一種直接從土壤或其他基質中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲的方法

專利名稱：一種直接從土壤或其他基質中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲的方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學檢測鑒定技術領域，具體涉及一種直接從土壤或其他基質中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲的方法。
背景技術：
害藍穿系歲電XRadopholussimilis (Cobb) Thorne, 1949)是一種遷移性植物內寄生線蟲，已報道的寄主植物超過250種(O’Bannon，1977)，嚴重為害香蕉(ifesa spp.)、柑橘(CYtras spp.)、胡椒(/ /" nigrum、、生姜{Zingier o//ici/ a7e)等多種經濟植物和觀賞植物(Luc et al, 1990 ；Richardson et al, 1993 ；Uchida et al,2003 ；Sundararaju etal，1979)，香蕉穿孔線蟲廣泛分布于熱帶和亞熱帶的大部分香蕉產區和溫帶地區的溫室中，已報道有該線蟲分布的國家和地區超過90個(謝輝，2006)，是諸多國家的重要檢疫危險性植物有害生物(Cotton J et al ;0EPP/EPP0，2008)，也是中國禁止進境植物檢疫性有害生物(中華人民共和國農業部，2007)。香蕉穿孔線蟲最早是由美國線蟲學家Cobb在1891年從采自斐濟的香蕉(ifesa sp.)根部發現的，從19世紀開始隨著香蕉球莖和蕉苗等種植材料在香蕉種植國家和地區間傳播，20世紀60年代該線蟲隨著觀賞植物傳播到法國、比利時等歐洲國家的溫室中，到20世紀末世界上大多數香蕉種植區都有該線蟲分布(Gowen etal, 1990 ；Loof, 1991 ；ffillams et al, 1973 ；Marin et al，1998)。中國臺灣在 1971 年從美國夏威夷引進的火鶴花上發現香蕉穿孔線蟲(羅宗爵等，1973);中國內地口岸，從20世紀80年代開始多次從進境香蕉苗和觀賞植物上截獲香蕉穿孔線蟲(林奇力，1986 ;宋紹等，1999 ;陳勇等，2002 ;鐘國強等，1999 ;孫國坤，2004 ;張紹生等，2003 ;李一農等，2004 ;趙立榮等，2004 ;鐘國強等，2005 ;鐘國強等，2004 ;黃發余等，2001a ;黃發余等，2001b ;黃發余等，2002 ;蔣寒等，2004)。可見，隨著經濟及農業生產和農產品貿易迅速發展，植物種苗等種植材料在國家和地區間調運的數量不斷增加，而其中很多植物是香蕉穿孔線蟲的寄主，從而促使了香蕉穿孔線蟲在世界廣泛的傳播。由于香蕉穿孔線蟲對作物為害所造成的損失非常大，要有效阻止香蕉穿孔線蟲在國家和地區間的傳播和擴散，需要加強對引進和調運的香蕉穿孔線蟲寄主植物及其攜帶土壤或基質進行檢測，并準確快速的檢測鑒定可能攜帶的香蕉穿孔線蟲。香蕉苗和觀賞植物是目前攜帶傳播香蕉穿孔線蟲風險最大的寄主植物，因此加強對可能攜帶該線蟲的植物種植材料及其粘附的土壤或其他栽培基質的檢測至關重要。但常規檢測方法要首先對可疑植物攜帶的土壤或者基質進行分離，在體視顯微鏡下對分離到的線蟲進行形態觀察，然后挑出疑似香蕉穿孔線蟲，再進行具體的形態學鑒定或者進行分子檢測鑒定。這種檢測鑒定方法需要的時間相對較長，并且操作人員需具備專門的植物線蟲鑒定技能和經驗才能在體視顯微鏡下檢測鑒定并挑出疑似香蕉穿孔線蟲。本課題組已成功建立了從植物組織中直接檢測鑒定香蕉穿孔線蟲的分子生物學技術(劉一帆等.從混合線蟲樣品和植物組織中直接檢測香蕉穿孔線蟲的ITS-PCR方法.中國農業科學，2011，44(19) : 3991-3998)，而運用分子生學方法直接檢測鑒定土壤或基質中香蕉穿孔線蟲的技術尚未有報道。目前利用分子生物學方法直接檢測鑒定土壤中線蟲的報道很少。