專利名稱：一種無抗生素抗性標記的枯草芽孢桿菌構建方法及篩選靶基因失活的枯草芽孢桿菌的方法
一種無抗生素抗性標記的枯草芽孢桿菌構建方法及篩選靶 基因失活的枯草芽孢桿菌的方法技術領域
本發明屬于生物技術領域，涉及一種無抗生素抗性標記的枯草芽孢桿菌構建方 法及篩選靶基因失活的枯草芽孢桿菌的方法。
背景技術：
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)被公認為是安全菌株(GRAS)，可以使外源基因分泌表達出有活性的產物。此外，枯草芽孢桿菌遺傳背景清楚、具有生長迅速、培 養條件簡單、良好的發酵基礎和生產技術，使其在科研和工農業生產領域被廣泛應用。 B.subtilis作為一種重要的工業微生物，具有開發為食品級表達宿主的優勢，減少用于食 品行業的重組生物制品的下游分離純化成本。
目前B.subtilis作為宿主的最大問題是其自身分泌的蛋白酶，對外源蛋白產生降 解作用，嚴重的影響了外源目的產物的分泌表達產量。B.subtilis分泌多種蛋白酶對外源 基因的降解作用早已引起許多學者的注意。國外學者通過基因敲出技術將已發現的蛋白 酶基因逐個敲除，生成了 DB104、DB403、WB600、WB700、WB800等蛋白酶缺陷菌 株。WB800是由加拿大Sui-LamWong教授實驗室創建的敲除了堿性蛋白酶(apr)、中性 蛋白酶(npr)、金屬蛋白酶(mpr)、中性蛋白酶B (nprB)、三種絲氨酸蛋白酶(epr、bpf和 vpr)和胞壁蛋白酶(cwp)8種蛋白酶的菌株。該菌株已失去絕大部分的蛋白酶活力，很多 基因在該宿主內實現了穩定表達。但是WB800內殘留的蛋白酶仍然對某些敏感蛋白造成 降解。WB800的構建也是通過傳統的基因敲出過程，宿主本身攜帶了多種抗生素基因， 不能應用于食品級工程菌，不符合食品安全標準。
傳統的對枯草芽孢桿菌染色體的基因操作是通過一個正向篩選標記實現的，通 常是在要失活或敲除的基因內部插入一個抗性基因，其兩端即為同源交換臂，這樣根據 同源重組原理，修飾過的或無活性的基因將原始染色體上的活性基因置換。然而，當我 們在經過一次基因修飾的菌株上再次進行基因操作，不可避免的引入第二個抗性基因； 另外一種方法是通過再一次的單交換作用，將第一次引入的抗性基因切除掉。可以想見 第一種方法，將會導致宿主產生多種抗生素抗性，而且多重抗生素抗性壓力下有可能會 改變菌株的生理特性；第二種方法的缺陷是發生一次雙交換后，再發生一次單交換的頻 率極低，而且沒有正向篩選標記，工作量相當大。
因此，建立一套枯草芽孢桿菌的無抗生素抗性標記基因的篩選技術對基礎研究 和應用研究具有重要推動作用。Fabret等在2002年第一次報導了枯草芽孢桿菌無標記基 因組修飾的方法，原理是通過控制尿嘧啶合成的有無來起到篩選的目的。此后，先后出 現了5篇這方面的報導，或是以利用抗藥性篩選、利用營養缺陷型篩選和利用毒素基因 /解毒素基因篩選。這些方法的共同之處是需要發生兩次雙交換過程達到基因修飾的目 的。第一次雙交換借助同源片段，第二次雙交換借助所修飾的靶基因位點兩側引入的兩 個同向重復序列(DR)。雖然上述方法能夠達到無抗生素抗性標記篩選的目的，但是構建4敲除載體過程繁瑣，并且重組突變效率低。 發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種無抗生素抗性標記的枯草 芽孢桿菌構建方法及篩選靶基因失活的枯草芽孢桿菌的方法。
—種無抗生素抗性標記的條件賴氨酸營養缺陷型枯草芽孢桿菌構建方法，其特 征在于包括下述步驟
(1)分別構建 SpovAF-CM-Lys 和 SpovAF-Pspac-Lys 同源交換片段；
(2) SpovAF-CM-Lys轉化枯草芽孢桿菌168感受態細胞，發生一次雙交換，該菌株基因組上LysA基因天然啟動子被置換為含有終止子的CM基因，得到賴氨酸營養缺陷 型突變菌株BS-CM ；
