一種鐵皮石斛栽培種植菌根化生產方法

專利名稱：一種鐵皮石斛栽培種植菌根化生產方法
技術領域：
本發明涉及一種鐵皮石斛栽培種植菌根化方法。具體涉及一種菌根真菌在鐵皮石斛栽培中的應用方法，它包括本發明所用的菌根真菌的培養、鐵皮石斛由原球莖發育至苗及其繼代培養、菌根真菌在鐵皮石斛栽培中的應用方法和對鐵皮石斛促生長效果及對代謝活動、抗逆性、有效成分含量的影響。
背景技術：
鐵皮石斛iPendrobium officinale Kimura et Migo)屬珍稀瀕危高附加值藥材， 其養生保健治療效果確切，在《道藏》、《神農本草經》、《本草綱目》、《現代中藥大辭典》、2010 年版《中華人民共和國藥典》等醫藥典籍中均有記載。唐開元年道家經典著作《道藏》收錄中華九大仙草(鐵皮石斛、天山雪蓮、三兩重人參、百二十年首烏、花甲之茯苓、蓯蓉、深山靈芝、海底珍珠、冬蟲夏草)，因鐵皮石斛滋陰補虛效果顯著，被列為“中華九大仙草”之首位。李時珍《本草綱目》記載“強陰益精。久服，厚腸胃，補內絕不足，平胃氣，長肌肉，逐皮膚邪熱痱氣，腳膝疼冷痹弱，定智除驚，輕身延年。益氣除熱，健陽，逐皮膚風痹，骨中久冷， 補腎益力。治發熱自汗，癰疽排膿內塞。”在2010年版《中華人民共和國藥典》一部中單列， 與其它環草石斛、馬鞭石斛、黃草石斛、金釵石斛和鼓槌石斛等普通石斛種類區分，其功能與主治“益胃生津，滋陰清熱。用于陰傷津虧，口干煩渴，食少干嘔，病后虛熱，目暗不明。”
因屬瀕危、珍稀、高附加值的資源性藥材，鐵皮石斛被列入《國家重點保護野生藥材物種名錄》(1987年)、《中國植物紅皮書》(1992年)、《瀕危野生動植物種國際貿易公約》 (CITES)附錄II。2010年，鐵皮石斛生產技術及產業化再次被列入國家重點新產品計劃和國家火炬計劃的優先發展技術領域。石斛作為一種常用中藥材，市場需求量較大，如何解決需求與資源之間的矛盾？惟一的途徑是人工栽培。自古至今，人們一直在探索石斛的人工栽培，但由于石斛屬植物的繁殖系數低，年產量有限，進入盛產期時間長，不能形成規模，產量極其有限。目前普遍存在組培苗移栽成活率低的情況。怎樣提高鐵皮石斛栽培的成活率，成為制約石斛生產發展的一大障礙。在自然狀態下，蘭科植物要與真菌共生形成菌根， 才能使蘭科植物健壯的生長。根據這個特點，我們自1992年開始從事鐵皮石斛菌根真菌的分離、培養及鐵皮石斛栽培種植菌根化方法的研究。

發明內容
本發明目的在于提供一種鐵皮石斛栽培種植菌根化的方法。該方法可以解決鐵皮石斛繁殖及栽培成活率低，栽培生長緩慢，周期長，有效成分含量低，藥效差等問題。本發明采用的方法是先分別培養菌根真菌，再將菌根真菌與鐵皮石斛莖誘導組培出的煉化苗共生栽培。本發明所述方法的步驟如下 (1)菌根真菌的培養
將菌根真菌LP2、菌根真菌LP3或兩種的混合菌株自低溫保藏的斜面試管經菌種活化后，接于PDA平皿中，于23 28°C (優選24 26°C)恒溫培養10 15 d(優選1廣13 d)， 在菌落邊緣打孔成菌片(優選Φ=8 mm)，并以小塊接入固體培養基或液體培養基；菌根真菌LP2為半知菌亞門鐮刀菌屬iFusarium sp.)，菌根真菌LP3為半知菌亞門輪枝霉屬 {Verticillium sp.)；該兩種菌種保藏于中國藥用微生物菌種保藏管理中心，保藏編號分別為 CPCC810233 和 CPCC421139 ；