Qiu等(2006)用土壤DNA提取試劑盒和通用引物檢測鑒定出混在土壤中的南方根結線蟲(Meloidogyneincogniia)、花生根結線蟲CK arenaria)和爪睡根結線蟲Ql javanica) ；Yan和Smiley (Guiping Yan etc. , Detection and Discrimination of Pratylenchusneglectus and P. thornei in DNA Extracts from Soil, plant disease, November2008，Volume 92，Number 11:1480-1487)利用自制的DNA抽提緩沖液提取含有落選短體線蟲iPratylenchus fleWeciiAs)和索恩短體線蟲{P. thornei )的土壤DNA,并用其所計設的特異引物和建立的DNA提取及純化方法，實現了直接檢測鑒定土壤中的這2種線蟲的目的。

發明內容
本發明的目的是在Yan和Smiley研究的基礎上進行優化，得出一種可以直接從土 壤或其他基質中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲的方法。本發明通過以下技術方案實現上述目的
一種直接從土壤或其他基質中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲的方法，步驟如下
(I)待檢樣品中DNA提取
稱取待檢樣品，與等重的直徑0. 5 mm玻璃珠一起移至尖底離心管(優選規格為15mL的尖底離心管)中，加入體積比為1:1的磷酸緩沖液和SDS緩沖液，翻轉3 4次；
再加入體積比為24:1的氯仿和異戊醇，振蕩后以3 000 rpm的速度離心，上清轉移至一 I. 5 mL離心管；
加入預冷的醋酸鈉，混勻，_20°C靜置5 min，常溫離心，上清轉移至另一新I. 5 mL離心
管;
加入冷異丙醇，靜置20min，離心，沉淀加入體積百分含量為70%的乙醇洗滌，離心，棄上清，重復洗滌一次，離心；
沉淀自然風干，加入超純水靜置lOmin，獲得DNA粗提液。(2)使用 Promega 公司的 Wizard DNA Clean-up Systems 試劑盒純化步驟(I)的DNA提取液。(3)PCR檢測以純化的DNA為模板，SEQ ID NO: Γ2所示核苷酸序列為引物，進行PCR擴增，如果擴增出518bp的核苷酸序列，則證明待檢樣品中有香蕉穿孔線蟲。上述步驟(I)主要參照文獻(YanG , Smiley R ff. Detection anddiscrimination of Pratylenchus neglectus and P. thornei in DNA extracts fromsoil. Plant Disease, 2008，92 (11) : 1180-1487)的方法進行，但其中部分方法做了修改1)使用與加入待檢樣品等重且直徑為0. 5 mm的玻璃珠(ks I mm)；2)將待檢樣品和玻璃珠放入15 mL尖底離心管中(Ks 2 mL螺帽離心管)；3)離心時，轉速設置為3 000 rpm(vs 16 000 g)。上述檢測方法步驟(2 )是直接使用商品試劑盒，按試劑盒說明書操作即可。與Yan和Smiley (2008)的方法相比，使用試劑盒操作規范、易推廣，DNA純化效果好、被檢測靈敏度高。
作為一種優選方案，上述檢測方法步驟(3)所述PCR擴增反應使用(東洋紡)Τ0Υ0Β0公司的KOD FX酶進行PCR擴增，該酶具有高擴增率和高保真性等特征，擴增條帶清晰。上述檢測方法中步驟(3)所述PCR擴增反應優選反應體系為25PL :DNA模板5 μ ,2 XPCR buffer 12. 5 PL，2mmol/L 的 dNTP 5 μ , 10 Mmol/L 的 SEQ ID NO: I 引物 O. 75 μ ,10 Mmol/L的SEQ ID N0:2引物0. 75 μ ,ΚΟ FX酶0.5 μ ，用三蒸水補足體積；反應程序為94°C預變性2 min，98°C變性10 s，50°C退火30 s，68°C延伸I min，從變性到延伸進行35個循環，然后72°C再充分延伸5 min。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果