(3) SpovAF-Pspac-Lys轉化BS-CM感受態細胞，發生一次雙交換，所述的CM 基因被替換為受LacI基因抑制調節的Pspac啟動子，得到無抗生素抗性標記的條件賴氨酸 營養缺陷型枯草芽孢桿菌BS-PS。
其中，所述的SpovAF-CM-Lys同源交換片段通過如下步驟得到
(1)以枯草芽孢桿菌168基因組DNA為模板分別進行PCR擴增得到spoVAF 基因和Lys基因，以pJC164.3質粒為模板PCR擴增包括啟動子和終止子的CM基因， 將這三個基因分別克隆至PMD19-T載體，得到pMD19-T_spoVAF、pMD19-T_LysA、 pMD19-T-CM 載體；
(2)步驟(1)所述的pMD19-T-CM經雙酶切后獲得CM片段，與經過相同雙酶 切處理的pMD 19-T-spoVAF載體連接得到pMD 19-T-spoVAF-CM載體；
(3)步驟(1)所述的pMD19-T-LysA經雙酶切后獲得LysA片段，與經過相同雙 酶切處理的pMD 19-T-spoVAF-CM載體連接得到pMD19-T-S_C-L載體；
(4)以 spoVAF-HSEQIDNO.l)為上游引物，LysA-R^SEQ ID N0.4)為下游引 物，以步驟⑶所述pMD19-T-S-C-L載體為模板PCR擴增得到SpovAF-CM-LysA同源 交換片段。所述的SpovAF-Pspac-LysA同源交換片段通過如下步驟得到
(1)以枯草芽孢桿菌168基因組DNA為模板分別進行PCR擴增得到spoVAF基 因和Lys基因，以PDG-Stu質粒為模板PCR擴增得到Pspac啟動子基因，將這三個基因 分別克隆至 PMD19-T 載體，得到 pMD 19-T-spoVAF、pMD19_T_LysA、pMD19-T-Pspac 載體；
(2)步驟⑴所述的pMD19-T-Pspac經雙酶切后獲得Pspac片段，與經過相同雙 酶切處理的pMD 19-T-spoVAF載體連接得到pMD 19-T-spoVAF-Pspac載體；
(3)步驟(1)所述的pMD19-T-LysA經雙酶切后獲得LysA片段，與經過相同雙 酶切處理的pMD 19-T-spoVAF-Pspac載體連接得到pMD19-T-S_P-L載體；
(4)以 spoVAF-HSEQIDNO.l)為上游引物，LysA-R6EQ ID N0.4)為下游引 物，以步驟
(3)所述 pMD19-T-S-P_L 載體為模板 PCR 擴增得到 SpovAF-Pspac-LysA 同源交換片段。
一種利用無抗生素抗性標記基因篩選技術篩選靶基因失活的枯草芽孢桿菌的方法，包括如下步驟
(1)按照權利要求1所述方法構建無抗生素抗性標記的條件賴氨酸營養缺陷型枯 草芽孢桿菌BS-PS ；
(2)構建插入失活靶基因的同源整合載體；
(3)將步驟( 所述的同源整合載體轉化步驟(1)所述的無抗生素抗性標記的條 件賴氨酸營養缺陷型枯草芽孢桿菌BS-PS，通過一次單交換和一次由于基因組結構不穩 定引起的自發單交換過程，以是否能自我合成賴氨酸為篩選標記，得到兩種基因型的枯 草芽孢桿菌突變株，一種為枯草芽孢桿菌回復突變菌株，另一種為靶基因失活的無抗生 素抗性標記基因的枯草芽孢桿菌突變株，經PCR鑒定篩選得到靶基因失活的無抗生素抗 性標記基因的枯草芽孢桿菌突變株。
其中，步驟( 所述的插入失活靶基因的同源整合載體通過如下方法構建
(1)以大腸桿菌pMD19-T為骨架，構建了一個含有P43_LacI自主表達框及CM 結構基因的通用型整合載體PLC-T ；
(2)構建插入插入子的失活枯草芽孢桿菌168靶基因；
(3)將步驟( 所述的失活枯草芽孢桿菌168靶基因亞克隆至通用型整合載體 PLC-T,得到所述的插入失活靶基因的同源整合載體。