菌根真菌的固體培養基含有木質素、纖維素、碳、氮等營養素，由選自原料棉籽殼、木屑、碎玉米芯、闊葉樹鋸末、麥麩中的一種或幾種組成，加水，水量為原料的15(T200 wt%(優選16(T180 wt%)；高壓滅菌后分別接入經培養所得菌根真菌LP1，每100 g培養基接2 3片菌片；真菌用試管、錐形瓶或培養瓶等器皿靜置暗培養，待菌絲大部分或全部長滿培養基時取出備用；
菌根真菌的液體培養基含有葡萄糖、無機鹽類成分和天然添加物；菌根真菌的液體培養基用水配制，其中葡萄糖If 22 g/L(優選20 g/L)，KH2PO4 18^22 g/L(優選20 g/L)， MgSO4 1.2 1.8 g/L(優選1.5 g/L)，維生素B1 8 12 mg/L(優選10 mg/L)，天然物麥麩 25 35 g/L (優選30 g/L)(煮汁)或馬鈴薯180 220 g/L (優選200 g/L)(使用其浸出液)，培養基PH值為5.6飛.5(優選？!1=6.0)；高壓滅菌后接入經培養所得菌根真菌LPl，每 100 mL培養基接入廣2片菌片；真菌用三角瓶或其他容器通氣暗培養，盛裝量為50%，置于 23 25°C振蕩，轉速10(T120 rpm，培養2(T30 d后收獲；培養結束后得到液態菌根真菌，可直接使用或用勻漿機打碎培養產物備用；
(2)鐵皮石斛組培苗培養
取生長良好的鐵皮石斛植株上的萌發芽，取其莖段，消毒，接種于誘導培養基(1/2-1) MS +BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+3 wt%蔗糖+0. 75 wt%瓊脂；經誘導形成黃綠色的原球莖轉接于增殖分化培養基(1/2-1) MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L +10 wt%香蕉汁+3 wt%蔴糖+0.75 wt%瓊脂，2個月繼代一次，得到有根有葉的小苗；再將有根有葉的小苗接種于培養基(l/2-l)MS+10 wt% 香蕉汁+NAA 2.0 mg/L+3 wt% 蔗糖+0. 75 wt% 瓊脂，使其生長;
(3)配制營養液
營養液由以下組分構成硝酸鉀1. (Tl. 2 wt%。(優選1.1 wt%。)，硫酸銨0. 18 0.22 wt % (優選 0. 2 wt %o )，硝酸銨 0. 08 0. 12 wt %。(優選 0. 1 wt %。)，硫酸鎂 0. Γθ. 14 wt% (優選 0. 12 wt%。)，磷酸二氫鉀 0. 08 0. 12 wt%。(優選 0. 10 wt%。)，氯化鈣 0. 04 0. 08 wt% (優選 0. 06 wt% )，硫酸錳 0. ΟΓΟ. 03 wt% (優選 0. 02 wt%。)，硫酸亞鐵 0. 02 0. 04 wt% (優選 0. 03 wt% )，硫酸鋅 0. 004 0. 006 wt%。(優選 0. 005 wt%。)，其余為水；
(4)組培苗的水培煉苗
將得到的鐵皮石斛培養苗取出，用15 20°C (優選17°C)的清水沖洗，浙去多余水分， 栽種于架在營養液槽上的打好小孔的泡沫板的孔隙中，將營養液注入營養液槽中，使營養液浸沒根系的40飛0%，開動營養液槽的循環水泵，流速4飛m/s;通風，風速0.3 0.5 m/s, 進行種苗煉化；1壙22 d后，鐵皮石斛種苗根系發達，再生根增多，莖長長增粗，葉片變綠，變厚，即可以拔出進行大田移栽；
(5)鐵皮石斛種植菌根化栽培
①鐵皮石斛組培苗移栽
