一種阿魏酸酯酶及其編碼基因與應用的制作方法

專利名稱：一種阿魏酸酯酶及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種利用未培養微生物提取mRNA，建立cDNA文庫，進行阿魏酸酯酶基 因的克隆；構建含阿魏酸酯酶基因的重組載體在宿主(大腸桿菌)中表達的工程菌；利用工 程菌表達的阿魏酸酯酶及該酶的應用。
背景技術：
阿魏酸酯酶(E. C. 3. 1. 1. 73，又稱肉桂酸酯酶)是水解植物細胞壁中羥基肉桂酸 和糖之間酯鍵的一類酶，是羧酸酯水解酶的一個亞類，也是一種胞外酶，是能水解阿魏酸 甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，將阿魏酸游離出來的酶。阿魏酸酯酶在造紙、食品、制藥及飼料工業有很廣泛的應用空間。近年來，阿魏酸 酯酶在飼料消化中的作用日益引起人們的關注。秸稈和飼草干物質中約30%-80%為細胞壁 成分，因此，細胞壁成為秸稈和飼草利用的瓶頸因素。阿魏酸酯酶可以打開飼料細胞壁木質 素中阿魏酸、對香豆酸及二聚阿魏酸等分子與半纖維素支鏈形成的致密網狀交聯結構，從 空間上增加了微生物對細胞壁中纖維素和半纖維素的有效降解，因此阿魏酸酯酶已被推測 認為是消除細胞壁降解限制因子的關鍵酶之一。目前，國內外對阿魏酸酯酶的研究，發現了有效分泌阿魏酸酯酶的微生物；研究 人員對該酶的酶學特性進行了詳細研究，如酶的結構、最適溫度、最適PH值及影響酶穩定 性的其他因素；探討了阿魏酸酯酶與一些多糖降解酶的協同作用；指出了微生物產酶的影 響因素和酶的工業化分離方法。但是，文獻表明阿魏酸酯酶雖然有著廣闊的應用前景的一 種新型酶制劑，但目前還沒有工業化產品。關于阿魏酸酯酶的研究，有很多問題需要解決，主要是目前篩選出的分泌阿魏酸 酯酶的微生物的分泌量仍然達不到工業化生產阿魏酸酯酶的要求；其次，阿魏酸酯酶提取 方法有待于改進，其工業化生產受到限制。研究表明，利用現代生物技術來改良微生物，使 阿魏酸酯酶的產量提高是解決這一問題的途徑之一，目前已經有研究者定位了與阿魏酸酯 酶合成有關的基因，為進一步的研究奠定了基礎；但目前還沒有將酯酶進行提高阿魏酸酯 酶的活力及產量的研究。

發明內容
本發明提供一種優質的阿魏酸酯酶基因，能夠構建成阿魏酸酯酶的工程菌。本發明提供了阿魏酸酯酶及其在生物化工、油脂加工、食品加工等領域中的用途。本發明公開了阿魏酸酯酶具有水解植物細胞壁的用途，能夠單獨或與其它酶聯合 水解植物細胞壁，及其在生物質能源利用方面有廣泛的應用價值。本發明公開的阿魏酸酯酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本發明阿魏酸酯酶工程菌的構建方法，包括從自然發霉的玉米皮及秸稈中釣取目 的基因、構建表達載體及將載體轉化到宿主細胞中得到其工程菌，具體步驟如下
1)從未培養的微生物中提取mRNA ；2)載體為真核或原核表達載體；
3)宿主細胞不局限于任何特定的宿主細胞，只要它能夠表達所述重組表達載體。所述的構建方法中所使用的載體為pET_28a ( + )或pET_32a ( + )。所使用的宿主細胞為大腸桿菌BL21或BLP。本發明提供的阿魏酸酯酶，其特征在于
(1)在25-80°C，表現催化活力，其酶活力最適反應溫度為40°C；
(2)能夠有效地催化阿魏酸對硝基苯酚酯的水解；