步驟(3)所述的PCR鑒定方法為設計擴增靶基因的引物，分別以靶基因失活的 無抗生素抗性標記基因的枯草芽孢桿菌突變株基因組和枯草芽孢桿菌回復突變菌株基因 組為模板進行PCR擴增，以靶基因失活的無抗生素抗性標記基因的枯草芽孢桿菌突變株 基因組為模板擴增出來的條帶比以枯草芽孢桿菌回復突變菌株基因組為模板擴增的條帶 多出插入序列的大小。
所述的靶基因為蛋白酶基因，優選nprE基因或aprE基因。
有益效果
本發明以BS168為出發菌株，通過兩次雙交換過程獲得了 BS-PS突變菌株，該 菌株基因組上控制賴氨酸合成酶的基因LysA的啟動子被置換為Pspac啟動子，該啟動子 可受LacI的抑制，即BS-PS菌株可受LacI調控。該無抗生素抗性標記的條件賴氨酸缺 陷型枯草芽孢桿菌構建方法過程簡單，重組突變效率高。賴氨酸是枯草桿菌宿主生長所 必須氨基酸，控制其合成的啟動子為組成型，本發明中選擇能夠調控的Pspac啟動子，并 且枯草桿菌本身不合成LacI阻抑蛋白，因此可通過LacI嚴格控制宿主的生長情況。同 時，賴氨酸條件營養型標記符合食品級工程菌對篩選標記的要求。
本發明在構建條件賴氨酸缺陷型枯草芽孢桿菌BS-PS的基礎上，能夠以賴氨酸 能否自我合成為篩選標記，對枯草芽孢桿菌同一菌株進行重復、多次的基因組改造，獲 得的蛋白酶失活的枯草芽孢桿菌突變菌株，與以已報導的方法相比有以下優點
(1)該方法在敲除靶蛋白酶的同時不會向宿主引入抗生素基因，所構建的蛋白 酶失活的枯草芽孢桿菌無抗生素抗性基因，可應用于食品級工程菌，不符合食品安全標 準。
(2)構建整合突變載體簡單。以往報導的方法需要復雜的操作過程來構建用來發 生兩次雙交換過程的元件，即用來發生第一次雙交換的A、B同源片段和用來發生第二次 雙交換的兩DR序列，靶基因則位于兩個DR之間。本方法首先構建一個通用的整合載6體PLC-T，在此基礎上只要將靶基因內部插入或缺失一段序列，然后將修飾后的靶基因 插入PLC-T即可。
(3)突變效率高。以往報導的方法需要發生兩次雙交換過程，而本方法需要發生 兩次單交換的過程。枯草芽孢桿菌基因組發生單交換比雙交換的頻率高，因此，本方法 整個過程要比以往報導的方法效率要高。
(4)本發明所采用的方法可在同一突變菌株重復使用。本發明中利用賴氨酸能否 自我合成為篩選標記，在發生第二次自發單交換過程后，突變宿主恢復了賴氨酸合成能 力。當再次轉化入整合突變載體后，又可以以賴氨酸合成能力的有無作為篩選標記。因 此，可以在同一菌株運用本發明方法進行多次基因突變操作。
圖1.本發明技術方案。
圖 2.SpovAF-CM-LysA 和 SpovAF-Pspac-LysA 同源交換片段的構建。
圖3.BS-CM突變菌株的構建。
圖4.BS-PS突變菌株的構建。
圖5.BS-PS菌株蛋白酶nprE和aprE失活整合載體的構建。
圖6.BS-PS菌株nprE蛋白酶基因的插入失活。(a)整合突變載體與BS_PS基因 組發生單交換；(b)過渡菌株由于基因組不穩定發生自發單交換。
圖7.PCR產物電泳驗證BS-PS-nl菌株。
圖8.PCR產物電泳驗證BS-PS-nl-al菌株。
圖9.SDS-PAGE 檢測 BS-PS-nl-al 菌株分泌蛋白。
具體實施方式
本發明首先構建SpovAF-CM-LysA和SpovAF-Pspac-LysA兩個同源交換片段，通過兩次雙交換過程將枯草芽孢桿菌168改造為條件賴氨酸營養缺陷型菌株BS-PS。在 此基礎上構建失活nprE和aprE靶基因的同源整合載體，通過一次單交換過程，獲得過渡 菌株，由于過渡菌株基因組結構不穩定引起再一次自發單交換過程，以賴氨酸為篩選標 記，篩選蛋白酶基因插入失活的突變菌株(技術方案如圖1)，從生理、分子及生化方面 對突變菌株進行驗證，技術方案如圖具體實施方式
如下
實施例IBS-PS突變菌株的構建
(1) SpovAF-CM-LysA同源交換片段的構建