將可以移栽的經過水培煉化的組培苗根部用清水清洗，清洗時注意盡量不要折斷莖，損傷葉片；栽培基質采用砂礫巖粉末與土壤(優選崑山砂礫巖粉末與崑山土壤)按重量比為1:廣2的混合物；移栽前，在每株苗的基部放置5 10 g粉碎的麥麩糖樹葉(山毛櫸科)， 其上再放置1.5 2. 5 mL前述步驟制備的液體菌根真菌或1.5 2. 5 g前述步驟制備的固體菌根真菌，使鐵皮石斛的根與菌接觸；栽培時將根埋在基質中，莖上部露出基質表面，栽后要澆定根水，基質保持75%水分；將苗栽在苗盤或花盆中，栽時單株苗即可，不需要多株栽在一起，栽培距離為3、cm；
②溫度和濕度的控制
將移栽有組培苗的苗盤或花盆移入薄膜大棚，鐵皮石斛的生長溫度控制在25 30°C，夏季采用75%的遮陽網覆蓋，把塑料薄膜掀開，以利降溫；冬天用30%的遮陽網覆蓋，或者去掉遮陽網把塑料薄膜放下；鐵皮石斛移栽初期要求濕度大，空氣濕度保持在75、0%，基質保持濕潤而不積水；
③鐵皮石斛的收獲
鐵皮石斛栽后1(Γ18個月(優選16個月)可收獲，收獲時可連根取出，洗凈栽培基質， 去除因清洗沾在表面的水分。本發明的鐵皮石斛栽培種植菌根化方法，能明顯促進鐵皮石斛幼苗生長，接菌栽培的鐵皮石斛比對照植株生根數量增多，植株的長度、長勢更好，節間明顯膨大，莖明顯粗壯，鮮重和干重均有提高。接菌植株的抗逆性也明顯增強。鐵皮石斛種苗的生物堿等化學成分含量也提高至野生石斛含量水平，保證了菌根共生后鐵皮石斛的藥材質量，為菌根真菌應用于鐵皮石斛規模化、規范化種植提供了科學依據。解決了鐵皮石斛植株生長慢，成活率低等問題。另外，本發明不施任何化肥和農藥，綠色環保，栽培方法簡單，投資少。
具體實施例方式
以下結合實施例對本發明進行進一步說明。實施例1
LP2組的操作步驟如下 1、菌根真菌的培養
本實施例采用菌根真菌LP2菌株自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，接于PDA平皿中， 于25°C恒溫培養12 d，在菌落邊緣打孔成菌片(Φ=8 mm)，并以小塊接入液體培養基。菌根真菌LP2為半知菌亞門鐮刀菌屬(Fusarium印.)，該菌種目前保藏于中國藥用微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CPCC810233。菌根真菌采用液體培養基，培養基的配制用水配制，葡萄糖20 g/L，KH2PO4 20 g/ L,MgS04 1.5 g/L，維生素B1 10 mg/L，天然物麥麩30 g/L (煮汁)，培養基pH=6. 0。高壓滅菌后接入上述真菌，每100 mL培養基接入2片菌片(Φ=8 mm)；真菌用三角瓶通氣暗培養， 盛裝量為50%，置于25°C振蕩，轉速100 rpm，培養25 d后收獲。培養結束后得到液態菌根真菌，可直接使用或用勻漿機打碎培養產物，得到液體菌根真菌。2、鐵皮石斛組培苗培養
取生長良好的鐵皮石斛植株上的萌發芽，取其莖段，消毒，接種于誘導培養基(1/2-1) MS +BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+3 wt%蔗糖+0. 75 wt%瓊脂；經誘導形成黃綠色的原球莖轉接于增殖分化培養基(1/2-1) MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L +10 wt%香蕉汁+3 wt%蔴糖+0. 75 wt%瓊脂)，2個月繼代一次，得到有根有葉的小苗；再將有根有葉的小苗接種于培養基(l/2-l)MS+10 wt% 香蕉汁+NAA 2.0 mg/L+3 wt% 蔗糖+0. 75 wt% 瓊脂，使其生長。3、配制營養液
