專利名稱：一種檢測原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測原料乳中細菌的方法。
背景技術：
蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)是一種革蘭式陽性菌，能形成芽孢，因此廣泛存在于自然界中，其中一些菌株極易污染食物從而引起食物中毒，特別是在蛋白質和碳水化合物含量豐富的食品中，如肉類、米飯中，尤其是原料乳和乳制品中。原料乳作為一種廣泛食用并且很多乳制品加工的原輔料，是人類非常理性的營養食品之一，隨著人們生活水平的逐步提高，人們對乳及乳制品的需求也在以較高的速度增長，然而由于蠟樣芽孢桿菌對原料乳的污染造成人群食物中毒的事件卻頻頻發生。因此，為提高食品的安全性，對原料乳及乳制品中致病性蠟樣芽孢桿菌的檢測勢在必行。傳統的檢測蠟樣芽孢桿菌的方法主要采用生化方法，這種方法費時費力，且靈敏度不高；隨著科學技術的發展，現在已經建立了分子生物學檢測水平的基因檢測技術，如 PCR和LAMP技術，但這些技術大都采用預增菌來獲得足夠的菌體，在預增菌步驟后再進行 PCR檢測，能夠達到很低的檢出限，然而預增菌步驟一般需要10-14h，耗時長，增加了檢測時間及檢測成本，并且LAMP技術極易污染，不能保證結果的準確度。隨著我國乳制品行業的快速發展，原料乳及乳制品的安全性也受到越來越多的重視。因此，現在急需一種能夠快速檢測原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法。
發明內容
本發明的目的是為了解決傳統的蠟樣芽孢桿菌檢測方法費時費力、靈敏度低以及現有的基因檢測技術必須進行預增菌，無法快速檢測原料乳中蠟樣芽孢桿菌并且易污染的問題，而提供的一種快速檢測原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法。本發明一種檢測原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法按以下步驟實現一、將待檢測的原料乳離心進行脫脂；二、將脫脂乳與EDTA-Na溶液以5-7 1的比例向脫脂乳中加入體積濃度為60%的EDTA-Na溶液，在37°C的溫度下水浴20-30min ；三、將水浴后的樣品進行無菌過濾；四、用生理鹽水洗脫濾膜上的菌體，離心2次后棄掉上清，收集菌體；五、利用細菌DNA提取試劑盒提取菌體基因組DNA作為模板，進行Real Time RT-PCR檢測，根據擴增曲線和融解曲線進行分析；即得到檢測結果；其中步驟五中20ul反應體系由IOul的 2 X SYBR buffer,2. Oul的DNA模板、1. Oul的引物和7. Oul的滅菌雙蒸水組成；擴增反應條件為預變性95°C 30s，變性95°C 5s，退火60°C 35s，共40個循環；蠟樣芽孢桿菌上游引物為 5，-AGTTCGTAGCCTATGCCGT-3，，下游引物為 5，-GGCTTATTCGCTATGCG-3，。本發明采用的蠟樣芽孢桿菌引物為根據蠟樣芽孢桿菌腸毒素基因(entFM)設計的特異性引物。本發明操作簡單、省時，檢測的全部操作時間在證以內；本發明不需要預增菌，具有快速的優點；本發明采用離心脫脂后用EDTA鹽溶液處理原料乳中的蛋白質，鼠酪蛋白膠束解離成小分子單體，能夠快速過濾原料乳中的菌體；本發明對蠟樣芽孢桿菌的致病基因進行了引物設計，針對性強、特異性好。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式檢測原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法按以下步驟實現一、將待檢測的原料乳離心進行脫脂；二、將脫脂乳與EDTA-Na溶液以5-7 1的比例向脫脂乳中加入體積濃度為60%的EDTA-Na溶液，在37 °C的溫度下水浴20-30min ；三、將水浴后的樣品進行無菌過濾；四、用生理鹽水洗脫濾膜上的菌體，離心2次后棄掉上清，收集菌體；五、利用細菌DNA提取試劑盒提取菌體基因組DNA作為模板，進行Real Time RT-PCR 檢測，根據擴增曲線和融解曲線進行分析；即得到檢測結果；其中步驟五中20ul反應體系由IOul的2 X SYBR buffer,2. Oul的DNA模板、1. Oul的引物和7. Oul的滅菌雙蒸水組成； 擴增反應條件為預變性95°C 30s，變性95°C 5s，退火60°C 35s，共40個循環；蠟樣芽孢桿菌上游引物為 5’ -AGTTCGTAGCCTATGCCGT-3，，下游引物為 5’ -GGCTTATTCGCTATGCG-3，。本實施方式中EDTA-Na溶液為市售的常規試劑。本實施方式無擴增曲線說明檢測的原料乳中不含蠟樣芽孢桿菌；有擴增曲線說明被檢測的原料乳中含有蠟樣芽孢桿菌。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中離心是在 3000g的條件下離心20min。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中將脫脂乳與 EDTA-Na溶液以6 1的比例向脫脂乳中加入體積濃度為60%的EDTA-Na溶液。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中脫脂乳在 37°C的溫度下水浴25min。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟三中水浴后的脫脂乳利用0. 22um孔徑的蔡氏濾器進行無菌過濾。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟四中洗脫液是在 9000g的條件下離心15min。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
