解酶基因全長和質粒長度相對應。證明含有新瓊二糖水解酶基因的表達載體質粒pETNA已經轉入BL21 (DE3)。
[0024]實施例4利用大腸桿菌工程菌pETNA/BL21制備重組新瓊二糖水解酶
[0025]挑取大腸桿菌重組株PETNA/BL21單克隆接種在5ml含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37°C，230RPM培養12小時。按1:100轉接入IOOml含有氨芐青霉素的液體LB培養基。37°C培養OD值600到0.6，加入IPTG至終濃度為ImM，繼續培養8小時。4°C，8000g離心10分鐘，細胞重懸于20mM pH=8.0Tirs-鹽酸緩沖液，將菌懸液置于冰上，超聲破碎15分鐘，12000gl5分鐘除去不可溶成分,上清過0.22um濾膜,上親和層析柱fastflow his*6(GE)，然后用沖洗緩沖液lml+lml和洗脫緩沖液0.5ml*4沖洗柱子6次，將得到的溶液分別SDS-PAGE檢測，合并含有單一目的條帶的洗脫液(圖1)。用Lowry法測定蛋白濃度，終濃度約為 0.3mg/ml。
[0026]實施例5測定重組新瓊二糖水解酶最適反應條件
[0027]利用高效液相色譜測定新瓊二糖水解酶反應液中的新瓊二糖含量，反應條件為:測定最適pH時，30度時，在4.0-10.0的pH范圍內進行反應。測定最適溫度時，pH=6.0時在20-80度反應。體系為0.1%新瓊二糖99uL加入IuL酶液，反應10分鐘，2分鐘沸水浴滅活。以.1%新瓊二糖為標樣。測定條件為:WatersSugar-Pak I柱子，流動相為50mg/LEDTA鈣水溶液，流速為0.5mL/min。結果如圖3，圖4所示，重組新瓊二糖水解酶的相對活性在30度和pH=6時達到峰值，其在70度或在pH=9反應時仍保有大于40%的活性，所以最適反應溫度為30度，最適pH值為6.0。以此結果確定重組新瓊二糖水解酶的最適反應條件。
[0028]實施例6利用重組新瓊二糖水解酶生產L-3，6-內醚半乳糖
[0029]利用重組新瓊二糖水解酶生產L-3，6_內醚半乳糖時，將新瓊二糖溶于pH=6.0的磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液(0.05M/ml)，配置成0.1-0.5%的溶液。按重量比0.1-1:100加入實施例4的重組新瓊二糖水解酶溶液。混合均勻后在30度為溫浴12-48小時。濃縮至小于Iml上硅膠色譜柱，以正丁醇，乙醇，水(3:1:1)為流動相過柱，以薄層層析為檢測手段，第一個流出的糖峰為L-3，6-內醚半乳糖。收集，濃縮，得到L-3，6-內醚半乳糖(圖2)。本新瓊二糖水解酶具有良好的生物催化活性，催化活性和溫度穩定性和已知的新瓊二糖水解酶相比均有優勢，在60°C反應時，還保有一定的生物學活性。此重組酶可將新瓊二糖完全水解，經過硅膠層析的L-3，6-內醚半乳糖純度約為80%，產率為45%。綜上此新瓊二糖水解酶具有生產L-3，6-內醚半乳糖的工業應用潛力。
【權利要求】
1.一種新瓊二糖水解酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1。
2.一種編碼權利要求1所述的新瓊二糖水解酶的基因，其核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
3.—種重組表達載體，所述的重組表達載體用于表達權利要求1所述的新瓊二糖水解酶。
4.一種轉化體，所述的轉化體攜帶有權利要求3所述的重組表達載體。
5.權利要求1所述的新瓊二糖水解酶在降解新瓊2糖來制備L-3，6-內醚半乳糖中的應用。
6.權利要求4所述的.轉化體在降解新瓊2糖來制備L-3，6-內醚半乳糖中的應用。
【文檔編號】C12N15/56GK103468661SQ201310464165
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年10月8日 優先權日:2013年10月8日
【發明者】毛相朝, 劉楠, 楊孟, 魏東芝 申請人:中國海洋大學