營養液由以下組分構成硝酸鉀1. 1 Wt%。，硫酸銨0. 2 wt%。，硝酸銨0. 1 wt%。，硫酸鎂 0. 12 wt%。，磷酸二氫鉀0. 10 wt%。，氯化鈣0. 06 wt%。，硫酸錳0. 02 wt%。，硫酸亞鐵0. 03 wt%。，硫酸鋅0. 005 wt%。，其余為水。4、組培苗的水培煉化
準備營養液槽，將打好小孔(Φ=5 mm)的泡沫板(厚5 mm)架于營養液槽上；將鐵皮石斛培養苗取出用17士 1°C的清水沖洗，浙去多余水分，栽種于泡沫浮板的孔隙中，將營養液注入營養液槽中，使營養液浸沒根系50%，開動營養液槽的循環水泵，流速5米/秒；通風， 風速0.4 m/s，進行種苗煉化。20 d后，鐵皮石斛種苗根系發達，再生根增多，莖長長增粗， 葉片變綠，變厚，即可以拔出進行移栽。5、鐵皮石斛種植菌根化栽培 (1)鐵皮石斛組培苗移栽
將可以移栽的經過水培煉化的組培苗根部用清水清洗，清洗時注意盡量不要折斷莖， 損傷葉片；栽培基質采用崑山砂礫巖粉末與崑山土壤按重量比為1 :2。移栽前，在每株苗的基部放置8 g粉碎的麥麩糖樹葉(山毛櫸科)，其上再放置2. 5 mL前述步驟制備的液體菌根真菌，使鐵皮石斛的根與菌接觸；栽培時將根埋在基質中，莖上部露出基質表面，栽后要澆定根水，基質保持75%水分；將苗栽在苗盤或花盆中，栽時單株苗即可，不需要多株栽在一起，栽培距離為4 cm。(2)溫度和濕度的控制
將移栽有組培苗的苗盤或花盆移入薄膜大棚，鐵皮石斛的生長溫度控制在27 士 1 °C，夏季采用75%的遮陽網覆蓋，把塑料薄膜掀開，以利降溫；冬天用30%的遮陽網覆蓋，或者去掉遮陽網把塑料薄膜放下；鐵皮石斛移栽初期要求濕度大，空氣濕度保持在80%，基質保持濕潤而不積水。(3)鐵皮石斛的收獲
鐵皮石斛栽后16個月可收獲，收獲時可連根取出，洗凈栽培基質，去除因清洗沾在表面的水分。對照組植株不接菌自然生長，其他所有步驟接菌組一致。本實施例實驗結果如表1
“*”表示與對照組相比差異達顯著水平，“**”表示與對照組相比差異達極顯著水平。 生物堿含量采用酸堿滴定法測定；呼吸速率采用光合測定儀測定。
實施例2
本實施例基本操作條件同實施例1，不同之處在于
1、本實施例用的菌根真菌為菌根真菌LP2和菌根真菌LP3。菌根真菌LP2為半知菌亞門鐮刀菌屬、Fusarium 577.)，菌根真菌LP3為半知菌亞門輪枝霉屬、VerticiIlium sp.)。 該兩種菌種目前保藏于中國藥用微生物菌種保藏管理中心，保藏編號分別為CPCC810233 和 CPCC421139。2、真菌菌株培養采用固體培養，菌根真菌的固體培養基組成為棉籽殼與打碎的玉米芯按重量比1:1混合后加水，加水量為原料重量的170 Wt%0高壓滅菌后分別接入上述真菌，每100 g培養基接2片菌片(Φ=8 mm)。真菌用錐形瓶靜置暗培養，待菌絲大部分或全部長滿培養基時取出備用。對照組植株不接菌自然生長，其他所有步驟接菌組一致。實驗結果如表2:
權利要求