本發明建立的直接檢測鑒定土壤或基質中的香蕉穿孔線蟲的技術，采用了 Yan和Smiley (2008)的DNA提取方法，但DNA純化未采用Yan和Smiley (2008)的方法，而是采用Promega公司的Wizard DNA Clean-up Systems試劑盒,使DNA的純化效果更好、被檢 測靈敏度更高，使用本發明建立的PCR反應體系及程序和本課題組設計的特異性引物進行PCR擴增，實現了直接檢測鑒定出混在土壤或基質中的香蕉穿孔線蟲，靈敏度達到從O. 5 g土壤或基質中檢測出I條香蕉穿孔線蟲。本發明建立的檢測方法可直接從土壤或其他基質中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲的技術，不需對所采集的待檢測樣品進行線蟲分離和在體視顯微鏡進行初步的形態鑒定及挑蟲等過程，直接對土壤或其他基質進行總DNA的提取和純化，使用香蕉穿孔線蟲ITS區特異性引物進行常規PCR擴增，若O. 5g土壤或其他基質中有一條香蕉穿孔線蟲即能擴增出約500bp的特異片段，因此本發明的檢測鑒定方法具有簡便快速、省工和靈敏的優點。本發明的方法使用常規PCR儀和常規的PCR方法，是目前最為基礎的常用的分子生物學儀器和方法，因此實用性強易于推廣。本發明的方法可以實現香蕉穿孔線蟲病的早期診斷，防止香蕉穿孔線蟲病突發成災，可以加快口岸檢驗檢疫機關對進出口植物和基質的檢測水平和檢測速度，避免將帶有香蕉穿孔線蟲的植物和基質輸入中國，同時加快口岸驗放速度，減少貨物在貨存場存放的時間和費用；提聞我檢驗檢疫機關在國際貿易中的地位和形象。


圖I.用香蕉穿孔線蟲與土壤混合樣品的DNA模板進行特異性引物PCR擴增，其中a: 1-3. O. 5 g加入50條香蕉穿孔線蟲的土壤樣品，4-6，土壤樣品；b: 1-3. 0.5 g 土壤中加入5條香蕉穿孔線蟲，4-6. O. 5 g 土壤中加入4條香蕉穿孔線蟲；c: 1-3. 0.5 g 土壤中加入3條香蕉穿孔線蟲，4-6. 0.5 g 土壤中加入2條香蕉穿孔線蟲，7-9. 0.5 g 土壤中加入I條香蕉穿孔線蟲；M Marker DL2000。圖2.從發病巴西蕉根際土壤DNA模板中用特異性引物PCR擴增檢測香蕉穿孔線蟲，1-1 5-2 :發病巴西蕉根際土壤；6_1，6-2 :滅菌土 ；7 :三蒸水；M Marker DL2000。圖3.用香蕉穿孔線蟲與基質混合樣品的DNA模板進行特異性引物PCR擴增結果，a: 1-3.加入50條香蕉穿孔線蟲的O. 5 g基質樣品,4-6,土壤樣品；b: 1-3. 0.5 g基質中加入5條香蕉穿孔線蟲，4-6. O. 5 g基質中加入4條香蕉穿孔線蟲；c: 1-3. 0.5 g基質中加入3條香蕉穿孔線蟲，4-6. 0.5 g基質中加入2條香蕉穿孔線蟲，7-9. 0.5 g基質中加Λ I條香蕉穿孔線蟲；M Marker DL2000。圖4.從發病孔雀竹芋根際基質DNA模板中用特異性引物PCR擴增檢測香蕉穿孔線蟲，1-1飛-2.發病孔雀竹芋根際基質；6-1，6-2.滅菌土；7.三蒸水；M :Marker DL2000。
具體實施例方式實施例I從含有香蕉穿孔線蟲的土壤樣品中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲
試驗材料香蕉穿孔線蟲采自紅掌根際土壤的種群，本實驗室在25°C培養箱內培養保存在胡蘿卜愈傷組織上；土壤為采自大田香蕉根際土壤。具體實施步驟如下
1.香蕉穿孔線蟲與土壤混合樣品總DNA的提取
1.1稱取O. 5 g上述大田土壤樣品，裝入15 mL滅菌尖底離心管中，加入等重量的直徑為O. 5 mm的小玻璃珠；
1.2從培養香蕉穿孔線蟲的胡蘿卜愈傷組上分離獲得香蕉穿孔線蟲，在顯微鏡下分別挑取50、5、4、3、2及1條香蕉穿孔線蟲分別放進不同的裝有0.5 g 土壤的15 mL尖底離心管中，加入磷酸鹽緩沖液(100 mM NaH2PO4, pH 8. O)和SDS緩沖液(100 mM NaCl, 500 mMTris, pH 8. 0,10% SDS)各 300μ ，翻轉 3-4 次；
1.3加入氯仿異戊醇(體積比24:1) 400 μ ，用漩渦振蕩器以中速振蕩30 s，3 000rpm離心5 min,將上清(小于600 μ )轉移至I. 5 mL離心管中；
1.4加入300 PL預冷的NaOAc (3Μ，ρΗ5. 2)，上下顛倒混勻，置于_20°C冷凍箱中放置5 min,取出后以12 OOOrpm離心5 min,將上清(不超過650 KL)轉移至一新I. 5 mL尖底離心管中；
