專利名稱：一種用于生態土壤系統基質dna的提取方法
技術領域：
本發明屬于土壤微生物學領域，具體涉及一種用于生態土壤系統基質DNA的提取 方法。
背景技術：
20世紀80年代以來，生態土壤系統受到廣泛關注，在提高凈化效率的同時，污染 物的去除已由經驗工程走向定性、定量分析。在生態土壤系統中，由于長期種植植物，形成 了獨特的基質微生物群落，它們積極參與系統基質物質轉化過程，在污染物去除、植物養分 有效化和基質層結構的改良等方面起著重要作用，因此對基質微生物相進行深入研究具有 重要意義。研究者曾利用傳統方法對土壤中的微生物進行了廣泛研究，但近年來科學研究 發現自然界中絕大部分微生物不能純培養。因此，20世紀80年代中期以來，一些微生物學 家開始通過免培養法，直接利用分子生物學的方法對環境中微生物的存在、群落結構、功能 等情況進行研究。免培養法的前提是提取土壤微生物總DNA。提取高質量的DNA是免培養 法的基礎和關鍵。在提取土壤微生物總DNA時，不僅要最大限度地保證所提DNA的代表性， 而且要保證片段足夠大、雜質少、適合后期的分子生物學操作。20世紀90年代，國內外在這 方面作了大量的研究，但目前常規抽提方法，如SDS-酚氯仿抽提法提取的DNA產量低且雜 質較多，特別是腐殖酸等雜質會嚴重影響后續的分子生物學實驗操作，降低所得信息的精 確度。目前，隨著分子生物學技術的應用范圍越來越廣，針對不同土壤類型微生物DNA提取 技術的研究迫在眉睫。本發明將為進一步研究生態土壤系統微生物分布與污染物去除率的 相關關系提供技術支持。
發明內容
本發明公開了一種用于定性、定量評價生態土壤系統基質功能菌的微生物基因組 DNA提取方法。本發明用于生態土壤系統基質DNA的提取方法，其步驟是
(1)在細胞裂解前對樣品進行預處理稱取土樣，加入TE緩沖液，渦旋振蕩1分鐘，放入 超聲波常溫水浴10分鐘，上清液中再加TE緩沖液，搖勻，在4°C，10，OOOXrpm下離心5分 鐘，移去上清液；
(2)經過預處理后的土樣中加入磷酸鈉緩沖液和MT緩沖液，置于!^astft 印儀器上2 分鐘，速度5. 5，冰上冷卻后，在4°C，14，000 X g下離心15分鐘，上清液中加入PPS試劑，在 4°C, 14, OOOXg下離心5分鐘，上清液中加入Binding Matrix懸浮液，待蛋白質沉淀，移 去上清液，混合物轉移至SPIN 濾管中，在4°C，14，000 X g下離心后，加入SEWS-M，在4°C， 14，OOOXg下離心，移去SPIN 濾管，放入試劑盒提供的試管中，室溫干燥5分鐘，加入DES 和重懸的DNA洗脫液體，在4°C，14，OOOXg下離心后轉移洗脫的DNA到試管中進行濃度分 析，分離的DNA，貯存于-20°C。本發明的創新之處在于通過土壤預處理，去除腐殖質，提高DNA產量，所提取的基
3質微生物DNA可直接應用于分子操作，具有簡便，重復性好，準確可靠的特點。
具體實施例方式供試土樣為3種生態土壤系統基質，系統中種植植物分別為蘆葦、菖蒲和茭白。實施例一SDS-酚氯仿抽提法
稱取Ig 土壤樣品，加入Irnl 0. lmol/1磷酸緩沖液(pH 8. 0)，加入直徑為0. 1,0. 5和 5mm玻璃珠各0. 5g，振蕩1分鐘，溶菌酶5mg，終濃度為2. 5mg/ml，室溫振蕩15分鐘，放置冰 箱30分鐘，加125μ1 20%的SDS溶液振蕩處理15分鐘，離心，分裝EP管，加酚(1 1體積) 抽提1次，氯仿-異戊醇(1:1體積)抽提2次，加0. 6體積異丙醇，室溫放置1小時，離心， 70%乙醇清洗，200μ1 TE溶解。實施例二 本發明
在細胞裂解前對樣品進行預處理，稱取5g 土樣，加入5ml TE緩沖液，渦旋振蕩1分鐘， 放入超聲波常溫水浴10分鐘，上清液中再加5ml TE緩沖液，搖勻，在4°C，10，OOOXrpm下 離心5分鐘，移去上清液。經過預處理后的土樣中加入978μ1磷酸鈉緩沖液(pH 8. 0分2次 加)，轉移至Lysing Matrix E試管中(取自試劑盒)，再加入122μ1 MT緩沖液，置于i^astft·印 儀器上2分鐘，速度5. 5，冰上冷卻后，在4°C，14，OOOXg下離心15分鐘，上清液中加入 250μ1 PPS試劑，在4°C，14，000 Xg下離心5分鐘，上清液中加入Iml Binding Matrix懸 浮液，翻轉混合，靜置待蛋白質沉淀，移去上清液，混合物轉移至SPIN 濾管(取自試劑盒) 中，在4°C，14，000 X g下離心2分鐘后，加入500μ1 SEWS-M,在4°C，14，000 X g下離心1分 鐘，移去SPIN 濾管，放入試管中，室溫干燥5分鐘，加入75μ1 DES和重懸的DNA洗脫液，在 414, OOOXg下離心1分鐘后轉移洗脫的DNA到試管中進行濃度分析，分離的DNA，貯存 于-20 0C ο基質DNA的提取結果對比見表1。由表1可知，本發明方法在DNA提取效率上表現 出很大的優勢，提取的DNA產量平均值達到了 58. 68Pg/g 土，而SDS-酚氯仿抽提法DNA得 率相對較低。
權利要求
1. 一種用于生態土壤系統基質DNA的提取方法，其特征在于包括以下步驟(1)在細胞裂解前對樣品進行預處理稱取土樣，加入TE緩沖液，渦旋振蕩1分鐘，放入 超聲波常溫水浴10分鐘，上清液中再加TE緩沖液，搖勻，在4°C，10，OOOXrpm下離心5分 鐘，移去上清液；(2)經過預處理后的土樣中加入磷酸鈉緩沖液和MT緩沖液，置于FastPr印儀器上2 分鐘，速度5. 5，冰上冷卻后，在4°C，14，000 X g下離心15分鐘，上清液中加入PPS試劑，在 4°C, 14, OOOXg下離心5分鐘，上清液中加入Binding Matrix懸浮液，待蛋白質沉淀，移 去上清液，混合物轉移至SPIN 濾管中，在4°C，14，000 X g下離心后，加入SEWS-M，在4°C， 14，OOOXg下離心，移去SPIN 濾管，放入試劑盒提供的試管中，室溫干燥5分鐘，加入DES 和重懸的DNA洗脫液體，在4°C，14，OOOXg下離心后轉移洗脫的DNA到試管中進行濃度分 析，分離的DNA，貯存于-20°C。
全文摘要
本發明屬于土壤微生物學領域，具體涉及一種用于生態土壤系統基質DNA的提取方法。該方法是在細胞裂解前先對樣品進行預處理，再將經過預處理后的土樣中加入磷酸鈉緩沖液和MT緩沖液，分離DNA。本發明通過土壤預處理，去除腐殖質，提高DNA產量，所提取的基質微生物DNA可直接應用于分子操作，具有簡便，重復性好，準確可靠的特點。
文檔編號C12N15/10GK102094004SQ201010589338
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月15日 優先權日2010年12月15日
發明者王延華 申請人:南京師范大學