1. 一種鐵皮石斛栽培種植菌根化生產方法，其特征在于步驟如下(1)菌根真菌的培養將菌根真菌LP2、菌根真菌LP3或兩種的混合菌株自低溫保藏的斜面試管經菌種活化后，接于PDA平皿中，于23 28°C恒溫培養1(T15 d，在菌落邊緣打孔成菌片，并以小塊接入固體培養基或液體培養基；菌根真菌LP2為半知菌亞門鐮刀菌屬iFusarium印.)，菌根真菌LP3為半知菌亞門輪枝霉屬iyerticilliim sp.)；該兩種菌種保藏于中國藥用微生物菌種保藏管理中心，保藏編號分別為CPCC810233和CPCC421139 ；菌根真菌的固體培養基含有木質素、纖維素、碳、氮等營養素，由選自原料棉籽殼、木屑、碎玉米芯、闊葉樹鋸末、麥麩中的一種或幾種組成，加水，水量為原料的15(Γ200襯％;高壓滅菌后分別接入經培養所得菌根真菌LP1，每100 g培養基接2 3片菌片；真菌用試管、 錐形瓶或培養瓶等器皿靜置暗培養，待菌絲大部分或全部長滿培養基時取出備用；菌根真菌的液體培養基含有葡萄糖、無機鹽類成分和天然添加物；菌根真菌的液體培養基用水配制，其中葡萄糖18 22 g/L，KH2PO4 18 22 g/L，MgSO4 1.2^1.8 g/L，維生素B1 8 12 mg/L，天然物麥麩25 35 g/L(煮汁)或馬鈴薯180 220 g/L(使用其浸出液)，培養基PH值為5. 6飛.5;高壓滅菌后接入經培養所得菌根真菌LPl，每100 mL培養基接入廣2片菌片；真菌用三角瓶或其他容器通氣暗培養，盛裝量為50%，置于23 25°C振蕩，轉速 100^120 rpm，培養2(T30 d后收獲；培養結束后得到液態菌根真菌，可直接使用或用勻漿機打碎培養產物備用；(2)鐵皮石斛組培苗培養取生長良好的鐵皮石斛植株上的萌發芽，取其莖段，消毒，接種于誘導培養基(1/2-1) MS +BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+3 wt%蔗糖+0. 75 wt%瓊脂；經誘導形成黃綠色的原球莖轉接于增殖分化培養基(1/2-1) MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L +10 wt%香蕉汁+3 wt%蔴糖+0.75 wt%瓊脂，2個月繼代一次，得到有根有葉的小苗；再將有根有葉的小苗接種于培養基(l/2-l)MS+10 wt% 香蕉汁+NAA 2.0 mg/L+3 wt% 蔗糖+0. 75 wt% 瓊脂，使其生長;(3)配制營養液營養液由以下組分構成硝酸鉀1. (Tl. 2 wt%。，硫酸銨0. 18、.22 wt%。，硝酸銨 0. 08 0. 12 wt%。，硫酸鎂 0. Γ0. 14 wt%。，磷酸二氫鉀 0. 08 0. 12 wt%。，氯化鈣 0. 04 0. 08 wt%。，硫酸錳0.0廣0.03 wt%。，硫酸亞鐵0.02 0.04 wt%。，硫酸鋅0. 004 0. 006 wt%。，其余為水；(4)組培苗的水培煉苗將得到的鐵皮石斛培養苗取出，用15 20°C的清水沖洗，浙去多余水分，栽種于架在營養液槽上的打好小孔的泡沫板的孔隙中，將營養液注入營養液槽中，使營養液浸沒根系的 40飛0%，開動營養液槽的循環水泵，流速4飛m/s;通風，風速0.3 0.5 m/s，進行種苗煉化； If 22 d后，鐵皮石斛種苗根系發達，再生根增多，莖長長增粗，葉片變綠，變厚，即可以拔出進行大田移栽；(5)鐵皮石斛種植菌根化栽培①鐵皮石斛組培苗移栽將可以移栽的經過水培煉化的組培苗根部用清水清洗，清洗時注意盡量不要折斷莖， 損傷葉片；栽培基質采用砂礫巖粉末與土壤按重量比為1:廣2的混合物；移栽前，在每株苗的基部放置5 10 g粉碎的麥麩糖樹葉(山毛櫸科)，其上再放置1. 