(3)酶在pH5. 5-7. 0范圍內穩定性較高，殘余酶活力在60%以上。本發明所述阿魏酸酯酶的制備方法，包括將過夜培養的菌液離心(6000rpm， 20min)，棄沉淀，收集上清，透析10h，利用PEG濃縮100倍，加入適量硫酸銨，棄上清保留沉 淀，取沉淀利用25MmTris-HCl (pH8. 0)緩沖液溶解，得到初步純化的酶液。以下實驗表明阿魏酸酯酶具有水解植物細胞壁的用途。試驗例
阿魏酸酯酶的水解活性 (1)水解反應
取2個錐形瓶，分別稱取磨碎的玉米麩皮50g，加入250ml 0. 6%Na0H，在黑暗中浸泡 一小時，高壓滅菌(12rC，30min)，降溫至30°C后調節pH至5，分別加入30U纖維素酶液、 60U阿魏酸酯酶和30U纖維素酶液后放入搖床搖12h (45°C )，每隔Ih取Iml反應液，離心 (5500r，IOmin)取上清，蒽酮硫酸法測定上清中的總糖含量。(2)標準曲線制作及樣品中總糖含量測定
配制0. lg/L葡萄糖溶液，分別精密移取0. 05,0. 10,0. 20,0. 30,0. 40,0. 60,0. 80和 1.00 mL至8支試管中，然后將每支試管中溶液補足至1 mL，混勻，加入4. 00 mL蒽酮試劑 (2g/L蒽酮試劑溶解2 g蒽酮于濃硫酸中)，迅速浸于冰水浴中冷卻，各管加完后，浸于沸 水浴中煮沸10 min，取出，流水冷卻，室溫放置10 min左右，測620 nm處吸光度值，以蒸餾 水作為空白樣品作為對照，以620 nm處吸光度值為縱坐標，葡萄糖質量為橫坐標，繪制標準 曲線。實驗結果如圖1所示，不加任何酶液，12h中總糖含量從13. 12mg/ml增加到 13. 90mg/ml ；只加纖維素酶，12h總糖含量從15. 50mg/ml增加到18. 27 mg/ml ；同時加入阿 魏酸酯酶和纖維素酶，12h總糖含量從15. 07mg/ml增加到19. 22mg/ml。結果表明在加入 阿魏酸酯酶之后，纖維素酶的總糖的水解量提高了 5%。說明在阿魏酸酯酶有能輔助纖維素 酶水解植物細胞壁的作用。本發明的積極效果在于利用未培養微生物提取mRNA，建立cDNA文庫，因此，利用 微生物學、分子生物學的方法，構建高效水解阿魏酸酯的酯酶工程菌，獲得高活力的阿魏酸 酯酶工程菌，在發掘和利用自然界中阿魏酸酯酶編碼基因資源方面具有科學價值，同時為 實現該酶的工業化生產奠定基礎，在利用生物質生產的第二代生物質燃料和自然資源的有 效利用方面，也具有廣泛的應用前景。


圖1.復合酶水解細胞壁時間-總糖曲線；圖2.重組表達載體示意圖； 圖3.純化得到阿魏酸酯酶的電泳圖譜； 圖4.阿魏酸酯酶的溫度-活力曲線； 圖5.阿魏酸酯酶的pH-活力曲線。
具體實施例方式實施例1
阿魏酸酯酶工程菌的構建及其表達 (1)阿魏酸酯酶mRNA的提取及CDNA文庫構建
稱取自然發霉的玉米皮及秸稈(吉林省)0. Ig,液氮研磨至粉末，加入500ul Trizol試劑，在室溫下繼續研磨至完全融化，轉入1.5ml eppendorf管中，室溫放置3min。4°C， 15000rpm離心lOmin，將上清轉入新1. 5ml eppendorf管中，加入100ulCHCl3，用力振搖 30s，室溫放置3min。4°C，15000rpm離心lOmin，取上層水相，加入冰上預冷的異丙醇250ul， 冰上放置lOmin。4°C，15000rpm離心lOmin，棄上清，沉淀中加入lml4°C預冷的75%乙醇， 渦旋混合10s。4°C，15000rpm離心lOmin，棄上清，室溫揮干乙醇，沉淀溶于50ulDEPC水中， 立即進行逆轉錄反應。逆轉錄反應在20ul體系中加入9. 