1.5加入600 μ 冷的異丙醇，室溫放置20 min用于沉淀DNA，然后12 OOOrpm離心5min,棄上清液，加入700 mL體積百分含量為70%的無水乙醇，輕輕旋轉，充分洗滌DNA沉淀，12 000 rpm離心5 min,再棄上清,重復洗漆一次；
1.6將DNA沉淀置于室溫，待其自然風干后，加入100 PL超純水，室溫放置10 min，使DNA充分溶于水中獲得DNA粗提液，可直接進行下一步實驗，也可放_20°C保存備用。2.香蕉穿孔線蟲與土壤DNA粗提液的純化
2.I 先混勻純化試劑盒(Wizard DNA Clean-up Systems, Promega)中裝有溶液 Resin的小瓶(若有沉淀，37°C水浴10 min)，取I mL Resin到保存的100 μ L DNA粗提液中，顛倒混勻；
2.2去掉10 mL注射器針頭，與試劑盒中的純化柱擰緊在一起，加入步驟(I)的混合液到注射器管中，過濾混合液；
2.3加入2 mL 80%異丙醇到注射器管中，再次過濾；
2.4將純化柱放入I. 5 mL離心管中，12 000 rpm離心2 min ；
2.5將純化柱轉移至另一新I. 5 mL離心管中，加入50 μ L在65°C水中預熱的TE緩沖液(10 mM Tris, I mM EDTA,pH 8. O),靜置 I min, 12 000 rpm 離心 20 s,收集離心管中的DNA，得到純化的DNA，可直接用于下一步實驗或_20°C保存備用。3從香蕉穿孔線蟲與土壤混合樣品純化的DNA中特異性檢測香蕉穿孔線蟲DNA片段3.I合成已設計的香蕉穿孔線蟲ITS區特異引物
上游引物 PF (5，-CTACAAATGTGACGCGAA-3，SEQ ID N0:1),
下游引物 PR (5，-CMTCTGC ACAA TGAACATAC-3，SEQ ID N0:2)；
3.2香蕉穿孔線蟲特異性擴增PCR反應體系和程序如下
在200 μ L PCR管中，配置25 μ L反應 體系取步驟2. 5 DNA模板5 μ L,2XPCRbuffer (TOYOBO 公司)12.5 μ L, dNTP (2 mM each) 5 yL (TOYOBO)，上游引物 PF(10 μ Μ) O. 75 μ L，下游引物 PR (10 μ Μ) O. 75 μ L，KOD FX 酶(1U / μ L) O. 5 μ L(TOYOBO)，其余用三蒸水補足。在Bio-rad S1000 PCR儀上設定反應程序為94°C預變性2 min，98°C變性10 s,50°C退火30 s，68°C延伸I min，從變性到延伸進行35個循環，然后72°C再充分延伸5 min。把各PCR反應管放入PCR儀內，蓋好蓋子，按設定程序進行PCR擴增。3. 3瓊脂糖凝膠電泳檢測
待3. 2 PCR反應結束后，取3 μ L產物在已經加入Goldview DNA燃料的1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，電壓為121 V，電泳結束后在凝膠成像系統上進行觀察、拍照和記錄，若出現500 bp的特異性片段說明有香蕉穿孔線蟲的存在(見圖I)。實施例2直接從發生香蕉穿孔線蟲病的香蕉根際土壤中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲
試驗材料本實驗室在溫室大棚內盆栽接種香蕉穿孔線蟲并且發病的巴西蕉根際土壤。具體實施步驟如下
取發病巴西蕉根際土壤約50(Tl 000g,充分混勻,稱取5份0. 5 g 土壤(編號1-5),此夕卜，再稱取0.5 g滅菌土(編號6)，分別放入15 mL滅菌離心管中，加入等重量的直徑為0.5 _的小玻璃珠；其他步驟同實施例1，檢測結果見圖2。由圖2可知，感染香蕉穿孔線蟲的巴西蕉根際土壤DNA經過PCR檢測有目的片段出現，而沒有香蕉穿孔線蟲的土壤DNA則未有檢測到目的片段。實施例3從香蕉穿孔線蟲和基質混合的樣品中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲
試驗材料香蕉穿孔線蟲的準備和獲得同實施例1，基質購自廣州芳村綠源園藝植物材料場。具體實施步驟如下