5^2. 5 mL前述步驟制備的液體菌根真菌或1. 5^2. 5 g前述步驟制備的固體菌根真菌，使鐵皮石斛的根與菌接觸； 栽培時將根埋在基質中，莖上部露出基質表面，栽后要澆定根水，基質保持75%水分；將苗栽在苗盤或花盆中，栽時單株苗即可，不需要多株栽在一起，栽培距離為3、cm ；②溫度和濕度的控制將移栽有組培苗的苗盤或花盆移入薄膜大棚，鐵皮石斛的生長溫度控制在25 30°C，夏季采用75%的遮陽網覆蓋，把塑料薄膜掀開，以利降溫；冬天用30%的遮陽網覆蓋，或者去掉遮陽網把塑料薄膜放下；鐵皮石斛移栽初期要求濕度大，空氣濕度保持在75、0%，基質保持濕潤而不積水；③鐵皮石斛的收獲鐵皮石斛栽后1(Γ18個月可收獲，收獲時可連根取出，洗凈栽培基質，去除因清洗沾在表面的水分。
2.根據權利要求1所述的鐵皮石斛栽培種植菌根化生產方法，其特征在于所述將菌根真菌管經菌種活化后，接于PDA平皿中，于M 26°C恒溫培養1廣13 d。
3.根據權利要求1所述的鐵皮石斛栽培種植菌根化生產方法，其特征在于所述菌根真菌的固體培養基的加水量為原料的16(T180 wt%0
4.根據權利要求1所述的鐵皮石斛栽培種植菌根化生產方法，其特征在于所述菌根真菌的液體培養基用水配制，其中葡萄糖20 g/L, KH2PO4 20 g/L,MgSO4 1.5 g/L，維生素B1 10 mg/L，天然物麥麩30 g/L (煮汁)或馬鈴薯200 g/L (使用其浸出液)，培養基pH值為6.0。
5.根據權利要求1所述的鐵皮石斛栽培種植菌根化生產方法，其特征在于所述營養液由以下組分構成硝酸鉀1. 1 wt%。，硫酸銨0. 2 wt%。，硝酸銨0. 1 wt%。，硫酸鎂0. 12 wt%0, 磷酸二氫鉀0. 10 wt%。，氯化鈣0. 06 wt%。，硫酸錳0. 02 wt%。，硫酸亞鐵0.03 wt%。，硫酸鋅 0.005 wt%。，其余為水。
6.根據權利要求1所述的鐵皮石斛栽培種植菌根化生產方法，其特征在于所述組培苗的水培煉苗時，將前述步驟得到的鐵皮石斛培養苗取出，用17°C的清水沖洗，浙去多余水分。
7.根據權利要求1所述的鐵皮石斛栽培種植菌根化生產方法，其特征在于所述鐵皮石斛組培苗移栽時，栽培基質采用崑山砂礫巖粉末與崑山土壤的混合物。
8.根據權利要求1所述的鐵皮石斛栽培種植菌根化生產方法，其特征在于所述鐵皮石斛栽后16個月可收獲。
全文摘要
一種鐵皮石斛栽培種植菌根化生產方法，其步驟如下(1)采用固體或液體培養基培養菌根真菌，菌根真菌為菌根真菌LP2半知菌亞門鐮刀菌屬(Fusariumsp.)、菌根真菌LP3或兩種的混合菌株半知菌亞門輪枝霉屬(Verticilliumsp.)；(2)鐵皮石斛組培苗培養；(3)配制營養液；(4)組培苗的水培煉苗；(5)鐵皮石斛種植菌根化栽培。本發明的鐵皮石斛栽培種植菌根化方法，能明顯促進鐵皮石斛幼苗生長，接菌栽培的鐵皮石斛比對照植株生根數量增多，成活率高，植株的長度、長勢更好，節間明顯膨大，莖明顯粗壯，鮮重和干重均有提高，接菌植株的抗逆性也明顯增強。
文檔編號C12R1/77GK102150615SQ20101058264
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月10日 優先權日2010年12月10日
發明者吳維佳, 崔曉娟, 張蘇鋒, 李 杰, 梁經軍, 趙興兵, 高正龍, 黃生云 申請人:梁經軍