5ul超純水，Iul dNTP，0.5ul OligodT, 2ul RNA，65°C處理5min，立即冰浴冷卻，瞬時離心IOs ；加入2ul DTT，4ul 5XRT buffer溫和 混勻，42°C水浴中保溫2min ；加入Iul逆轉錄酶混合均勻后，于42°C水浴中反應40min， 95°C反應 5 min。(2)引物設計及用PCR法釣取酶基因制備重組載體 該酶基因通過PCR方法從步驟(1)所得cDNA中擴增而得到。上游引物5，-TTCCCGGAATTCATGAAGCAATTCTC-3， 下游引物5’ -ATATTACCAAAGCTTAGCTCCGCTCGTCA-3’
兩個引物所設置的酶切位點與表達載體pET28a+ (或pET-32a ( + ))的Ecor I和Hind III相匹配，合適于在大腸桿菌中高效表達。PCR 反應在 25ul 反應體系中含有 0. 5ul DNA 聚合酶，2.5ul IOXPCR buffer, 1. 5ul dNTP( 10 mM)，0. 5ul 上游引物，0. 5ul 下游引物，0. 5ulcDNA，17. 5ul 超純水。每循環 中94°C變性5min，48°C退火40s，72°C延伸lmin20s，最后一個循環延至lOmin，共30個循 環。用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，分子量與預期的900bp —致。使用PCR產物純 化試劑盒對擴增產物進行純化。將純化的PCR產物用限制性內切酶Ecor I和Hind III酶切，37°C下保溫3h，酶切 完畢，在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，應用DNA凝膠檢測試劑盒回收酶切后的DNA片段。應用類似的方法酶切pET28a+載體，在1%瓊脂糖凝膠中檢測線性并提純酶切后的 載體。在16°C應用T4DNA聚合酶來連接酯酶基因片段和載體。將連接載體轉入五co7iBL21 中，用含卡那霉素的瓊脂糖平板進行單克隆菌株的篩選和鑒定。從挑取的菌落中提取載體， 用限制性內切酶Ecor I和Hind III作用載體，得到大小兩個片段，其大小分別與酯酶基因 和pET28a+的片段大小一致。重組載體的構建過程如圖2所示。核苷酸序列見SEQ ID NO. 1 序列表。
(3)重組載體在宿主菌中的表達
重組載體可轉化到五coli BL21或五coli BLp宿主細胞中，在五co7iBL21中表達的
酯酶含量最高。大腸桿菌感受態細胞制備及其載體轉化方法挑取陽性轉化菌，置5ml含卡那霉 素的培養液中37°C培養過夜，次日接種到IOOml新鮮LB培養基中，37°C繼續培養4h。將 初步方法的種子液以1%的比例接入2L的培養液中，在空氣搖床振蕩培養(37°C，120rpm/ min)。待菌體生長到A600為0. 6 1. 0時，加入IOOmM的異丙基硫代- β -D-半乳糖苷 (IPTG)至終濃度為ImM，降低培養溫度至25°C，對菌體進行誘導使其產生大量目的蛋白，培 養4小時后收獲菌體，得到本發明所述工程菌。將過夜培養的菌液離心(6000rpm，20min),棄沉淀，收集上清，透析10h，利用PEG 濃縮100倍，加入適量硫酸銨，棄上清保留沉淀，取沉淀利用25MmTris-HCl (pH8. 0)緩沖 液溶解，得到初步純化的酶液。應用SDS-PAGE(12%)電泳檢測重組蛋白的純度，可見在 40000Da附近可見一電泳條帶，即為阿魏酸酯酶，如圖3所示(Lane 1，透析，硫酸銨處理的 重組蛋白(pET28a+FAE) ； Lane 2，全菌蛋白(pET28a+)；)。以上技術方案中所有基本分子生物學操作均參照“分子克隆實驗指南”(第三版， 科學出版社，2002年)