構建路線見圖2。以 spoVAF-F (SEQ ID NO. 1)禾P spoVAF-R (SEQ ID N0.2) 為引物，以枯草芽孢桿菌168CBS168)基因組DNA為模板PCR擴增spoVAF基因；以 LysA-F (SEQ ID N0.3)禾Π LysA-R(SEQ ID N0.4)為引物，以 BS168 基因組 DNA 為模板 PCR擴增Lys基因；以 CM-HSEQ ID N0.5)和 CM-RXSEQ ID N0.6)為引物，以pJC164.3 質粒(BGSC，含有CM基因)為模板PCR擴增包括啟動子和終止子的CM(氯霉素抗性基 因)。擴增得到的三個基因分別克隆至pMD19-T (購自Takara公司)載體，經驗證、測 序正確后，分別命名為 pMD19-T_spoVAF、pMD19_T_LysA、pMD19_T_CM，于 _20°C 條件下保存備用。7
PCR 擴增體系如下IOXPfu PCR buffer 10 μ 1，10 μ M 上游引物 10 μ 1，10 μ M 下游引物 ο μ 1，2.5mMdNTPs 8 μ 1，pJC164.3 質粒 10ng，ddH20 加至 100 μ 1，PfoDNA 聚合酶 5U。PCR 程序為 94 "C 2min ； 30 X (94 "C 45s ； 58 "C 50s ； 72 "C 4min)； 72°C lOmin。 以下PCR反應同此條件。
pMD19-T-CM用BamHI/XhoI雙酶切后獲得CM片段，與經過相同雙酶切處理 的pMD19-T_spoVAF載體，用T4DNA連接，構建得到pMD19-T-spoVAF_CM載體，酶切驗證正確后于-20°C條件下保存備用。
pMD19-T-LysA用BamHI/Kpnl雙酶切后獲得LysA片段，與經過相同雙酶切處 理的pMD19-T-spoVAF_CM載體，用T4DNA連接，構建得到pMD19-T-S_C-L載體，酶切驗證正確后于-20°C條件下保存備用。
以spoVAF-HSEQIDNO.l)為上游引物，LysA-R6EQ ID NO.4)為下游引物， 以pMD19-T-S-C_L載體為模板進行PCR擴增反應，PCR產物即為SpovAF-CM-LysA同 源交換片段，經PCR產物回收試劑盒回收處理后即可用于電轉化操作。
(2) SpovAF-Pspac-LysA同源交換片段的構建
構建路線見圖2。以 Pspac-HSEQ ID N0.7)和 Pspac-RXSEQ ID N0.8)為引物， 以PDG-Stu質粒(BGSC，含有Pspac啟動子基因)為模板PCR擴增得到Pspac啟動子基 因，該啟動子受LacI抑制。擴增得到的Pspac啟動子克隆至pMD19-T載體，經驗證、 測序正確后，命名為pMD19-T-Pspac，于_20°C條件下保存備用。
pMD19-T-Pspac用BamHI/XhoI雙酶切后獲得Pspac片段，與經過相同雙酶切 處理的 pMD19-T-spoVAF 載體，用 T4DNA 連接，構建得到 pMD19-T_spoVAF-Pspac 載體，酶切驗證正確后于-20°C條件下保存備用。
pMD19-T-LysA用BamHI/Kpnl雙酶切后獲得LysA片段，與經過相同雙酶切處 理的 pMD19-T_spoVAF-Pspac 載體，用 T4DNA 連接，構建得到 pMD19-T_S"P-L 載體，酶切驗證正確后于-20°C條件下保存備用。
以 spoVAF-HSEQ ID N0.1)為上游引物，LysA-R LysA-R6EQ ID N0.4) 為下游引物，以PMD19-T-S-P-L載體為模板進行PCR擴增反應，PCR產物即為 SpovAF-Pspac-LysA同源交換片段，經PCR產物回收試劑盒回收處理后即可用于電轉化操作。
(3) BS-CM突變菌株的構建
構建路線如圖3所示。以BS168為出發菌株，制備感受態細胞，采用電轉化方 法，將獲得的同源交換片段SpovAF-CM-LysA轉化入BS168，在基因組SpovAF和LysA位點發生雙交換，CM抗性平板上篩選得到BS-CM抗性菌株。該菌株的SpovAF和LysA 結構基因連接處被置換為CM基因，產生兩個表型效應，一是BS-CM突變菌株具有氯霉 素抗性；二是，LysA基因天然啟動子被置換掉，而CM基因含有終止子，其啟動子不能 對LysA基因起轉錄作用，因此失去合成賴氨酸功能，BS-CM菌株成為賴氨酸營養缺陷 型突變體。