稱取0. 5g基質，裝入15mL滅菌離心管中，加入等重量的直徑為0. 5mm的小玻璃珠。其他步驟同實施例I。檢測結果見圖3。實施例4直接從發生香蕉穿孔線蟲病的孔雀竹芋根際基質中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲
試驗材料經鑒定發生香蕉穿孔病的孔雀竹芋根際土壤，采自華南農業大學花卉種植室。具體實施步驟如下
取發病孔雀竹芋根際基質土，充分混勻，稱取5份，每份0. 5g基質土，編號1-5，此外，再稱取0. 5g滅菌基質土，編號6，6份樣品分別放入15mL滅菌離心管中，加入等重量的直徑為0. 5mm的小玻璃珠。其他后續步驟同實施例I。檢測結果電泳圖見圖4，由該圖可知，感染香蕉穿孔線蟲的孔雀竹芋根際基質土 DNA經過PCR檢測有目的片段出現，而沒有香蕉穿孔線蟲的基質土 DNA則未有檢測到目的片段。以上實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的保護范圍不受上述實施例的任何限制，其他的任何不背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化 等，均應視為本發明等效的置換方式，包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種直接從土壤或其他基質中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲的方法，其特征在于步驟如下 (1)待檢樣品中DNA提取 稱取待檢樣品，與等重的直徑O. 5mm玻璃珠一起移至尖底離心管中，加入體積比為I: I的磷酸緩沖液和SDS緩沖液，翻轉3 4次； 再加入體積比為24:1的氯仿和異戊醇，振蕩后以3 OOO rpm的速度離心，上清轉移至一 I. 5 mL離心管； 加入預冷的醋酸鈉，混勻，_20°C靜置5min，常溫離心，上清轉移至另一新I. 5 mL離心管; 加入冷異丙醇，靜置20min，離心，沉淀加入體積百分含量為70%的乙醇洗滌，離心，棄上清，重復洗滌一次，離心； 沉淀自然風干，加入超純水靜置lOmin，獲得DNA粗提液； (2)使用Promega 公司的 Wizard DNA Clean-up Systems 試劑盒純化步驟(I)的 DNA粗提液； (3)PCR檢測以純化的DNA為模板，SEQ ID NO: I 2所示核苷酸序列為引物，進行PCR擴增，如果擴增出518bp的核苷酸序列，則證明待檢樣品中有香蕉穿孔線蟲。
2.根據權利要求I所述直接從土壤或其他基質中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲的方法，其特征在于步驟(3)所述PCR擴增反應使用的酶為TOYOBO公司的KOD FX酶。
3.根據權利要求2所述直接從土壤或其他基質中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲的方法，其特征在于步驟(3)所述PCR擴增的反應體系為25PL :DNA模板5 PL，2XPCR buffer.12. 5 PL，2mmol/L 的 dNTP 5 μ , 10 MmoI/L 的 SEQ ID NO: I 引物 0.75 μ , 10 MmoI/L 的SEQ ID NO:2引物0. 75 μ , KOD FX酶O. 5 μ ，用三蒸水補足體積；反應程序為94°C預變性2 min，98°C變性10 s，50°C退火30 s，68°C延伸I min，從變性到延伸進行35個循環，然后72°C再充分延伸5 min。
全文摘要
本發明公開了一種直接從土壤或其他基質中快速檢測鑒定香蕉穿孔線蟲的方法，是先提取待檢測樣品中的DNA，經過Promega公司的WizardDNAClean-upSystems試劑盒純化后作為模板，以SEQ ID NO:1～2所示序列為引物進行PCR擴增，如果能夠擴增出518bp的目的條帶，則證明待檢測樣品中含有香蕉穿孔線蟲。該方法適用于香蕉栽培土壤或其他基質的檢測，檢測結果準確，靈敏度高，適用范圍廣，應用前景廣闊。
文檔編號C12Q1/68GK102703582SQ20121007201
公開日2012年10月3日 申請日期2012年3月19日 優先權日2012年3月19日
發明者劉一帆, 徐春玲, 李冬麗, 李靜, 謝輝, 趙傳波 申請人:華南農業大學