試驗例
阿魏酸酯酶的特性 (1)最適反應溫度
反應溫度是影響酶催化活力的重要因素，此酶來源于環境微生物，因此設定該酶 催化活力檢測的溫度范圍為25-80°C。以阿魏酸對硝基苯酚酯作為反應底物，在25-80°C的溫度范圍內測定阿魏酸酯酶 活力。由圖4可見，其活力在25-40°C溫度范圍內隨溫度的升高而提高，在45°C以上，活力 下降，最適溫度為40°C。阿魏酸酯酶活力測定以阿魏酸對硝基苯酚酯作為反應底物，反應體系為1ml， 緩沖體系為25mmol/L的磷酸緩沖液，阿魏酸對硝基苯酚酯的終濃度為0. lmmol/L,加入 0. 224mg的酶，用DB-2401型紫外分光光度分析儀測定405nm的吸光度值。1個酶活力單位 是Imin水解底物生成IuM對硝基苯酚所需要的酶量。(2)最適 pH
環境PH值會影響酶分子中帶電氨基酸的解離狀態和酶的構象，進而影響酶的催化活 力。以阿魏酸對硝基苯酚酯作為底物，在40°C下測定阿魏酸酯酶在pH 3-8范圍內的比活 CpH 5. 8-8. 0磷酸緩沖液，pH3-4. 8檸檬酸緩沖液)，實驗結果如圖5所示，在pH值6-6. 4之 間能夠有效地催化阿魏酸對硝基苯酚酯的水解，且表明本發明酶的最適pH為6. 4。
權利要求
1.一種阿魏酸酯酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.根據權利1所述基因構建阿魏酸酯酶工程菌的方法，包括從自然發霉的玉米皮及秸 稈中釣取目的基因、構建表達載體及將載體轉化到宿主細胞中3個步驟1)從未培養的微生物中提取mRNA；2)載體為真核或原核表達載體；3)宿主細胞不局限于任何特定的宿主細胞，只要它能夠表達所述重組表達載體。
3.根據權利2所述的構建方法，其特征在于所使用的載體為pET-28a( + )或pET_32a(+ )。
4.根據權利2所述的構建方法，其特征在于所使用的宿主細胞為大腸桿菌BL21或BLP。
5.具有權利1所述基因的阿魏酸酯酶，其特征在于(1)在25-80°C，表現催化活力，其酶活力最適反應溫度為40°C；(2)能夠有效地催化阿魏酸對硝基苯酚酯的水解；(3)酶在pH5. 5-7. 0范圍內穩定性較高，殘余酶活力在60%以上。
6.權利要求5所述阿魏酸酯酶的制備方法，包括把過夜培養的菌液離心后除去菌體， 收集上清，透析10h，PEG濃縮100倍，加入適量硫酸銨沉淀，用pH8. 0的25MmTris-HCl緩沖 液溶解，得到酶液。
7.權利要求5所述的阿魏酸酯酶，在生物化工，油脂加工、食品加工領域中的應用。
8.權利要求5所述的阿魏酸酯酶具有水解植物細胞壁的用途，及其在生物質能源方面 的利用。
全文摘要
本發明公開一種阿魏酸酯酶及其編碼基因與應用，利用未培養微生物提取mRNA，建立cDNA文庫，因此，利用微生物學、分子生物學的方法，構建高效水解阿魏酸酯的酯酶工程菌，獲得高活力的阿魏酸酯酶工程菌，在發掘和利用自然界中阿魏酸酯酶編碼基因資源方面具有科學價值，同時為實現該酶的工業化生產奠定基礎，在利用生物質生產的第二代生物質燃料和自然資源的有效利用方面，也具有廣泛的應用前景。
文檔編號C12N1/21GK102002508SQ20101052390
公開日2011年4月6日 申請日期2010年10月29日 優先權日2010年10月29日
發明者張桂榮, 權宇彤, 王貞佐, 程瑛琨, 蔣振彥, 高貴 申請人:吉林大學