(4) BS-PS突變菌株的構建
構建路線如圖4所示。以BS-CM為出發菌株，制備感受態細胞，采用電轉化方 法，將獲得的同源交換片段SpovAF-Pspac-LysA轉化入BS-CM菌株，在基因組SpovAF和LysA位點發生雙交換，基本培養基平板上篩選得到BS-PS突變菌株。通過兩次同源 重組的雙交換過程，原始枯草芽孢桿菌LysA基因啟動子被置換為Pspac啟動子，該啟動 子受LacI基因抑制調節，菌株被改造為條件營養缺陷型，即在LacI基因存在時為賴氨酸 營養缺陷型，無LacI基因恢復正常表型。
實施例2利用無抗生素抗性標記基因篩選技術篩選靶基因失活的枯草芽孢桿菌
(I)BS-PS菌株蛋白酶nprE和aprE失活整合載體的構建
本發明選取了兩個枯草芽孢桿菌分泌較多的蛋白酶基因aprE和nprE，采用插入 失活的策略，進行突變失活研究。以大腸桿菌pMD19-T為骨架，構建了一個通用型整合 載體PLC-T。在通用載體的基礎上構建了用于插入失活aprE基因的PLC-IaprE-T整合載 體和用于插入失活nprE基因的PLC-InprE-T整合載體。構建路線如圖5所示。
PLC-T整合載體的具體構建過程如下
以P43-HSEQIDN0.9)/P43-RXSEQIDN0.10)為引物，以BS168基因組DNA為 模板 PCR 擴增 P43 啟動子基因；L^ LacI-F (SEQ ID NO. 11)/LacI-R(SEQ ID NO. 12)為引 物，以質粒pMUTIN4 (BGSC,含有LacI結構基因)為模板擴增包括終止子在內的LacI基 因；以P43基因和LacI基因為模板通過SOE-PCR技術擴增獲得P43-Lacl自主表達框， LacI基因受P43啟動子控制，組成型表達。將P43_LacI表達框亞克隆至pMD19_T載體， 驗證并測序正確后命名為pMD19-T_P43-LacI，于_20°C條件下保存備用。
以CM-HSEQ ID N0.5)/CM-RXSEQ ID N0.6)為引物，以 pJC164.3 質粒為模 板，PCR擴增CM表達元件，擴增產物用BamHI/XhoI雙酶切，與經過相同雙酶切處 理的pMD19-T_P43-LacI載體，用T4DNA連接，即獲得PLOT載體，酶切驗證正確后 于-20°C條件下保存備用。
PLC-IaprE-T整合載體的具體構建過程如下
以 aprE-HSEQIDN0.15)/aprE-RXSEQIDN0.16)為引物，B.subtilis 基因組為模板PCR獲得該段基因，亞克隆至pMD19-T載體，驗證測序正確后，命名為aprE-T。 通過基因分析軟件，在基因內部找到HindIII可做為插入子(IS)的合適酶切插入位點。以 YH-HSEQ ID N0.19)/YH-RXSEQID N0.20)為引物，以酵母(NCBI，EU882859)基因 組為模板PCR擴增獲得YH序列做為IS，兩端帶有HindIII酶切位點。用HindIII酶切處 理YH，與同樣經過HindIII處理的aprE-T用T4DNA酶連接，得到載體IaprE_T。該載 體內，aprE基因內部插入了 YH序列，產生了插入失活效應，YH兩側的aprE序列即可 做為后續的同源交換片段。
IaprE-T載體用BamHI酶切處理，割膠回收得到IaprE基因片段，與同樣經過 BamHI酶切處理的PLOT載體用WDNA酶連接，酶切電泳驗證正確后，即得到用于插 入失活BSl68aprE基因的整合載體PLOIaprE-T。
PLC-InprE-T整合載體的具體構建過程如下