七本實施方式檢測原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法按以下步驟實現一、將待檢測的原料乳進行脫脂將待測原料乳在3000g的條件下離心20min進行脫脂；二、將脫脂乳與EDTA-Na溶液以6 1的比例向脫脂乳中加入體積濃度為60%的 EDTA-Na溶液，在37 °C的溫度下水浴25min ；三、采用0. 22um孔徑的蔡氏濾器在無菌條件下對水浴后的脫脂乳進行過濾將水浴后的樣品進行無菌過濾；四、將濾膜四成碎塊，用生理鹽水在渦旋振蕩器上進行震蕩，洗脫濾膜上的菌體，然后在9000g的條件下離心洗脫液 15min，棄去上清，用磷酸鹽緩沖液重懸沉淀，9000g的條件下離心洗脫液15min，棄掉上清后收集菌體；五、利用細菌DNA提取試劑盒提取菌體基因組DNA作為模板，進行Real Time RT-PCR 檢測，20ulReal Time RT-PCR 反應體系由 IOul 的 2 X STOR buffer、2. Oul 的 DNA 模板、l.Oul的引物和7. Oul的滅菌雙蒸水組成；擴增反應條件為預變性95°C 30s，變性 95°C 5s，退火 60°C :35s，共 40 個循環。
權利要求
1.一種檢測原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征在于檢測原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法按以下步驟實現一、將待檢測的原料乳離心進行脫脂；二、將脫脂乳與EDTA-Na 溶液以5-7 1的比例向脫脂乳中加入體積濃度為60 %的EDTA-Na溶液，在37°C的溫度下水浴20-30min;三、將水浴后的樣品進行無菌過濾；四、用生理鹽水洗脫濾膜上的菌體，離心2次后棄掉上清，收集菌體；五、利用細菌DNA提取試劑盒提取菌體基因組DNA作為模板，進行Real TimeRT-PCR檢測，根據擴增曲線和融解曲線進行分析；即得到檢測結果；其中步驟五中20ul反應體系由IOul的2 X STOR buffer、2. Oul的DNA模板、l.Oul的引物和7. Oul的滅菌雙蒸水組成；擴增反應條件為預變性95°C 30s，變性95°C 5s，退火 60°C 35s，共40個循環；蠟樣芽孢桿菌上游引物為5，-AGTTCGTAGCCTATGCCGT-3，，下游引物為 5’ -GGCTTATTCGCTATGCG-3，。
2.根據權利要求1所述的一種檢測原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征在于步驟一中待測樣品是在3000g的條件下離心20min。
3.根據權利要求1所述的一種檢測原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征在于步驟二中將脫脂乳與EDTA-Na溶液以6 1的比例向脫脂乳中加入體積濃度為60%的EDTA-Na 溶液。
4.根據權利要求1所述的一種檢測原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征在于步驟二中水浴條件為37°C，25min。
5.根據權利要求1所述的一種檢測原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征在于步驟三中采用0. 22um孔徑的蔡氏過濾器進行無菌過濾。
6.根據權利要求1所述的一種檢測原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征在于步驟四中菌體洗脫液在9000g，15min的條件下離心2次。
7.根據權利要求1所述的一種檢測原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征在于；步驟五中利用細菌DNA提取試劑盒提取菌體基因組DNA。
8.根據權利要求1所述的一種檢測原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征在于步驟五中提取的菌體DNA直接作為Real Time RT-PCR反應的模板。
全文摘要
本發明涉及一種檢測原料乳中蠟樣芽孢桿菌的方法。本發明解決傳統的蠟樣芽孢桿菌檢測方法費時費力、靈敏度低以及現有的基因檢測技術必須進行預增菌，無法快速檢測原料乳中蠟樣芽孢桿菌并且易污染的問題。檢測方法一、對待檢測的原料乳進行脫脂處理；二、加入EDTA-Na溶液進行水浴；三、過濾水浴后的脫脂乳；四、收集洗脫液；五、提取菌體DNA，并進行Real Time RT-PCR檢測。本發明操作簡單；不需要預增菌，具有快速的優點；本發明能夠快速過濾原料乳中的菌體；本發明對蠟樣芽孢桿菌的致病基因進行了引物設計，針對性強、特異性好。
文檔編號C12Q1/68GK102453753SQ20101052088
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月27日 優先權日2010年10月27日
發明者張文龍 申請人:張文龍