以 nprE-HSEQ ID N0.13)/nprE-R(SEQ ID N0.14)為引物，B.subtilis 168 基因組為模板PCR獲得該段基因，亞克隆至pMD19-T載體，驗證測序正確后，命名為 nprE-T。通過基因分析軟件，在基因內部找到BglII可做為插入子(IS)的合適酶切插入位 點。以 YB-nSEQIDN0.17)/YB-RXSEQIDN0.18)為引物，以酵母(NCBI，EU882859) 基因組為模板PCR擴增獲得YB序列做為IS，兩端帶有BglII酶切位點。用BglII酶切處理YH，與同樣經過BglII處理的nprE-T用WDNA酶連接，得到載體InprE_T。該載體 內，nprE基因內部插入了 YH序列，產生了插入失活效應，YB兩側的nprE序列即可做 為后續的同源交換片段。
IaprE-T載體用BamHI酶切處理，割膠回收得到InprE基因片段，與同樣經過 BamHI酶切處理的PLOT載體用WDNA酶連接，酶切電泳驗證正確后，即得到用于插 入失活枯草芽孢桿菌168nprE基因的整合載體PLOInprE-T。
(2)BS_PS菌株aprE、nprE蛋白酶基因的插入失活
將含有蛋白酶插入失活的整合載體PLC-InprE-T電轉化入BS-PS菌株，發生同 源重組過程。如圖6(a)所示，第一次單交換，產生一過渡菌株BS-PS-PI，賦予宿主氯 霉素抗性特征，可通過氯霉素抗性平板進行篩選陽性重組子，同時宿主還會產生另一個 重要生理特征，即賴氨酸營養缺陷，這是由于載體上的LacI基因作用于Pspac啟動子，從 而抑制了 LysA基因的表達，突變菌株不能在基本培養基上生長；如圖6(b)所示，由于 此時兩個同源臂的存在，在沒有CM抗性篩選壓力下，豐富培養基中多次傳代培養后， 將會發生第二次單交換，由于交換事件可發生在兩個同源臂中的任何一個，所以交換后 的基因型有兩種，一種是整合載體序列全部交換丟失的基因型即產生了回復突變，另一 種是我們希望得到的基因修飾菌株。這兩種交換結果都會使宿主恢復自我合成賴氨酸的 能力，即能夠通過基本培養基篩選出發生了第二次單交換的菌株。這兩種單交換產生的 基因型可以通過PCR技術加以區分，設計用來擴增靶基因的引物，以基因經過改造的菌 株基因組為模板擴增出來的條帶比以回復突變菌株基因組為模板擴增的條帶多出插入序 列的大小。通過此方法最終達到無抗生素抗性篩選標記的基因整合篩選。
(3)蛋白酶失活菌株的生理驗證
無抗生素標記基因失活菌株生理驗證BS-PS、BS-PS-In(基因失活，目的菌 株)、BS-PS-PI菌株(過渡菌株)劃線于同一 MM(基本培養基平板)上，BS-PS-PI菌 株不能生長，是由于該菌株基因組整合LacI基因，LacI對控制LysA基因表達的啟動子 Pspac有抑制作用，平板上會出現少數幾個菌落的原因是LacI與Pspac結合的不牢固，或 者是在生長壓力下，發生了單交換過程，長出的菌落可能是BS-PS或BS-PS-hi基因型菌 株。三種菌株均能在MM+賴氨酸的平板上生長。三種菌株中只有BS-PS-PI菌株能夠 在MM+CM平板上生長，BS-PS菌株和BS-PS-PI菌株均在發生交換的過程中，CM基因 被置換掉，達到無抗生素基因殘留的目的。
(4)蛋白酶失活菌株的分子驗證
對nprE蛋白酶基因(BS-PS-nl菌株)失活過程的分子驗證(圖7)，以 nprE-F (SEQ ID N0.13) /nprE-R(SEQ IDN0.14)為引物，分別以枯草芽孢桿菌 168 基 因組 DNA (lane 1，1400bp)，BS-PS 基因組 DNA (lane 2，1400bp)，PLOInprE 基因組 DNAClane 3，1800bp)，BS-PS-PI 基因組 DNA(lane 4，1400bp and 1800bp)和 BS-PS-nl 基因組DNAClane 5，1800bp)為模板進行PCR擴增，擴增出與預期結果大小一致的產 物。圖8是對aprE蛋白酶基因(BS"PS_nI-aI菌株)失活過程的分子驗證，以aprE_F/ aprE-R 為引物，以 BS168 基因組 DNA(lane 1，800bp)，BS-PS-nl 基因組 DNA(lane 2， 800bp)，PLC-IaprE 基因組 DNA (lane 3，1200bp)，BS-PS-nl-PI 基因組 DNA (lane 4， 800bp 和 1200bp)和 BS-PS-nl-al 基因組 DNA (lane 5，1200bp)模板進行 PCR 擴增，擴增10出與預期結果大小一致的產物。
(5)蛋白酶失活菌株的生化驗證
無抗生素標記基因失活菌株生化驗證對BS-PS-In-Ia突變菌株插入失活后的 InprE和IaprE進行基因序列和讀碼框的分析，從理論上分析得出BS_PS菌株天然nprE蛋 白酶分子量為53.7kD，天然aprE蛋白酶分子量為36.1kD。對兩個基因進行插入失活后， 由于讀碼框的改變，BS-PS"tn-Ia菌株InprE分子量為26.7kD，IaprE分子量為16.2kD。
為了驗證理論上對兩個蛋白酶分子量變化的推測，將BS-PS-In-Ia菌株搖瓶培 養，發酵液離心上清液濃縮后，以BS-PS菌株為對照，進行SDS-PAGE電泳分析。結果 為BS-PS-In-Li樣品在53kD和36kD位置比泳道1少了兩個蛋白條帶，而在洸kD和16kD 位置比泳道1多了兩個蛋白條帶(圖9)。因此驗證了論證上對兩個蛋白分子量變化的推 測。
權利要求
1.一種無抗生素抗性標記的條件賴氨酸營養缺陷型枯草芽孢桿菌構建方法，其特征 在于包括下述步驟(1)分別構建SpovAF-CM-Lys和SpovAF-Pspac-Lys同源交換片段；(2)利用所述的SpovAF-CM-Lys轉化枯草芽孢桿菌168感受態細胞，發生一次雙交 換，該菌株基因組上LysA基因天然啟動子被置換為含有終止子的CM基因，得到賴氨酸 營養缺陷型突變菌株BS-CM ；(3)利用所述的SpovAF-Pspac-Lys轉化BS-CM感受態細胞，發生一次雙交換，所述 的CM基因被替換為受LacI基因抑制調節的Pspac啟動子，得到無抗生素抗性標記的條件 賴氨酸營養缺陷型枯草芽孢桿菌BS-PS。
2.根據權利要求1所述的無抗生素抗性標記的條件賴氨酸營養缺陷型枯草芽孢桿菌構 建方法，其特征在于所述的SpovAF-CM-Lys同源交換片段通過如下步驟得到(1)以枯草芽孢桿菌168基因組DNA為模板分別進行PCR擴增得到spoVAF基因和 Lys基因，以pJC164.3質粒為模板PCR擴增包括啟動子和終止子的CM基因，將這三個基 因分別克隆至PMD19-T載體，得到pMD19-T_spoVAF、pMD19_T_LysA、pMD19_T_CM 載體；(2)步驟(1)所述的pMD19-T_CM經雙酶切后獲得CM片段，與經過相同雙酶切處 理的 pMD 19-T-spoVAF 載體連接得到 pMD 19-T-spoVAF-CM 載體；(3)步驟⑴所述的pMD19-T-LysA經雙酶切后獲得LysA片段，與經過相同雙酶切 處理的pMD 19-T-spoVAF-CM載體連接得到pMD19-T-S_C-L載體；(4)以spoVAF-F(SEQIDNO.l)為上游引物，LysA-R(SEQ ID N0.4)為下游引物， 以步驟⑶所述pMD19-T-S-C_L載體為模板PCR擴增得到SpovAF-CM-LysA同源交換 片段。
3.根據權利要求1所述的無抗生素抗性標記的條件賴氨酸營養缺陷型枯草芽孢桿菌構 建方法，其特征在于所述的SpovAF-Pspac-LysA同源交換片段通過如下步驟得到(1)以枯草芽孢桿菌168基因組DNA為模板分別進行PCR擴增得到spoVAF基因和 Lys基因，以PDG-Stu質粒為模板PCR擴增得到Pspac啟動子基因，將這三個基因分別 克隆至 pMD19-T 載體，得到 pMD 19-T-spoVAF、pMD19_T_LysA、pMD19-T_Pspac 載 體；(2)步驟⑴所述的pMD19-T-Pspac經雙酶切后獲得Pspac片段，與經過相同雙酶切 處理的 pMD I9-T-SpoVAF 載體連接得到 pMD 19-T-spoVAF-Pspac 載體；(3)步驟⑴所述的pMD19-T-LysA經雙酶切后獲得LysA片段，與經過相同雙酶切 處理的 pMD 19-T-spoVAF-Pspac 載體連接得到 pMD19-T_S"P-L 載體；(4)以spoVAF-F(SEQIDNO.l)為上游引物，LysA-R(SEQ ID N0.4)為下游引物， 以步驟⑶所述pMD19-T-S-P_L載體為模板PCR擴增得到SpovAF-Pspac-LysA同源交 換片段。
4.一種利用無抗生素抗性標記基因篩選技術篩選靶基因失活的枯草芽孢桿菌的方 法，其特征在于包括如下步驟(1)按照權利要求1所述方法構建無抗生素抗性標記的條件賴氨酸營養缺陷型枯草芽 孢桿菌BS-PS ；(2)構建插入失活靶基因的同源整合載體；(3)將步驟(2)所述的同源整合載體轉化步驟(1)所述的無抗生素抗性標記的條件賴 氨酸營養缺陷型枯草芽孢桿菌BS-PS，通過一次單交換和一次由于基因組結構不穩定引 起的自發單交換過程，以是否能自我合成賴氨酸為篩選標記，得到兩種基因型的枯草芽 孢桿菌突變株，一種為枯草芽孢桿菌回復突變菌株，另一種為靶基因失活的無抗生素抗 性標記基因的枯草芽孢桿菌突變株，經PCR鑒定篩選得到靶基因失活的無抗生素抗性標 記基因的枯草芽孢桿菌突變株。
5.根據權利要求4所述的利用無抗生素抗性標記基因篩選技術篩選靶基因失活的枯草 芽孢桿菌的方法，其特征在于步驟(2)所述的插入失活靶基因的同源整合載體通過如下 方法構建(1)以大腸桿菌pMD19-T為骨架，構建了一個含有P43-Lacl自主表達框及CM結構 基因的通用型整合載體PLC-T ；(2)構建插入插入子的失活枯草芽孢桿菌168靶基因；(3)將步驟(2)所述的失活枯草芽孢桿菌168靶基因亞克隆至通用型整合載體 PLC-T,得到所述的插入失活靶基因的同源整合載體。
6.根據權利要求4所述的利用無抗生素抗性標記基因篩選技術篩選靶基因失活的枯草 芽孢桿菌的方法，其特征在于步驟(3)所述的PCR鑒定方法為設計擴增靶基因的引物， 分別以靶基因失活的無抗生素抗性標記基因的枯草芽孢桿菌突變株基因組和枯草芽孢桿 菌回復突變菌株基因組為模板進行PCR擴增，以靶基因失活的無抗生素抗性標記基因的 枯草芽孢桿菌突變株基因組為模板擴增出來的條帶比以枯草芽孢桿菌回復突變菌株基因 組為模板擴增的條帶多出插入序列的大小。
7.根據權利要求4 6任一項所述的利用無抗生素抗性標記基因篩選技術篩選靶基因 失活的枯草芽孢桿菌的方法，其特征在于所述的靶基因為蛋白酶基因。
8.根據權利要求7所述的利用無抗生素抗性標記基因篩選技術篩選靶基因失活的枯草 芽孢桿菌的方法，其特征在于所述的靶基因為nprE基因或aprE基因。
全文摘要
本發明公開了一種無抗生素抗性標記的枯草芽孢桿菌構建方法及篩選靶基因失活的枯草芽孢桿菌的方法。本方法首先以枯草芽孢桿菌168為出發菌株，構建兩個同源交換片段，利用同源重組原理，通過兩次雙交換過程構建了一個可調控的賴氨酸營養缺陷型菌株BS-PS。以大腸桿菌克隆載體pMD19-T為骨架構建了通用型整合突變載體PLC，以枯草芽孢桿菌中性蛋白酶nprE為失活靶基因，采用插入失活策略，以PLC為基礎，構建了插入失活nprE的整合載體PLC-InprE，轉化入BS-PS，通過一次單交換，以及一次自發單交換過程，以控制賴氨酸的合成為篩選標記結合PCR驗證結果，對蛋白酶插入失活的突變菌株進行篩選。
文檔編號C12N15/10GK102021164SQ201010535809
公開日2011年4月20日 申請日期2010年11月9日 優先權日2010年11月9日
發明者別小妹, 呂鳳霞, 張充, 王煜, 趙海珍, 陸兆新 申請人:南京農業大學